食源性致病菌天然抗生物被膜劑的研究進展

楊昌穎，吳亦菲，謝廷懌，劉娜娜，劉 欣，李卓思，董慶利，秦曉杰

上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093

食源性致病菌是引發(fā)食源性疾病的重要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，每年全球有近十分之一的人在食用受污染的食物后患病，每年導致超過10 萬人死亡[1]。2011—2020年，我國由食源性致病菌污染引發(fā)的食物中毒事件累計達35 806 起，患病人數(shù)高達266 968 人，且患病率呈增長趨勢[2]。在食品工業(yè)環(huán)境中，常見的食源性致病菌有沙門氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌（簡稱單增李斯特菌）、阪崎腸桿菌等[3]。盡管已經(jīng)常采取各種措施來控制致病菌，但由致病菌污染引發(fā)的食品安全事件仍在頻繁發(fā)生。其中，病原體形成生物被膜是其能夠逃逸外界壓力的重要因素[4]。生物被膜是指在特定條件下，細菌依附于接觸表面所形成的特殊結構，旨在適應環(huán)境并表現(xiàn)為一種特定的存在形態(tài)。

食源性致病菌生物被膜的形成與接觸表面的性質(zhì)（如表面電荷、表面化學組成及表面粗糙度等）、微生物種類及環(huán)境因素（如pH、溫度及營養(yǎng)條件）等有關[5]。目前在控制食源性致病菌生物被膜方面的相關研究中，主要采用化學方法、物理方法以及生物方法來展開。由于生物被膜結構致密且細菌狀態(tài)復雜，因此化學方法的清除效果相對有限。物理方法能夠干擾食源性致病菌在非生物表面的附著，但僅能損傷細胞而不影響其附著性，這會導致清除不徹底。根據(jù)目前的研究結果，天然抗生物被膜劑，如噬菌體、植物提取物、抗菌肽等，在控制食源性致病菌生物被膜方面表現(xiàn)出顯著效果。這些方法具有安全、高效、毒副作用小的特點，已成為食品安全領域的研究熱點。

本文簡述了食源性致病菌生物被膜的危害，歸納了天然抗生物被膜物質(zhì)的種類及其作用效果，從降低細菌黏附能力、抑制群體感應系統(tǒng)（Quorum Sensing，QS）、 降解胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances, EPS）、破壞細菌細胞膜等方面闡述了天然抗菌劑對食源性致病菌生物被膜的作用機制，并對天然抗生物被膜劑未來的發(fā)展方向進行展望，以期為減少由生物被膜引發(fā)的食品安全事件提供參考。

1 食品工業(yè)中食源性致病菌生物被膜形成的危害

生物被膜是細菌黏附于生物或非生物接觸表面所形成的由胞外聚合物EPS（如多糖、蛋白質(zhì)或多肽、脂質(zhì)和胞外DNA 等）包裹的大量細菌聚集群落[6]。生物被膜態(tài)的致病菌在惡劣環(huán)境下的生存能力和抵抗能力顯著增強，并且難以被徹底清除，它們能夠在食品加工環(huán)境中長久存活，加劇食源性疾病暴發(fā)的風險。近年來，全球范圍內(nèi)食物中毒暴發(fā)與食源性致病菌形成生物被膜潛在相關的案例如表1 所示。

表1 食源性致病菌導致的食物中毒暴發(fā)事件案例

表2 不同種類天然物質(zhì)對食源性致病菌生物被膜的作用效果

2 天然抗生物被膜劑

2.1 噬菌體

噬菌體（phage）是一種天然的抗生物被膜劑，具有繁殖速度快、特異性強的特點，能快速殺滅細菌。Byun 等[14]用李斯特菌特異性噬菌體混合物來處理食品接觸材料形成的生物被膜，8 h 后，生物被膜減少量超過2 log CFU/cm2。Pottker 等[15]將7 種噬菌體作用于12 株腸炎沙門氏菌，結果表明混合噬菌體對生物被膜的抑制水平最高可達88.53%。盧瑋等[16]從新疆雙峰駝糞便中分離純化了4 個金黃色葡萄球菌（SA）噬菌體，當噬菌體與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）共同培養(yǎng)時，細菌裂解率高達42.55%，且4 個SA 噬菌體對MRSA 菌株的生物被膜有明顯的清除作用。將多種噬菌體混合使用或將噬菌體與化學物質(zhì)混合使用可提高殺菌效果。

2.2 植物提取物

植物提取物是從植物中提取的天然物質(zhì)，包括揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿類、多酚類等。植物提取物主要通過影響細菌的表面黏附能力、群體感應和細胞內(nèi)的能量代謝過程來抑制生物被膜的形成[17]。

