工業(yè)循環(huán)冷卻水中異養(yǎng)菌檢測方法的影響因素分析

摘" 要：為更準(zhǔn)確地測定循環(huán)冷卻水中異養(yǎng)菌的含量，有效地控制工業(yè)循環(huán)冷卻水中微生物的生長與繁殖，該課題進(jìn)行工業(yè)循環(huán)冷卻水異養(yǎng)菌的工藝影響因素的研究。通過分析培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基pH對菌落計(jì)數(shù)的影響，確定最佳的培養(yǎng)細(xì)菌因素工藝參數(shù)，并通過對比工業(yè)循環(huán)冷卻水中的細(xì)菌總數(shù)和黏泥中的細(xì)菌總數(shù)，確定控制工業(yè)循環(huán)冷卻水的細(xì)菌總數(shù)最佳方案。

關(guān)鍵詞：工業(yè)循環(huán)冷卻水；異養(yǎng)菌；稀釋度；pH；細(xì)菌總數(shù)

中圖分類號：TQ085" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號：2095-2945（2023）16-0066-05

Abstract： In order to more accurately determine the content of heterotrophic bacteria in circulating cooling water and effectively control the growth and reproduction of microorganisms in industrial circulating cooling water， the technological factors affecting heterotrophic bacteria in industrial circulating water were studied. By analyzing the effects of culture temperature， culture time and culture pH on colony count， the best process parameters of cultivating bacteria were determined， and the best scheme to control the total number of bacteria in industrial circulating cooling water was determined by comparing the total number of bacteria in industrial circulating cooling water and the total number of bacteria in slime.

Keywords： industrial circulating cooling water; heterotrophic bacteria; dilution; pH; total number of bacteria

在工業(yè)循環(huán)冷卻水中，異養(yǎng)菌不僅生長繁殖最快，而且為數(shù)比較多。這類菌群能產(chǎn)生致密的黏液，黏附水中細(xì)小的懸浮物和其他絲狀菌、霉菌、藻類及原生動物，從而形成黏泥。工業(yè)循環(huán)水在運(yùn)行的過程中會投加相應(yīng)的緩蝕阻垢劑，目前緩蝕阻垢劑的成分大部分以有機(jī)磷為主。磷為微生物的成長提供了能源，如在不加殺菌劑的情況下容易導(dǎo)致循環(huán)冷卻水中異養(yǎng)菌的大量繁殖。異養(yǎng)菌的大量繁殖，必然導(dǎo)致黏泥增多。異養(yǎng)菌及生物黏泥的增多，為鐵細(xì)菌、硫細(xì)菌、硫酸鹽還原菌的生長提供了良好的環(huán)境，促進(jìn)了其生長，進(jìn)而加劇了黏泥的生長。

而工業(yè)循環(huán)冷卻水系統(tǒng)運(yùn)行多年后，黏泥容易附著在管壁上，一方面影響換熱器的換熱效率，影響生產(chǎn)。另一方面，異養(yǎng)菌形成的黏泥含有酸性的代謝產(chǎn)物，比如硫細(xì)菌能氧化硫化氫生成硫酸，產(chǎn)生強(qiáng)酸，硫酸鹽還原菌的代謝產(chǎn)物為H2S，也為酸性物質(zhì)，容易引起管道發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，從而引起垢下腐蝕的作用。鐵細(xì)菌吸收水中亞鐵鹽，促使管路中鐵質(zhì)更多地溶于水中，從而加速了管道的腐蝕。因此，工業(yè)循環(huán)冷卻水中異養(yǎng)菌的測定是非常重要的。目前異養(yǎng)菌的檢測方法包括：TTC營養(yǎng)瓊脂法、快速熒光法、膜過濾法等，但是由于其成本比較高，沒有普遍運(yùn)用，而目前國內(nèi)工業(yè)循環(huán)冷卻水系統(tǒng)中異養(yǎng)菌的檢測方法通常是采用平皿計(jì)數(shù)法。本文主要研究影響工業(yè)循環(huán)冷卻水異養(yǎng)菌檢測方法的影響因素，并且通過進(jìn)一步優(yōu)化檢測條件，更準(zhǔn)確地測定循環(huán)冷卻水中異養(yǎng)菌的含量，對有效地控制工業(yè)循環(huán)冷卻水中的微生物的生長與繁殖具有重要的意義。

