肝豆靈片通過調(diào)控PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路改善肝豆?fàn)詈俗冃澡F死亡的機(jī)制

摘要：基于PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路，探討肝豆靈片對 TX 小鼠肝豆?fàn)詈俗冃澡F死亡的影響以及對 CuCl2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制。將 TX 小鼠分為對照組、模型組、肝豆靈片組、Fer-1組、谷胱甘肽組，HT22細(xì)胞分為對照組、模型組、肝豆靈片組、Fer-1組、肝豆靈片+Fer-1 組，采用 HE染色檢測各組小鼠海馬組織病理學(xué)改變，蛋白質(zhì)免疫印跡檢測各組小鼠海馬組織與HT22細(xì)胞中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5蛋白的表達(dá)，以及HT22細(xì)胞中SLC7A11、GPX4蛋白的表達(dá)，微量法檢測各組TX小鼠海馬組織中Fe2+的濃度，微板法檢測各組HT22細(xì)胞中SOD（超氧化物歧化酶）、MDA（丙二醛）、GSH-Px 水平，實(shí)時(shí)熒光定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測各組HT22細(xì)胞中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5 mRNA 的表達(dá)。結(jié)果表明：與對照組相比，模型組海馬組織出現(xiàn)明顯損傷，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5蛋白表達(dá)均明顯增高，SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)明顯下降，F(xiàn)e2+的濃度明顯升高（Plt;0.05）；與模型組相比，肝豆靈片組、Fer-1組和谷胱甘肽組海馬組織的病理損傷均得到改善，且肝豆靈片組效果明顯；肝豆靈片組和Fer-1組能抑制HT22細(xì)胞鐵死亡，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5蛋白與 mRNA 表達(dá)較模型組均明顯減少，MDA的濃度明顯降低（Plt;0.05），SOD活力及GSH-Px濃度明顯增加（Plt;0.05）。肝豆靈片能減輕 TX 小鼠海馬組織鐵死亡，抑制CuCl2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵死亡，其機(jī)制可能與下調(diào)PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路，減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肝豆靈片；肝豆?fàn)詈俗冃?；PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路；鐵死亡；機(jī)制

中圖分類號：R285"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號：1002-4026（2024）04-0034-11

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

The mechanism by which Gandouling tablets improve ferroptosis in

hepatolenticular degeneration through PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5

signaling pathway regulation

WU Bojin1，DONG Ting2*，WEN Yuya1，TIAN Liwei1，ZHAO Chenling1

（1. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230031， China;

2. Key Laboratory of Xin’An Medicine， Minisity of Education，Hefei 230038， China）

Abstract∶This study investigates the effects of Gandouling （GDL） tablets on ferroptosis in hepatolenticular degeneration in TX mice and their mechanism of action on the ferroptosis of HT22 cells induced by CuCl2， based on the PKCβII/ACSL4/ ALOX5 signaling pathway. TX mice were divided into five groups： control， model， GDL tablet， Fer-1， and Glutathione. HT22 cells were also divided into five groups： control， model， GDL tablet， Fer-1， and GDL tablet + Fer-1. Hematoxylin and eosin staining was used to detect the pathological changes in the hippocampus tissues of the mice. Western blotting was used to detect the expression of PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 in the hippocampus tissues and HT22 cells of the mice， as well as the expression of SLC7A11 and GPX4 in HT22 cells. The content of Fe2+ in the hippocampus tissues of the mice was detected via microassay. The levels of SOD， MDA， and GSH-Px in HT22 cells were detected by microplate assay. Finally， the expression of PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 mRNA in HT22 cells was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction. Compared with the control group， the hippocampus tissues of mice in the model group showed clear damage; the protein expression of PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 showed a clear increase; the protein expression of SLC7A11 and GPX4 decreased significantly; and Fe2+content increased significantly （Plt;0.05）. Compared with the model group， the pathological damage to hippocampus tissues showed improvements in the GDL tablet， Fer-1， and Glutathione group with the effects being noticeable in the GDL tablet group. It was possible to inhibit ferroptosis of HT22 cells in the GDL tablet and Fer-1 group and significantly lower their expression of PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 protein and mRNA in comparison to the model group（Plt;0.05）. The MDA contentalso decreased significantly （Plt;0.05） while the SOD activity and the GSH-Px content increased significantly（Plt;0.05）. Thus， GDL tablets can inhibit ferroptosis in hippocampus tissues of TX mice andinhibit ferroptosis induced by CuCl2 in HT22 cells. Moreover， the ferroptosis mechanism may be related to the down-regulation of the PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 signaling pathway and the attenuation of intracellular lipid peroxidation.