2.2.1 揮發(fā)油類

精油是從植物中提取的揮發(fā)性芳香族油性液體，有較好的抑菌效果。洪小利等[18]表明在亞抑菌濃度下，腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌的黏附性和群體感應信號分子AI-2 的活性顯著降低了，且在1/2MIC 肉桂精油作用下兩種細菌的信號分子AI-2分別減少了42.8%和37.6%，以此干擾生物被膜的形成。Sharifi 等[19]用麝香精油和香椿精油（EOs）處理腸出血性大腸桿菌（EHEC）時，在1.56 μg/mL 質(zhì)量濃度下顯著抑制了EHEC 生物被膜的形成，并導致luxS 和pfs 這兩個基因明顯下調(diào)，阻礙了細菌的QS系統(tǒng)。

2.2.2 黃酮類

黃酮類物質(zhì)是研究最廣泛的天然化合物之一，目前已發(fā)現(xiàn)了8 000 多種黃酮類化合物。柑橘中的黃酮，如山柰酚和柚皮素，已被證明能通過干擾酰基-高斯氨酸內(nèi)酯（AHL）與其受體之間的相互作用，充當群體感應抑制劑（QSI），從而抑制大腸桿菌O157∶H7 和哈維弧菌的生物被膜的形成[20]。同樣，在柑橘類黃酮柚皮素中，當金黃色葡萄球菌暴露于柚皮素時，細菌涂層會變薄，分離為單菌落。這種生物被膜的減少可能與細胞表面疏水性的改變和產(chǎn)生的胞外多糖減少有關，這與生物被膜的黏附性和形成有關[21]。

2.2.3 生物堿類

生物堿是結構上含氮的堿性有機化合物，大多有復雜的環(huán)狀結構，常見于高等植物或中草藥中。按照其結構分類，有吡咯類、吲哚類、嘌呤類、吡啶類和咪唑類等。利血平是常見的吲哚類生物堿，在測定其對銅綠假單胞菌PA01 生物被膜的影響時，利血平減少了細胞的運動、毒力因子的產(chǎn)生和控制QS 基因的表達[22]。Lee 等[23]研究了生物堿（哈馬林和諾哈曼）對大腸桿菌O157∶H7 和銅綠假單胞菌PAO1的抗菌能力，通過聚焦和電子顯微鏡觀察證實了哈馬林和諾哈曼對生物被膜的抑制作用。

2.3 酶

食品工業(yè)中，常用抗生物被膜酶靶向清除生物被膜，不同的酶對生物被膜的作用效果往往不同。Park 等[24]發(fā)現(xiàn)，含蛋白酶的放線菌培養(yǎng)上清液對金黃色葡萄球菌的生物被膜抑制率超過80%，并能清除成熟的生物被膜。脫氧核糖核酸酶I（DNaseI）可以通過氧化還原反應靶向降解生物被膜基質(zhì)中的eDNA，從而破壞生物被膜結構。Nguyen 等[25]發(fā)現(xiàn)用100 μg/mL 的DNaseI 處理單增李斯特菌生物被膜后，可誘導細胞不完全分散，加入蛋白酶K 時能完全抑制生物被膜生長。聯(lián)合酶處理的抑制效果更加顯著。Yuan 等[26]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合抗生物被膜酶（脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶K）對副溶血性弧菌生物被膜的抑制率和清除率分別為89.7%和66.9%，且組合酶還降低了胞外多糖的濃度并破壞了EPS 基質(zhì)。

2.4 抗菌肽

抗菌肽是廣泛存在于生物體內(nèi)天然免疫系統(tǒng)中的一類小分子多肽，具有強堿性、抗菌光譜廣泛、耐藥性低等特點，常被運用于抗生物被膜的研究過程。王雪燕等[27]發(fā)現(xiàn)草魚魚鱗抗菌肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等細菌的穿膜率可達51.04%～72.76%，它可以通過影響細菌的生長周期來加速細菌衰亡。李會等[28]用鼠源性抗菌肽（CRAMP）對成熟的銅綠假單細胞（PAO1）生物被膜進行處理，在顯微鏡的觀察下，經(jīng)過CRAMP 處理的96 孔板的熒光強度顯著降低，說明CRAMP 對PAO1 成熟生物被膜具有明顯的清除效果?？咕氖且环N類高效的抑菌物質(zhì)，但其具有多肽屬性，代謝穩(wěn)定性差，易被蛋白酶水解。但有研究表示，通過設計抗菌肽的特定分子結構、避免酶切位點可減慢抗菌肽的水解速度，使其功效最大化[29]。