1" 實(shí)驗(yàn)方法

1.1" 基本步驟

用滅菌過的研缽加入無菌石英砂充分研磨，用25號浮游生物網(wǎng)收集循環(huán)冷卻水的黏泥，定容到無菌的1 000 mL容量瓶中，用5 mL無菌吸管吸取5 mL水樣注入到45 mL生理鹽水中，充分搖均，得到稀釋度為10-1，以此類推，得到10-2、10-3。

接種培養(yǎng)：接種不同稀釋度的水樣到培養(yǎng)皿中，每皿接種1 mL，每個稀釋度接種3皿，空白實(shí)驗(yàn)1組接種生理鹽水。然后灌入冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基，充分混均。待冷卻后于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)方案按照表1執(zhí)行。

1.2" 循環(huán)冷卻水中細(xì)菌總數(shù)與黏泥中細(xì)菌總數(shù)的對比

1）分別采集某A、B、C循環(huán)水廠的循環(huán)冷卻水，用5 mL無菌吸管吸取5 mL水樣注入到45 mL生理鹽水中，充分搖均，得到稀釋度為10-1，以此類推，得到10-2、10-3。然后接種和培養(yǎng)過程同1.1一樣。

2）用25號浮游生物網(wǎng)分別收集循環(huán)冷卻水A、B、C廠的黏泥，用滅菌過的研缽加入無菌石英砂充分研磨黏泥，定容到無菌的1 000 mL容量瓶中用5 mL無菌吸管吸取5 mL水樣注入到45 mL生理鹽水中，充分搖均，得到稀釋度為10-1，以此類推，得到10-2、10-3。接種培養(yǎng)的方法同1.1的方法。

2" 結(jié)果與討論

2.1" 培養(yǎng)基pH對細(xì)菌總數(shù)的影響

以培養(yǎng)基pH為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)為縱坐標(biāo)，得到不同pH影響細(xì)菌總數(shù)的曲線圖，如圖1所示。

由圖1可以看出，黏泥中的細(xì)菌總數(shù)隨著培養(yǎng)基的pH增大先上升后下降，pH為7時(shí)培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)最多。充分看出循環(huán)冷卻水中的大部分異養(yǎng)菌的pH控制在7左右的條件下生長和繁殖比較旺盛，pH過低或過高都不利于工業(yè)循環(huán)冷卻水中異養(yǎng)菌的生長和繁殖。

2.2" 培養(yǎng)溫度的影響

以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)為縱坐標(biāo)，得不同培養(yǎng)溫度對細(xì)菌總數(shù)影響的曲線圖，如圖2所示。

由圖2可知，不同的培養(yǎng)溫度對黏泥菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果有較大的影響。細(xì)菌總數(shù)隨著培養(yǎng)溫度的增高先上升后下降，培養(yǎng)溫度在30～40 ℃時(shí)細(xì)菌總數(shù)最多，50～60 ℃時(shí)細(xì)菌總數(shù)下降很明顯，這是因?yàn)樵诿改艹惺艿臏囟确秶畠?nèi)，一般生物酶的最大活性溫度為35～40 ℃。溫度太高會導(dǎo)致細(xì)菌中酶的活性和酶的形成，可使細(xì)菌的細(xì)胞損傷或致死。因此培養(yǎng)溫度選擇在30～40 ℃較適宜。

2.3" 培養(yǎng)時(shí)間的影響

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)為縱坐標(biāo)，得到不同培養(yǎng)時(shí)間對細(xì)菌總數(shù)影響的曲線圖，如圖3所示。

綜合各項(xiàng)因素由圖3可知，通過實(shí)驗(yàn)表明，不同的培養(yǎng)時(shí)間對菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果有一定的影響。培養(yǎng)1 d和培養(yǎng)2 d的黏泥菌落總數(shù)結(jié)果有較明顯的差異，培養(yǎng)3 d后黏泥菌落總數(shù)繼續(xù)稍有增多。第4、第5天后基本和第3天成一個平臺，黏泥細(xì)菌總數(shù)基本穩(wěn)定不變。且經(jīng)過培養(yǎng)1 d后，黏泥菌落形態(tài)很小，不易辨認(rèn)，容易漏掉，培養(yǎng)2 d后，菌落變大，也容易辨認(rèn)。因此對于黏泥菌落總數(shù)的培養(yǎng)時(shí)間盡可能選擇培養(yǎng)3 d，這樣可確保菌落數(shù)的準(zhǔn)確性，有利于反映循環(huán)冷卻水中菌落總數(shù)的水平。