Key words∶Gandouling tablets;hepatolenticular degeneration; PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5 signaling pathway;ferroptosis; mechanism of action

肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD），又稱 Wilson ?。╓ilson Disease，WD）是一種由ATP7B突變導(dǎo)致的常染色體隱形遺傳病，以銅代謝障礙為主要特征。銅通過在大腦、肝腎、角膜等組織器官中異常沉積，導(dǎo)致相應(yīng)組織器官損害，相關(guān)研究表明HLD患者的腦銅濃度比對照組高10～15倍［1-2］。銅還可以誘導(dǎo)細(xì)胞中谷胱甘肽過氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4，GPX4）自噬降解來促進(jìn)鐵死亡［3］。鐵死亡是一種新型程序性細(xì)胞死亡，主要與鐵離子過載及脂質(zhì)過氧化相關(guān)［4］。大腦長期暴露于高濃度銅最終會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡［5］。同時(shí)，銅代謝障礙會導(dǎo)致血腦屏障功能障礙以及包括神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的其他腦組織受損，從而出現(xiàn)神經(jīng)癥狀［2，5］。PKCβⅡ是蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族中的一種，PKC包括PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ、PKCδ、PKCθ、PKCη，它們通過磷酸化絲氨酸、蘇氨酸殘基來控制下游蛋白質(zhì)的活性。PKC可以促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，增加的ROS進(jìn)一步放大PKC信號傳導(dǎo)［6］。最新研究表明，脂質(zhì)過氧化會激活PKCβII，其通過激活長鏈?；o酶A （CoA）合成酶4 （long-chain-fatty-acid-CoA ligase 4，ACSL4） 進(jìn)一步放大脂質(zhì)過氧化，構(gòu)成脂質(zhì)過氧化-PKCβII-ACSL4正反饋環(huán)，從而產(chǎn)生鐵死亡［7］。在大腦相關(guān)神經(jīng)元中，ACSL4與脂氧合酶 （ALOX） 家族對于鐵超載和多不飽和脂肪酸平衡障礙所引起的鐵死亡起關(guān)鍵作用［8］。研究表明，鐵死亡在HLD神經(jīng)變性的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療HLD神經(jīng)變性方面使用的藥物有銅螯合劑、腦細(xì)胞激活劑等，均可有效改善病人的病情，但存在療效不佳、副作用大等缺點(diǎn)，使其在臨床上的使用受到了制約［8-10］。

肝豆靈片（GDL，皖藥制字Z20050071）是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由雞血藤、姜黃、黃連、生大黃、丹參、莪術(shù)等中藥組成。方中重用黃連、姜黃，活血行氣、化痰燥濕，取“治痰先治氣，氣順痰自消”之意；丹參、莪術(shù)、雞血藤為臣，活血行血，祛瘀散結(jié)，活絡(luò)通經(jīng)以祛銅濁之邪外出；佐以大黃清熱通腑，利濕排銅。六味藥共奏行氣活血、祛瘀散結(jié)、利濕排銅之功［11］。研究表明，肝豆靈片可以顯著改善HLD神經(jīng)變性，但其作用機(jī)制尚待明確［11-12］。

低劑量Cu2+暴露會導(dǎo)致HT22細(xì)胞活力下降，凋亡增多，細(xì)胞內(nèi)氧化產(chǎn)物水平升高，且抗氧化能力降低，提示低劑量Cu2+暴露可引起神經(jīng)元損傷，而氧化還原水平紊亂可能是其主要機(jī)制［13］。課題組前期研究表明，槲皮素能夠通過調(diào)控Nrf2/NLRP3通路，降低CuCl2刺激的BV2細(xì)胞中炎癥水平，促進(jìn)細(xì)胞自噬［14］；肝豆靈片可通過調(diào)節(jié)p62/Nrf2信號通路減輕肝豆?fàn)詈俗冃孕∈竽Ｐ偷难趸瘧?yīng)激和自噬而減輕認(rèn)知功能障礙，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)、透射電鏡、HE染色可體現(xiàn)［15］；肝豆靈片可通過調(diào)節(jié) TLR4/NF-κB/NLRP3 信號通路減輕肝豆?fàn)詈俗冃陨窠?jīng)炎癥［16］。本研究從鐵死亡的角度出發(fā)，以PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路為基礎(chǔ)，探討了肝豆靈片對HLD神經(jīng)變性的保護(hù)作用，為后續(xù)關(guān)于HLD認(rèn)知障礙的相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞

所有小鼠飼養(yǎng)在安徽中醫(yī)藥大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動物中心，分別為10只6月齡SPF級DL雄鼠、50只6月齡SPF級TX雄鼠（品系號C3He-Atp7Btx-J/J）。動物房通風(fēng)良好，溫度適宜，相對濕度為45%～55%，各小鼠自由取水飲食。本動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號 AHUCM-mouse-2021011）。

HT22細(xì)胞（購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號cl-0481）。

1.2 藥物與試劑

肝豆靈片（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號Z20050071，規(guī)格0.3 g×150片）；谷胱甘肽片（重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號H20050667，規(guī)格0.1 g×36片）；完全培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，規(guī)格500 mL，貨號PM150210B）；胰蛋白酶-EDTA（上海賽默飛世爾科技有限公司，規(guī)格100 mL，貨號25300054）；RNA提取試劑盒（上海賽默飛世爾科技有限公司，批號AM1912）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（新貝（上海）生物科技有限公司，批號R202-02）；Fer-1（CSNpharm公司，批號347174-05-4）；亞鐵離子檢測試劑盒（Solarbio公司，批號BC5415）；增強(qiáng)型CCK8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0038）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物有限公司，批號A001-3-2、A003-1、A005-1-2）；兔抗β-actin（Affinity公司，AF7018，規(guī)格100 μL）；鼠抗PKCβⅡ（Immunoway公司，批號 YT3752，規(guī)格40 μL）；兔抗ACSL4（Proteintech公司，批號22401-1-AP，規(guī)格50 μL）；兔抗ALOX5（Affinity公司，批號AF4699，規(guī)格50 μL）；兔抗 SLC7A11（Proteintech公司，批號26864-1-AP，規(guī)格

50 μL）；鼠抗GPX4（Proteintech公司，批號67763-1-Ig，規(guī)格50 μL）。

1.3 主要儀器

CX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BioTekEpoch2型全波段酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；LightCycler 480II型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；5430R型高速冷凍離心機(jī) （德國Eppendorf公司）；VE180型免疫蛋白印跡系統(tǒng)（瑞士Tanon公司）。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 動物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 動物分組與處理

小鼠分為對照組、模型組、肝豆靈片組（GDL組）、Fer-1組和谷胱甘肽組（Glu組），各10只，其中對照組為10只DL雄鼠，其余各組為TX雄鼠。灌胃劑量按70 kg成人每日劑量的9.01倍進(jìn)行等效換算。通過計(jì)算，Glu組按0.18 g/（kg·d）灌胃；Fer-1組按0.001 g/（kg·d）灌胃；GDL組按1.16 g/（kg·d）灌胃［15］。對照組與模型組則是灌胃等劑量生理鹽水?？紤]小鼠耐受及生物利用度，其中Fer-1組灌胃1周，其余組灌胃6周。末次灌胃后禁食12 h，按照50 mg/kg劑量對小鼠進(jìn)行1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。取出小鼠海馬組織，10%中性福爾馬林進(jìn)行固定處理，或液氮處理并于-80 ℃冰箱保存。

2.1.2 觀察肝豆靈片對TX小鼠海馬區(qū)鐵死亡的影響實(shí)驗(yàn)

（1）HE 染色觀察TX小鼠海馬區(qū)病理學(xué)改變

小鼠取材后，將海馬組織用4 ℃冰箱預(yù)冷過的磷酸緩沖液（PBS）沖洗，之后用干凈濾紙吸干水分，再用組織固定液固定24 h。之后進(jìn)行梯度脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟染色、脫水封片等處理，通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

（2）微量法檢測各組TX小鼠海馬中Fe2+濃度。

冰浴超聲波破碎樣品后轉(zhuǎn)速10 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液置于冰上，其余按照試劑盒說明書步驟檢測吸光度并計(jì)算亞鐵離子濃度。

