一種具抗氧化功效的林蛙皮多肽及其提取工藝

摘" 要：具有抗氧化能力的小分子活性肽已成為研究熱點，由于大多數(shù)蛙皮提取存在工藝處理時間久且成本高的問題，很難將其生產(chǎn)擴大到工業(yè)水平。該研究結(jié)合化學(xué)及與蛋白酶的反應(yīng)，針對林蛙皮進(jìn)行多肽的處理及提取。結(jié)果表明，借由化學(xué)反應(yīng)后的林蛙皮提取物，只要再經(jīng)過1 h的酶反應(yīng)，即能達(dá)到優(yōu)化的多肽提取物，此類多肽提取物對于DPPH、ABTS及NO等自由基具有非常好的去除率，并且在鐵還原力上，多肽提取物也比未經(jīng)過蛋白酶處理的林蛙皮提取物更佳。在細(xì)胞層面上，多肽提取物除了不具有細(xì)胞毒性，對于活性氧也能有效清除。此外，其亦能吸收較短波長的紫外線，對于作為未來皮膚保護(hù)用途的醫(yī)療成分，具有一定的潛能。

關(guān)鍵詞：抗氧化;林蛙皮;多肽;自由基;活性氧

中圖分類號：Q599 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-2945（2023）18-0044-05

Abstract： Small active peptides with antioxidant capacity have become a research hotspot. Because of the long processing time and high cost for obtaining frog skin extracts， it is difficult to expand their production in industry. Combination of chemical and protease treatment was performed to achieve peptides from Rana skin. The results show that the optimized peptides can be obtained only after 1 hour of enzymatic treatment from the Rana skin extract with chemical treatment. The polypeptides had a very good removal rate for free radicals such as DPPH， ABTS and NO. In terms of iron reducing ability， polypeptides were also better than Rana skin extracts that had not been treated with proteases. At the cellular level， the polypeptides without cytotoxicity can also effectively remove reactive oxygen species. In addition， it can also absorb ultraviolet radiation with short wavelengths， and has a potential as a medical ingredient for future skin protection.

Keywords： antioxidation; Rana skin; polypeptide; free radical; reactive oxygen species

過度暴露于紫外線輻射會對人類健康產(chǎn)生重大有害影響。紫外線可導(dǎo)致皮膚發(fā)生顯著變化，包括曬傷、皺紋、免疫力下降、衰老和癌癥等，并且能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞中活性氧（Reactive oxygen species， ROS）的積累和DNA損傷，進(jìn)而激活負(fù)責(zé)細(xì)胞因子釋放的核因子κB（NF-κB）信號通路[1-2]。過多的活性氧會參與氧化應(yīng)激的病理過程，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)展。兩棲類動物因紫外線輻射、病原體、捕食者和惡劣的棲息地等不同因素，進(jìn)化出一種復(fù)雜的化學(xué)皮膚防御系統(tǒng)，其防御系統(tǒng)除了抗氧化酶和低分子量抗氧化劑之外，抗氧化肽也被認(rèn)為具有清除自由基、防止皮膚損傷的作用[3]。然而，目前對于不同品種蛙皮中藥理成分的認(rèn)識仍然有限，以蛙皮為特征的藥理化合物必將有利于未來的藥物開發(fā)。過去研究中發(fā)現(xiàn)熱帶蛙分離出的抗氧化肽（antioxidin-I）具有潛在的抗氧化活性。從云南臭蛙、大綠臭蛙及花臭蛙中發(fā)現(xiàn)的多肽，能有效防止紫外線UVB誘導(dǎo)的光損傷[4-5]。