2.4" 循環(huán)冷卻水中細(xì)菌總數(shù)與黏泥中細(xì)菌總數(shù)的對比

由表2可知，工業(yè)循環(huán)冷卻水中黏泥中的細(xì)菌總數(shù)比循環(huán)冷卻水中的細(xì)菌總數(shù)要多得多。

2.5" 生理鹽水用量對異養(yǎng)菌數(shù)量的影響

2.5.1" 精密度實(shí)驗(yàn)

在本試驗(yàn)的培養(yǎng)基中得到了5份供試品溶液，并在不同的溫度和pH環(huán)境下進(jìn)行測量，對5個培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)平皿計(jì)數(shù)正確度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）及均值進(jìn)行了計(jì)算（表3），說明其精密度達(dá)標(biāo)。

2.5.2" 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

反復(fù)5次對培養(yǎng)基進(jìn)行測量，確定標(biāo)準(zhǔn)平皿計(jì)數(shù)正確度，RSD為0.9%（表4），重復(fù)性優(yōu)良。

2.5.3" 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

把收集來的黏泥各自靜置1、2、4、8、12和24 h后用來測定，并記錄標(biāo)準(zhǔn)平皿計(jì)數(shù)正確度值，結(jié)果見表5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最后得出RSD為1.3%，所得結(jié)果表明穩(wěn)定性情況優(yōu)良。

2.5.4" 單因素實(shí)驗(yàn)

1）生理鹽水的影響。稱取黏泥5 mL，之后把40倍量的生理鹽水加入其中并回流培養(yǎng)1 h，培養(yǎng)2次，選取95%、70%、55%和40%的生理鹽水分析其對異養(yǎng)菌數(shù)量的影響，通過整理后得到表6的數(shù)據(jù)。

2）生理鹽水量的影響。從表6可以看出，呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)：養(yǎng)菌數(shù)量和生理鹽水從最初的95%一直下降到70%，當(dāng)生理鹽水的濃度下降時(shí)，數(shù)量就會相應(yīng)地提升。而如果最初生理鹽水的濃度為70%，一直到40%這一范圍，又說明其與數(shù)量之間為正相關(guān)的關(guān)系。隨著生理鹽水濃度的下降，數(shù)量也會下降。

最后得出，生理鹽水溶液濃度為70%的時(shí)候就處于數(shù)量的峰值，數(shù)量為11.62%

將處理好的樣水分為5份且各稱取5 ml，各自放進(jìn)去倍量是20、40、60、80和100的生理鹽水，采用平皿培養(yǎng)法培養(yǎng)2次，總計(jì)1 h。用70%的生理鹽水來分析其對異養(yǎng)菌數(shù)量的影響，通過整理后得到表7的數(shù)據(jù)。

從表7可以看出，使用70%的生理鹽水遇到不同倍數(shù)后發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)菌數(shù)量也會不一樣。如果是正相關(guān)時(shí)，倍量與數(shù)量處于20～60的倍量之間，會因?yàn)楸读康奶嵘龜?shù)量也會升高；具有明顯負(fù)相關(guān)時(shí)，會在60～100的倍量范圍內(nèi)，會因?yàn)楸读康脑黾佣箶?shù)量下降。

最后表明，倍量在60并且生理鹽水是70%濃度的生理鹽水時(shí)，數(shù)量達(dá)峰值為11.64%。

3）培養(yǎng)時(shí)間的影響。為了研究培養(yǎng)時(shí)間對異養(yǎng)菌數(shù)量的影響，本研究選取5 mL樣水，并在其中加入70%濃度的生理鹽水、60的倍量，各自進(jìn)行30、60、120、180和240 min的回流法培養(yǎng)2次，然后觀察數(shù)量和時(shí)間的關(guān)系，最后所得見表8。

從表8可以看出，當(dāng)數(shù)量增加時(shí)，回流時(shí)間是在30 ～180 min，并且依然是70%的生理鹽水濃度、60的倍量。但當(dāng)異養(yǎng)菌數(shù)量降低時(shí)則處于240 min。