（3）PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5 信號通路觀測

通過免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路的蛋白表達(dá)情況：首先，取出各組小鼠海馬區(qū)樣本，加入裂解液，放于冰上裂解20 min，4 ℃離心15 min后吸取上清液，加入SDS-PAGE loading buffer，水浴加熱20 min。配制SDS-PAGE膠、快速電泳液、快速轉(zhuǎn)膜液，上樣后快速電泳30 min，快速轉(zhuǎn)膜40 min，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。為增強(qiáng)檢測效果，使用5%的牛血清白蛋白（BSA）對PVDF膜進(jìn)行浸泡處理，并在室溫下快速封閉液封閉30 min。隨后，加入一抗，

4 ℃搖床過夜。加入二抗室溫下孵育2 h，后進(jìn)行曝光顯影，β-actin作為內(nèi)參。目標(biāo)條帶的灰度值分析和計(jì)算通過ImageJ軟件進(jìn)行。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2.2 肝豆靈片含藥血清的制備與保存

選用20只SPF級SD大鼠，體重250 g左右，飼養(yǎng)于清潔動物房。隨機(jī)分為對照組與肝豆靈片組，其中對照組灌胃等量生理鹽水，肝豆靈片組按70 kg成年人每日劑量的6.25倍進(jìn)行換算，灌胃0.4 g/（kg·d）的肝豆靈片，連續(xù)灌胃5 d。末次灌胃后1 h，進(jìn)行1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈收集取血。之后4 ℃、4 000 r/min離心15 min，使用0.22 μm濾膜過濾除菌，并將濾出物放在-20 ℃的環(huán)境中儲存。

2.2.3 CCK8篩選HT22細(xì)胞的Cu2+最佳負(fù)荷濃度和最佳作用時(shí)間

調(diào)整96孔培養(yǎng)板

每100 μL培養(yǎng)液含有5.0×103個HT22細(xì)胞

，在37 ℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別使用100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400 μmol/L的Cu2+刺激HT22細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白組。每組包含3個復(fù)孔，孵育時(shí)間為12、24、36、48 h。之后，每孔加入CCK8 10 μL，并在2 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔的吸光值。在不同時(shí)間下，觀察不同濃度的銅離子對HT22細(xì)胞的影響，為后續(xù)HT22細(xì)胞的HLD造模篩選出最佳負(fù)荷濃度及最佳作用時(shí)間。

2.2.4 CCK8篩選肝豆靈片含藥血清最佳作用濃度與時(shí)間

調(diào)整96孔培養(yǎng)板每100 μL培養(yǎng)液含有5.0×103個HT22細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。加入最佳負(fù)荷濃度Cu2+刺激HT22細(xì)胞，并在加Cu2+的孔內(nèi)，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、20%、25%、30%、35%、40%的肝豆靈片含藥血清，繼續(xù)孵育12、24、36、48 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h。取出96孔板，放置于酶標(biāo)儀中，測定450 nm出吸光值，之后導(dǎo)出數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出HT22細(xì)胞的最佳肝豆靈含藥血清作用濃度與時(shí)間。

2.2.5 HT22細(xì)胞處理

HT22細(xì)胞被分為5組，分別為對照組、模型組、肝豆靈片組、Fer-1組和肝豆靈片+Fer-1組。其中對照組未做其他處理，細(xì)胞正常生長。模型組加入317.8 μmol/L的CuCl2溶液進(jìn)行HLD造模處理［13-14］。肝豆靈片組則加入317.8 μmol/L的CuCl2溶液及30%的肝豆靈片含藥血清共同處理。Fer-1組則是同時(shí)加入317.8 μmol/L的CuCl2溶液和鐵死亡抑制劑Fer-1。肝豆靈片+ Fer-1組同時(shí)加入肝豆靈片含藥血清、317.8 μmol/L的CuCl2以及鐵死亡抑制劑Fer-1。

2.2.6 PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路觀測

（1）通過Western blot 檢測各組細(xì)胞中PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路及鐵死亡相關(guān)蛋白PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5、GPX4、SLC7A11的表達(dá)情況。

將HT22細(xì)胞養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照2.2.5節(jié)中的方法進(jìn)行處理，同時(shí)按照2.1.2中步驟進(jìn)行Western blot，內(nèi)參為β-actin。目標(biāo)條帶的灰度值分析和計(jì)算通過ImageJ軟件進(jìn)行。