多肽的產(chǎn)生可利用化學(xué)或酵素方法水解蛋白質(zhì)獲得，借由各種水解蛋白酶水解蛙皮產(chǎn)生的多肽，也具有不同的生物活性，常使用的水解蛋白酶包含有糜蛋白酶（α-chymotrypsin）、木瓜蛋白酶（Papain）、胃蛋白酶（Pepsin）及胰蛋白酶（Trypsin）等。利用酸和胃蛋白酶水解獲得的多肽混合物（ARP和ERP）對HaCaT角質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的增殖和抗凋亡作用。在相同濃度下，酵素水解比化學(xué)水解具有更大的生物活性。分子量和氨基酸組成的差異可以解釋ARP和ERP之間生物活性的差異。這些多肽可借由表皮生長因子（EGF）通過幾種下游途徑（AKT、ERK、STAT3和JNK）調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和增殖。此外，也可通過細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)的減少，達(dá)到抗凋亡作用[6-7]。

1" 儀器與材料

1.1" 儀器

M11研磨機，R300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，F(xiàn)DU-1200冷凍干燥機，Hettich MIKRO220R離心機，MD i3x酶標(biāo)儀，UV-1800分光光度計。

1.2" 材料

林蛙皮，購自淘寶北國雪珍旗艦店。

1.3" 試劑

DPPH（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），ABTS（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid））總抗氧化能力檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)RAP（Ferric reducing ability of plasma）總抗氧化能力檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），一氧化氮檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），蛋白酶（Sigma， Protease from Aspergillus oryzae，≥500 U/g），Dimethyl sulfoxide（滬試，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

2" 研究方法

2.1" 林蛙皮多肽提取物制備

取10 g林蛙皮粉末，加入100 mL 0.1 M NaOH溶液，反應(yīng)1 h后，6 000 rpm離心30 min后，取上清液置于分子量1 000的透析膜中，用去離子水透析2 d，每天替換2次去離子水，去除NaOH，透析液經(jīng)冷凍干燥后，獲得的產(chǎn)物為林蛙皮提取物。取1 mL的林蛙皮提取物（100 mg/mL），加入75 μL的蛋白酶于室溫反應(yīng)1 h后，以12 000 rpm離心30 min，獲得的上清液為多肽提取物。

2.2" 抑制DPPH自由基評估

利用無水乙醇配置10 mM的DPPH溶液，再稀釋成1 mM作為DPPH自由基清除評估使用。取不同濃度的林蛙皮提取物及多肽提取物加入1 mM DPPH溶液中，震蕩混合，并于室溫靜置30 min。使用酶標(biāo)儀分析517 nm吸光值。

2.3" 抑制ABTS自由基評估

利用ABTS法進(jìn)行ABTS自由基清除率的分析。將ABTS工作液稀釋至OD734為0.7左右，再加入不同濃度的林蛙皮提取物及多肽提取物，以酶標(biāo)儀分析734 nm吸光值。

2.4" 鐵離子還原/抗氧化能力法

利用FRAP法進(jìn)行鐵離子還原/抗氧化能力的分析。以酶標(biāo)儀分析593 nm吸光值，評估林蛙皮提取物及多肽提取物還原Fe3+成Fe2+的能力。利用不同濃度的FeSO4作為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行抗氧化能力評估。

2.5" 抑制一氧化氮生成評估

取50 μL的10 mM硝普鈉（一氧化氮供體），加入50 μL不同稀釋濃度的林蛙皮提取物及多肽提取物，于室溫反應(yīng)1 h后，加入100 μL一氧化氮檢測試劑盒的Griess Reagent I及Griess Reagent II混合試劑，以酶標(biāo)儀分析540 nm吸光值。

2.6" 細(xì)胞毒性評估

根據(jù)MTT（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide）方法評估林蛙皮提取物及多肽提取物對細(xì)胞的毒性。在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)，將不同濃度的林蛙皮提取物及多肽提取物加入培養(yǎng)后的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)反應(yīng)24 h后，加入6 μL的MTT（5 mg/mL）溶液反應(yīng)，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，之后移除培養(yǎng)液，加入200 μL的DMSO（Dimethyl sulfoxide）溶解沉淀物，以酶標(biāo)儀分析490 nm吸光值。