2.5 生物表面活性劑

生物表面活性劑是指在一定條件下培養(yǎng)微生物時，在其代謝過程中分泌出的具有一定表面活性的代謝產(chǎn)物。槐糖脂是一類由酵母生產(chǎn)的糖脂表面活性劑，它會削弱細菌的黏附性和EPS 基質(zhì)，導致生物被膜表面脫落和破裂。乳酸菌生物表面活性劑（BS）不僅可以調(diào)控金黃色葡萄球菌群體感應系統(tǒng)信號分子AI-2 的釋放，還能調(diào)控cid、ica 和agr 等基因的表達，從而影響金黃色葡萄球菌生物被膜的形成[30]。生物表面的活性物質(zhì)主要通過降低菌株的黏附性、調(diào)控相關基因的表達和破壞細胞膜或生物被膜結構來控制生物被膜的形成?，F(xiàn)有研究主要集中于生物表面活性物質(zhì)對菌株黏附性和細胞膜的影響，對基因層面的研究則相對較少，今后可深入探究。

3 天然抗生物被膜劑的作用機制

總結現(xiàn)有天然抗菌劑對食源性致病菌生物被膜作用機制的研究，繪制圖1，主要可概括為五個方面：（1）降低細菌表面黏附能力；（2）降低EPS 產(chǎn)率；（3）調(diào)控群體感應信號通路；（4）降解EPS 組分；（5）破壞細菌細胞膜。

圖1 天然抗菌劑在食源性致病菌生物被膜形成與控制中的作用機制

3.1 降低表面黏附能力，阻止致病菌生物被膜的形成

天然抗生物被膜劑可通過降低細菌表面黏附能力和EPS 產(chǎn)率來阻止生物被膜的形成（圖1）。其中，植物提取物、抗菌肽和生物表面活性劑抑制細菌生物被膜的黏附能力主要通過兩種方式。第一，抑制細菌相關黏附基因的表達，從而降低生物被膜的形成能力。Ming 等[42]發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)山柰酚對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的抑制率達80%，并減少了金黃色葡萄球菌相關黏附基因（clfA，clfB，fnbA，fnbB）的表達?？咕牟粌H能降低耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）生物被膜形成初期的黏附性，還能降低MRSA 毒力因子和生物被膜形成相關基因fib 和多糖黏附素icaA 基因的轉錄水平[43-44]。第二，這些天然抗生物被膜劑通過改變細菌表面性質(zhì)來降低其黏附能力。其中，精油和表面活性劑對生物被膜的黏附性的影響最為顯著。Rossi 等[45]發(fā)現(xiàn)肉桂精油中的醛類物質(zhì)通過共價交聯(lián)DNA、蛋白質(zhì)和胺基團來改變細菌細胞的正常功能，影響細菌的黏附能力。

3.2 降低胞外聚合物EPS 的產(chǎn)率，抑制致病菌生物被膜的形成

降低胞外EPS 的產(chǎn)量也是抑制生物被膜形成的重要方式。植物提取物、抗菌肽和噬菌體能夠改變細胞膜的通透性從而影響胞外物質(zhì)的產(chǎn)生，進而抑制細菌生物被膜的形成。例如，大黃素通過抑制金黃色葡萄球菌eDNA 的釋放對生物被膜EPS 產(chǎn)生抑制作用[30]。抗菌肽可以抑制生物被膜胞外蛋白的合成與分泌，且抗菌肽的濃度越高抑制效果越強。此外，抗菌肽還能通過降低fib、icaA 基因的轉錄水平來降低生物被膜形成初期的黏附性，其中，icaA 會影響多糖黏附素的合成[43]，fib 蛋白可以調(diào)節(jié)MRSA的毒力因子并控制生物被膜的形成[44]。噬菌體可以通過刺激宿主細菌產(chǎn)生EPS 降解酶，進而分解細胞外基質(zhì)中的多糖和蛋白質(zhì)，促進其穿透、復制和消除存在于生物被膜內(nèi)的細菌。

3.3 調(diào)控致病菌生物被膜形成的信號通路，抑制致病菌生物被膜的形成

生物被膜的形成主要通過幾種信號通路來調(diào)節(jié)，如群體感應（QS）和核苷酸第二信使系統(tǒng)。一些植物提取物和降解酶可以通過調(diào)控信號通路，特別是細菌的群體感應QS 系統(tǒng)中相關蛋白的表達來阻斷細胞間的信號傳遞。QS 系統(tǒng)是一種在細菌中廣泛存在的機制，可以通過細菌分泌的信號分子來傳遞信息。天然類QS 抑制劑可通過抑制信號分子產(chǎn)生、降解信號分子、競爭性結合信號分子等方式干擾信號分子合成，從而有效抑制生物被膜的形成。