（2）RT-qPCR檢測細(xì)胞中PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)情況。

按照2.2.5節(jié)細(xì)胞處理，采用試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以上述反應(yīng)液作為熒光定量的模板，進(jìn)行擴(kuò)增。使用GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行擴(kuò)增。利用2-ΔΔCT計(jì)算相對表達(dá)量。引物由北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)，詳見表1。

（3）微板法檢測各組HT22細(xì)胞中SOD、MDA、GSH-Px 水平。

按照 2.2.5 項(xiàng)進(jìn)行細(xì)胞處理，在37 ℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在冰上研磨裂解后，3 000 r/min 15 min離心取上清液。其余步驟按照試劑盒說明書，檢測MDA、SOD、GSH-Px含量。

2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理

使用GraphPad Prism 9.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，兩組數(shù)據(jù)相較使用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)相較使用單因素方差分析（OnewayANOVA），以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）來表示所有數(shù)據(jù)，Plt;0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肝豆靈片對TX小鼠海馬區(qū)的影響

使用HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，在正常的小鼠海馬區(qū)中，未見顯著細(xì)胞死亡，其細(xì)胞的形態(tài)正常，未見神經(jīng)元固化、萎縮、顏色加深；與對照組相比，模型組小鼠的海馬區(qū)中出現(xiàn)顯著細(xì)胞壞死，固化、萎縮的神經(jīng)元數(shù)量明顯增多；肝豆靈片組、Fer-1組、谷胱甘肽組與模型組相比，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散，未見明顯神經(jīng)元固化、萎縮、顏色加深，顯示細(xì)胞壞死明顯減輕。見圖1。

3.2 肝豆靈片對TX小鼠海馬組織中Fe2+水平的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組Fe2+相對濃度（2.39±0.08）顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，肝豆靈片組、Fer-1組、谷胱甘肽組Fe2+濃度均有下降，其中肝豆靈片組 Fe2+相對濃度（1.65±0.07）明顯降低（P＜0.05）。相比于肝豆靈片組，谷胱甘肽組Fe2+的相對濃度為（1.25±0.05）下降最為明顯（P＜0.05），這可能與谷胱甘肽片具有消除體內(nèi)自由基、抗氧化作用相關(guān)。結(jié)果表明，肝豆靈片與Fer-1均可以降低組織中Fe2+濃度，進(jìn)一步佐證TX小鼠大腦海馬區(qū)中發(fā)生了鐵死亡，而肝豆靈片可改善鐵死亡，這與銅過量會導(dǎo)致GPX4自噬降解進(jìn)而促進(jìn)鐵死亡結(jié)果相一致［3］。見圖2。

3.3 免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測各組小鼠PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

在模型組TX小鼠海馬區(qū)中，與正常對照組相比，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），其中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白相對表達(dá)量分別為1.431±0.066、1.523±0.087、1.566±0.038；結(jié)合模型組Fe2+相對濃度顯著增加（P＜0.05），提示TX小鼠海馬區(qū)中存在鐵死亡，這與PKCβⅡ激活A(yù)CSL4，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化水平進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡一致［7］；而在肝豆靈片組、Fer-1組、谷胱甘肽組中，與模型組小鼠比較發(fā)現(xiàn)，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達(dá)水平均降低（Plt;0.05），其中肝豆靈片組中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白相對表達(dá)量下降，分別為1.272±0.070、1.124±0.058、1.131±0.049，表明肝豆靈片具有抑制PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路的作用。見圖 3。

3.4 CCK8法觀察Cu2+最佳負(fù)荷濃度和作用時(shí)間

與對照組比較，Cu2+在負(fù)荷12、24 h后，HT22細(xì)胞增殖抑制率在Cu2+濃度高于250 μmol/L后細(xì)胞增殖存活率降低。Cu2+在負(fù)荷36、48 h后，Cu2+濃度高于200 μmol/L時(shí)，HT22細(xì)胞增殖存活率顯著降低，并且以劑量依賴性方式抑制HT22細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，作用12、24 h時(shí)Cu2+對HT22細(xì)胞的抑制較穩(wěn)定，此時(shí)Cu2+對HT22細(xì)胞的IC50值分別為258.8、317.8 μmol/L。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇258.8 μmol/L、317.8 μmol/L，12、24 h作為HT22細(xì)胞的Cu2+最佳負(fù)荷濃度和時(shí)間繼續(xù)后期GDL含藥血清的藥物濃度篩選。見圖4。