2.7" 抑制細(xì)胞活性氧評估

將不同濃度的多肽提取物加入RAW264.7細(xì)胞中培養(yǎng)12 h，之后加入400 μM的過氧化氫進(jìn)行細(xì)胞活性氧（ROS）的誘導(dǎo)，于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，以1∶1 000無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA探針，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)40 min，再利用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，最后將細(xì)胞懸浮于200 μL PBS緩沖液，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光分析，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設(shè)定為488 nm和525 nm。

2.8" 分光光度計分析

取1.25 mg/mL的林蛙皮提取物及多肽提取物，利用分光光度計進(jìn)行不同波長的掃描分析。

3" 結(jié)果與分析

3.1" 林蛙皮提取物工藝優(yōu)化的評估

蛋白酶可分成特異性（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）和非特異性（鏈霉蛋白酶、中性蛋白酶）蛋白酶等，其與蛙皮的作用會產(chǎn)生不同的多肽及抗氧化反應(yīng)[8]。本研究添加不同濃度的蛋白酶于林蛙皮提取物，在室溫反應(yīng)1 h，即獲得不同濃度的多肽提取物，進(jìn)一步利用DPPH自由基清除率進(jìn)行提取物抗氧化效果的評估。結(jié)果顯示，在林蛙皮提取物濃度為10 mg/mL及添加75 μL的蛋白酶條件下，約有83.1%去除DPPH自由基的能力。隨著蛋白酶的減少，DPPH自由基去除率也隨之減少，沒有添加蛋白酶的林蛙皮提取物，仍具有30.6%的去除率（圖1）。同樣，隨著林蛙皮提取物濃度的遞減，其抗氧化能力也減少，當(dāng)林蛙皮提取物濃度為1.25 mg/mL，且無添加蛋白酶的條件下，幾乎沒有清除DPPH自由基的效果。

評估蛋白酶對林蛙皮提取物在不同反應(yīng)時間下的抗氧化能力，在蛋白酶（75 μL蛋白酶/mL 林蛙皮提取物）反應(yīng)1 h時即可達(dá)到最優(yōu)化的DPPH自由基去除效果（圖2）。隨著反應(yīng)時間的增加，清除DPPH自由基的效果并沒增加太多。本研究利用化學(xué)及酶工藝的結(jié)合，有利于提高多肽提取物的提取率，在較少蛋白酶及較短水解時間內(nèi)，即可獲得優(yōu)化后具有抗氧化的多肽提取物。本研究的酶解工藝也比過去的研究所需時間更短[9-10]。之后將利用此工藝條件進(jìn)行其他功效分析。

3.2" 林蛙皮提取物及多肽提取物的抗氧化評估

本研究進(jìn)一步利用清除ABTS自由基評估林蛙皮提取物及多肽提取物的抗氧化能力，在濃度為1.25 mg/mL的條件下，有超過90%以上去除ABTS自由基的能力（圖3）。顯示林蛙皮提取物不經(jīng)過蛋白酶水解也具有非常良好的ABTS自由基清除效果，這表示在利用氫氧化鈉水解后，也能獲得具抗氧化的多肽化合物。

鐵還原能力（Ferric Reducing Ability of Plasma， FRAP） 用于評估林蛙皮提取物及多肽提取物是否可以將Fe3+-TPTZ（Ferric Ion-2，4，6-tri（2-pyridyl）-s-triazine）還原為藍(lán)色Fe2+-TPTZ，以評估其抗氧化能力[11]。結(jié)果顯示，隨著林蛙皮提取物及多肽提取物的增加，此2種提取物還原Fe3+成Fe2+的能力也隨之增加，其中多肽提取物的還原力相對于林蛙皮提取物較佳（圖4）。此結(jié)果與DPPH自由基清除率的趨勢相似，同樣是經(jīng)過酶處理后的多肽提取物效果較好。