綜上所得，數(shù)量最高時(shí)的條件是180 min、生理鹽水的濃度為70%，倍量為60倍，最佳數(shù)量是11.63%。

4）培養(yǎng)次數(shù)的影響。取經(jīng)過處理的樣水5 mL并在其中加入70%濃度的生理鹽水、60的倍量且回流時(shí)間為180 min，對培養(yǎng)次數(shù)帶來的影響進(jìn)行了分析，總共培養(yǎng)了5次，培養(yǎng)的結(jié)果詳見表9所示的數(shù)據(jù)。

從表9可知，相同的條件下異養(yǎng)菌數(shù)量和次數(shù)有著相關(guān)性：正相關(guān)時(shí)的次數(shù)為1～2次，隨著次數(shù)的增高數(shù)量也隨之增高；呈負(fù)相關(guān)時(shí)的次數(shù)為2～5次，增長量會因?yàn)榇螖?shù)的增高而降低。

由此可知，在以上條件相同時(shí)，且培養(yǎng)次數(shù)是2次時(shí)數(shù)量達(dá)到最高，為11.67%。

2.5.5" 正交實(shí)驗(yàn)法

在做完上述實(shí)驗(yàn)后，開始正交實(shí)驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)為1組，共為9組，算出平均值。設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。各因素如上實(shí)驗(yàn)。最后得出最好的培養(yǎng)條件再進(jìn)行驗(yàn)證，最終見表10—表12。

由表10和表11可知，數(shù)量最高是12.295%，而條件為：培養(yǎng)次數(shù)為2次，培養(yǎng)時(shí)間為180 min，70%濃度的生理鹽水溶液。

然后根據(jù)表11正交實(shí)驗(yàn)表得出的結(jié)論如下，R極差值中，最大的是B，為23.257；最小的是D，為0.077；僅次于B的是C，為8.564；僅次于C的是A，為4.253，換言之：Bgt;Cgt;Agt;D。從數(shù)量來說影響最大的是生理鹽水量（B），之后才是培養(yǎng)時(shí)間、生理鹽水和培養(yǎng)次數(shù)。最終由表12的結(jié)果可知，計(jì)算出的數(shù)值可信度高，具有明顯顯著度。

為了確保菌落生長與科學(xué)計(jì)數(shù)，在本項(xiàng)目中，還采用了PCA-TTC顯色法對水中的異養(yǎng)菌數(shù)量進(jìn)行了測定。利用標(biāo)準(zhǔn)平皿計(jì)數(shù)法，采用平板技術(shù)培養(yǎng)基來替代傳統(tǒng)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，再在平板技術(shù)培養(yǎng)基中加入TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑），使得菌落成為紅色，借助正交實(shí)驗(yàn)顯色與計(jì)算結(jié)果，確定TTC在平板計(jì)算培養(yǎng)基中的最適合濃度，培養(yǎng)72 h后得出結(jié)果。結(jié)果說明：循環(huán)冷卻水中的水樣測定，相較于標(biāo)準(zhǔn)的NA平皿計(jì)數(shù)法，在卡方檢驗(yàn)后，得到P＞0.05，2種方法雖然沒有差異，但是本研究的檢出率更高，且容易辨別，能促進(jìn)受損細(xì)菌的恢復(fù)，將顆粒物與氣泡干擾有效地降低。

3" 結(jié)論

本論文研究了工業(yè)循環(huán)冷卻水中異養(yǎng)菌測定主要的影響因素，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了其最佳檢測條件。并且分別對比了循環(huán)冷卻水中的細(xì)菌總數(shù)與黏泥中的細(xì)菌總數(shù)，得到的主要結(jié)論如下。

1）在培養(yǎng)基的pH為7、培養(yǎng)溫度在30～40 ℃，連續(xù)培養(yǎng)3 d后，得到的菌落數(shù)比較準(zhǔn)確。

2）工業(yè)循環(huán)冷卻水中細(xì)菌總數(shù)的測定一般是測定黏泥中的細(xì)菌總數(shù)，通過控制黏泥的細(xì)菌總數(shù)來判斷工業(yè)循環(huán)冷卻水中異養(yǎng)菌是否超標(biāo)。這樣有利于指導(dǎo)系統(tǒng)殺菌劑的投加，規(guī)范工業(yè)循環(huán)的管理，確保循環(huán)冷卻水中微生物達(dá)標(biāo)，降低微生物對管道的腐蝕。

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