3.5 CCK8法觀察肝豆靈片含藥血清最佳作用濃度和作用時(shí)間

數(shù)據(jù)結(jié)果表明，15%肝豆靈片含藥血清組在12、24、36、48 h作用時(shí)間內(nèi)細(xì)胞存活率并沒有明顯變化；而30%肝豆靈片含藥血清組在12、24 h后細(xì)胞存活率有所提升，尤其是24 h后提升顯著，為92.643±2.652，但在36、48 h細(xì)胞存活率下降；20%肝豆靈片含藥血清組在 12、24、36 h后細(xì)胞活性值沒有明顯的變化；35%肝豆靈片含藥血清組在12、36、48 h的存活率降低；40% 肝豆靈片含藥血清組在12、36、48 h細(xì)胞存活率有所下降。綜上，本研究選用體積分?jǐn)?shù)30%肝豆靈片含藥血清與24 h作為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的最佳濃度及最佳作用時(shí)間。見圖5。

3.6 肝豆靈片對HT22細(xì)胞PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western Blot法檢測HT22細(xì)胞中通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。如圖6所示，與對照組比較，在模型組中，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達(dá)水平均不同程度升高（Plt;0.05）；而與模型組相比，肝豆靈片組、Fer-1組中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（Plt;0.05）；與肝豆靈片組相比，肝豆靈片+Fer-1組中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5蛋白下降明顯（Plt;0.05）。

3.7 肝豆靈片對HT22細(xì)胞鐵死亡的影響

Western Blot法檢測HT22細(xì)胞SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對照組比較，模型組細(xì)胞中SLC7A11、GPX4表達(dá)水平明顯下降（Plt;0.05），這與銅過量會導(dǎo)致GPX4自噬降解進(jìn)而促進(jìn)鐵死亡結(jié)果一致［3］；與模型組比較，肝豆靈片組、Fer-1組細(xì)胞中SLC7A11、GPX4表達(dá)水平顯著提高（Plt;0.05），F(xiàn)er-1組中SLC7A11提升明顯（Plt;0.05）。這表明CuCl2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中存在鐵死亡，肝豆靈片可以抑制HT22細(xì)胞中的鐵死亡。見圖7。

3.8 肝豆靈片對HT22細(xì)胞PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測HT22細(xì)胞PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5mRNA表達(dá)結(jié)果：與對照組比較，模型組PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5 mRNA表達(dá)顯著升高（Plt;0.05）；而與模型組比較，肝豆靈片組和Fer-1組PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5 mRNA表達(dá)均下降（Plt;0.05）。顯示肝豆靈片可以降低PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5 mRNA的表達(dá)。見圖8。

3.9 肝豆靈對HT22細(xì)胞中SOD、MDA、GSH-Px水平的影響。

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組中MDA濃度顯著增加（P＜0.05），SOD活力及GSH-Px濃度明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，肝豆靈片組MDA濃度下降，SOD活力與GSH-Px濃度明顯升高（P＜0.05）。相比于肝豆靈片組，F(xiàn)er-1+肝豆靈片組MDA的下降、SOD活力的提升及GSH-Px濃度的增加最為明顯。見圖9。

4 討論

肝豆靈片具有清熱解毒、祛瘀散結(jié)、利膽排銅的功效，能夠祛濕熱、疏通瘀血，從而達(dá)到治療的目的。方中黃連具有清熱燥濕清火去毒的功用，小檗堿是其主要藥效物質(zhì)，其抗炎作用顯著，目前研究表明，小檗堿可通過調(diào)控Nrf2-HO-1/GPX4信號途徑抑制鐵死亡，從而產(chǎn)生抗炎作用［17］；姜黃能破血活血，行氣止痛，其有效成份為姜黃素及揮發(fā)油，目前研究結(jié)果表明，姜黃素通過促進(jìn)銅排泄和抑制鐵死亡從而產(chǎn)生對HLD的保護(hù)作用［9］；丹參有活血祛瘀養(yǎng)血安神之效；莪術(shù)具有行氣破血消積止痛之用；雞血藤可活血舒筋養(yǎng)血調(diào)經(jīng)；大黃則有瀉火解毒清熱化瘀的功用；有研究顯示，甘草含藥血清可以通過Nrf2/HO-1通路抑制鐵死亡，改善細(xì)胞炎癥［18］。