3.3" 林蛙皮提取物及多肽提取物的抗炎評估

一氧化氮被認(rèn)為是參與炎癥、癌癥和病理狀況發(fā)展的因素，因此檢測一氧化氮的清除率可作為抗炎的依據(jù)[12]。評估本研究林蛙皮提取物及多肽提取物的抗炎能力，在濃度為10 mg/mL的條件下，林蛙皮提取物及多肽提取物去除一氧化氮分別為55.3%及72.3%，當(dāng)濃度為1.25 mg/mL時，林蛙皮提取物及多肽提取物去除一氧化氮仍有38.9%及40.2%（圖5）。此結(jié)果顯示，林蛙皮提取物及多肽提取物在抗炎能力上具有一定的潛力。

3.4" 林蛙皮提取物及多肽提取物的細(xì)胞毒性及活性氧清除能力評估

為確認(rèn)林蛙皮提取物及多肽提取物是否具有臨床應(yīng)用價值，本研究利用MTT評估其細(xì)胞毒性。在濃度為10 mg/mL的條件下，多肽提取物對RAW264.7細(xì)胞的存活率仍有95%，但林蛙皮提取物在濃度為2.5 mg/mL的條件下，對RAW264.7細(xì)胞的存活率只有16.5%。此結(jié)果顯示利用蛋白酶進(jìn)一步水解林蛙皮提取物能大幅降低對細(xì)胞的毒性傷害（圖6）。很多研究闡明活性氧會引發(fā)人體很多疾病，包含炎癥反應(yīng)、癌癥、老化、神經(jīng)及血管疾病[13]。進(jìn)一步評估多肽提取物對活性氧的去除率，可發(fā)現(xiàn)隨著多肽提取物濃度的增加，活性氧的濃度有下降的趨勢，當(dāng)濃度為10 mg/mL時，活性氧的去除可恢復(fù)到與正常細(xì)胞一致（圖7）。本結(jié)果顯示多肽提取物有抑制活性氧生成的功效。

3.5" 林蛙皮提取物及多肽提取物的吸收波長分析

太陽輻射包含有UVA、UVB、UVC，當(dāng)皮膚長期暴露于太陽輻射下會導(dǎo)致許多人體疾病，如光老化、光敏性、光毒性、免疫抑制及皮膚癌等[14]。本研究為了解林蛙皮提取物及多肽提取物是否能有效吸收紫外線，取1.25 mg/mL的林蛙皮提取物及多肽提取物，利用分光光度計進(jìn)行不同波長的掃描分析，結(jié)果顯示林蛙皮提取物在波長248～278 nm時有最高的吸收波長，當(dāng)?shù)鞍酌杆饬滞芷ぬ崛∥锍啥嚯奶崛∥锖螅渥罡呶詹ㄩL為258～285 nm（圖8），吸收波長為300 nm時，多肽提取物的吸光值仍可達(dá)0.59。

4" 結(jié)論

林蛙皮在過去常被作為廢棄物拋棄，但其生長環(huán)境獨特，且作為中藥儲藏的林蛙皮在日曬和水泡的情況下仍可保持幾十年不腐爛、不變質(zhì)，表示其含有一些特殊活性的物質(zhì)。隨著對林蛙皮的深入研究，越來越多不同生物活性功能被挖掘。其中以分泌的生物活性肽被研究得較多，但常因酶處理的工藝成本高且耗時久的問題，導(dǎo)致利用及應(yīng)用價值降低。本研究結(jié)合化學(xué)及酶處理的方法，能有效降低成本及時間，從本實驗獲得的多肽提取物在去除自由基的抗氧化能力上具有非常卓越的效果，對于細(xì)胞也沒有非常大的傷害性，從細(xì)胞的研究中，也可發(fā)現(xiàn)此類多肽對于活性氧能有非常優(yōu)的清除效果。本研究值得進(jìn)一步再去鑒定其中更具功效的多肽序列，以作為未來的醫(yī)療用途。

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