研究表明，鐵死亡與HLD神經(jīng)變性相關(guān)，大腦長期暴露于高濃度銅最終會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞鐵死亡，并促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而加重HLD神經(jīng)變性。銅可以促進(jìn)GPX4自噬降解進(jìn)而影響脂質(zhì)過氧化水平，從而導(dǎo)致鐵死亡［3］。PKCβⅡ是蛋白激酶C（PKC）家族中的一種，它在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用，比如細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)［6］。脂質(zhì)過氧化激活PKCβⅡ，PKCβⅡ磷酸化并激活A(yù)CSL4，進(jìn)一步放大脂質(zhì)過氧化水平，從而促進(jìn)鐵死亡［7］。MDA是脂質(zhì)過氧化的一種代表產(chǎn)物，會引起細(xì)胞代謝與功能的障礙，促進(jìn)細(xì)胞死亡。而SOD、GSH-Px作為抗氧化酶可以防止ROS對組織、細(xì)胞造成損傷。細(xì)胞內(nèi)的 GSH-Px4 通過利用谷胱甘肽將脂質(zhì)過氧化氫物轉(zhuǎn)化為脂醇，并降低ROS的形成與累積。ACSL4能夠通過促進(jìn)花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）轉(zhuǎn)化成多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物致死性積累，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路參與了肝豆?fàn)詈俗冃灾需F死亡的發(fā)生與發(fā)展。當(dāng)PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路被激活，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化形成，導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。在CuCl2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞HLD模型中，MDA濃度明顯增加，SOD、GSH-Px濃度顯著減少，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達(dá)水平明顯上升，而SLC7A11、GPX4蛋白水平顯著下調(diào)，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的mRNA水平明顯上升，提示CuCl2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞HLD模型中存在鐵死亡。經(jīng)肝豆靈片干預(yù)后，SOD、GSH-Px濃度增多，MDA濃度減少，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，而SLC7A11、GPX4蛋白水平顯著上調(diào)，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的mRNA水平顯著下調(diào)。在TX小鼠海馬組織中，模型組中Fe2+濃度明顯上升，HE染色中模型組海馬組織細(xì)胞固化萎縮，細(xì)胞壞死明顯增多，模型組中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，經(jīng)肝豆靈片干預(yù)后，各組Fe2+濃度減少，細(xì)胞壞死減少，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明肝豆靈片能夠通過抑制PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路降低脂質(zhì)過氧化水平，抑制鐵死亡的發(fā)生。課題組前期在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證肝豆靈片對HLD的治療作用，并探究了Nrf2信號通路對小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激及鐵死亡的影響［14］，肝豆靈片可明顯改善TX小鼠認(rèn)知功能［15］，同時(shí)肝豆靈片通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路減輕HLD神經(jīng)炎癥［16］。

綜上所述，本研究旨在探討HT22細(xì)胞HLD模型中，存在鐵死亡的發(fā)生，肝豆靈片作為肝豆?fàn)詈俗冃耘R床用藥，可以通過調(diào)控PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路改善CuCl2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中的鐵死亡，其機(jī)制可能與抑制PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5通路降低脂質(zhì)過氧化水平進(jìn)而抑制鐵死亡有關(guān)；同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步佐證了TX小鼠大腦海馬中存在鐵死亡，肝豆靈片通過調(diào)控PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路可以改善神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡。本項(xiàng)研究為肝豆靈片治療HLD神經(jīng)變性提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對中醫(yī)藥治療HLD具有現(xiàn)實(shí)意義，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究，比如中醫(yī)藥對于不同證型HLD的治療作用以及作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

［1］錢南南， 楊文明， 魏濤華， 等. 肝豆?fàn)詈俗冃苑咀杞j(luò)病因病機(jī)探要［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2022， 28（12）： 133-140. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221291.

［2］CZONKOWSKA A， LITWIN T， DUSEK P， et al. Wilson disease［J］. Nature Reviews Disease Primers， 2018， 4（1）： 21. DOI： 10.1038/s41572-018-0018-3.

［3］XUE Q， YAN D， CHEN X， et al. Copper-dependent autophagic degradation of GPX4 drives ferroptosis［J］. Autophagy， 2023， 19（7）： 1982-1996. DOI： 10.1080/15548627.2023.2165323.

［4］QIU Y M， CAO Y， CAO W J， et al. The application of ferroptosis in diseases［J］. Pharmacological Research， 2020， 159： 104919. DOI： 10.1016/j.phrs.2020.104919.

［5］RYAN S K， ZELIC M， HAN Y N， et al. Microglia ferroptosis is regulated by SEC24B and contributes to neurodegeneration［J］. Nature Neuroscience， 2023， 26（1）： 12-26. DOI： 10.1038/s41593-022-01221-3.

［6］LEE H B， YU M R， SONG J S， et al. Reactive oxygen species amplify protein kinase C signaling in high glucose-induced fibronectin expression by human peritoneal mesothelialcells［J］. Kidney International， 2004， 65（4）： 1170-1179. DOI： 10.1111/j.1523-1755.2004.00491.x.

［7］ZHANG H L， HU B X， LI Z L， et al. PKCβII phosphorylates ACSL4 to amplify lipid peroxidation to induce ferroptosis［J］. Nature Cell Biology， 2022， 24（1）： 88-98. DOI： 10.1038/s41556-021-00818-3.

［8］SUN X， ZHANG X Y， YAN H， et al. Protective effect of curcumin on hepatolenticular degeneration through copper excretion and inhibition of ferroptosis［J］. Phytomedicine： International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology， 2023， 113： 154539. DOI： 10.1016/j.phymed.2022.154539.

［9］BOUCHAOUI H， MAHONEY-SANCHEZ L， GARON G， et al. ACSL4 and the lipoxygenases 15/15B are pivotal for ferroptosis induced by iron and PUFA dyshomeostasis in dopaminergic neurons［J］. Free Radical Biology amp; Medicine， 2023， 195： 145-157. DOI： 10.1016/j.freeradbiomed.2022.12.086.

［10］WEISS K H， ASKARI F K， CZLONKOWSKA A， et al. Bis-choline tetrathiomolybdatein patients with Wilson’s disease： an open-label， multicentre， phase 2 study［J］. The Lancet Gastroenterology amp;Hepatology， 2017， 2（12）： 869-876. DOI： 10.1016/S2468-1253（17）30293-5.

［11］張玉婷， 李立華， 陳浩. 新安特色制劑肝豆靈片治療肝豆?fàn)詈俗冃缘难芯窟M(jìn)展［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2022， 28（23）： 97-102. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20222396.

［12］王艷昕， 鮑遠(yuǎn)程， 孫敏， 等. 肝豆靈干預(yù)銅負(fù)荷大鼠認(rèn)知障礙及海馬細(xì)胞凋亡的研究［J］. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 2015， 31（23）： 2333-2336. DOI： 10.13699/j.cnki.1001-6821.2015.23.018.

［13］姜琨彥， 王建鈺， 王濤， 等. 低劑量銅暴露對HT22神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的誘導(dǎo)作用［J］. 空軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 43（7）： 679-684. DOI： 10.13276/j.issn.2097-1656.2022.06.004.

［14］江張勝， 董婷， 唐露露， 等. 槲皮素對CuCl2誘導(dǎo)的小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥的保護(hù)機(jī)制研究［J］. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐， 2022， 36（6）： 29-33. DOI： 10.13728/j.1673-6427.2022.06.006.

［15］JIANG Z S， DONG T， WANG Y， et al. Gandouling alleviates cognitive dysfunction by regulates the p62/Nrf2 signaling pathway to reduce oxidative stress and autophagy in mice models of Wilson’s disease［J］. Arabian Journal of Chemistry， 2023， 16（2）： 104477. DOI： 10.1016/j.arabjc.2022.104477.

［16］聞雨雅， 董婷， 江張勝， 等. 肝豆靈片通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-KB/NLRP3信號通路減輕肝豆?fàn)詈俗冃陨窠?jīng)炎癥的機(jī)制［J］. 山東科學(xué)， 2023， 36（4）： 42-51. DOI： 10.3976/j.issn.1002-4026.2023.04.006.

［17］黃慶洋， 紀(jì)東東， 田繡云， 等. 小檗堿通過激活Nrf2-HO-1/GPX4通路抑制小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的鐵死亡［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 42（6）： 937-943. DOI： 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.06.19.

［18］孔金融， 施高翔， 侯靜， 等. 基于Nrf2/HO-1通路抑制鐵死亡探究甘草含藥血清對LPS誘導(dǎo)的Caco2細(xì)胞炎癥的影響［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2023， 29（16）： 144-153. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230601.