3.3.1 抑制信號分子產(chǎn)生

通過抑制QS 信號分子的產(chǎn)生來干預生物被膜的形成是一種常見的抑制生物被膜的途徑。研究表明，從葡萄柚汁中分離得到的天然呋喃香豆素對AI-1 和AI-2 活性的抑制率高達95%，且能抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌生物被膜的形成[46]。其中，LsrK 是一種AI-2 激酶，當外源性加入LsrK 和ATP 時，導致細胞外的AI-2 易被磷酸化，使其具有親水性，從而阻止其穿過細胞膜發(fā)揮信號分子的作用[47]。

3.3.2 降解信號分子

酶降解QS 信號分子是抑制QS 系統(tǒng)最直接、最有效的方法，在革蘭氏陰性菌中，AHL 可被AHL-內(nèi)酯酶和AHL-?；高@兩種類型的酶降解。Roy[48]證明，加入LsrK 和ATP 能顯著降低大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的QS 反應，其原因是AI-2 的磷酸化淬滅了細菌中的QS。在Kiran 等[49]的研究中，經(jīng)內(nèi)酯酶處理后銅綠假單胞菌的生物被膜的減少率從69.1%提升至77.34%，與抗生素（如環(huán)丙沙星、慶大霉素）聯(lián)合使用效果更佳。

3.3.3 競爭性結合信號分子

信號分子與其受體的結合具有特異性，但一些信號分子類似物可與信號分子的結合蛋白產(chǎn)生競爭性結合，通過占據(jù)結合位點抑制信號分子的傳遞通路。研究表明，植物類黃酮柚皮素通過直接結合QS調(diào)節(jié)因子LasR 發(fā)揮作用，與其生理激活劑3OC12-HSL 競爭，損害銅綠假單胞菌中QS 調(diào)節(jié)的毒力因子和彈性蛋白酶等的產(chǎn)生[50]。天然呋喃酮在結構上與AHL 相似，其拮抗活性源于與天然自身誘導劑的競爭，結合后阻斷AHL 受體，目前已證明可以減少細菌物種毒力因子的產(chǎn)生和生物被膜的形成[51]。

QS 是控制生物被膜形成的重要組成部分，不同細菌和信號分子對生物被膜的差異調(diào)節(jié)揭示了QS系統(tǒng)的復雜性。探索不同信號分子介導的QS 對細菌生物被膜形成機制的影響可以針對性地提出抑制生物被膜形成的解決措施，使QS 系統(tǒng)成為消除細菌生物被膜的潛在靶標。

3.4 降解EPS 組分

細胞外聚合物EPS，類似于細胞內(nèi)物質(zhì)，是致病菌用于自我保護的天然產(chǎn)物。當天然抗菌物質(zhì)，尤其是降解酶作用于致病菌細胞時，通過降解EPS 組分來減小其對細胞的保護機制，從而清除成型的生物被膜。多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和eDNA 是EPS 的重要組成部分，脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶K 等降解酶經(jīng)滲透作用進入生物被膜，通過降解或水解致病菌生物被膜形成過程中的必需物質(zhì)達到清除生物被膜的目的。研究發(fā)現(xiàn)，DNA 酶和蛋白酶K 可降解單增李斯特菌生物被膜EPS 基質(zhì)中的eDNA 和蛋白質(zhì)，減少細菌的黏附[52]。Tiwari 等[53]發(fā)現(xiàn)熟獼猴桃的次級代謝物可降低鮑曼不動桿菌EPS 中胞外多糖、蛋白質(zhì)及eDNA 的含量，進而清除微生物的生物被膜。通過降解酶降解EPS，可以清除成熟的生物被膜。

3.5 破壞細菌細胞膜

細胞壁膜是細胞間進行物質(zhì)交換和信息交流的重要通道，對于維持微生物正常的生命活動發(fā)揮著非常重要的作用。噬菌體穿孔素和內(nèi)溶酶是其在感染細菌的過程中出現(xiàn)的兩種關鍵蛋白質(zhì)，通常在感染后期協(xié)同降解細菌細胞壁成分，破壞細胞膜結構，使細胞溶解。植物提取物和一些微生物代謝物通過影響細胞通透性來破壞細胞膜的結構，使核酸和蛋白質(zhì)等細胞內(nèi)大分子從細胞中滲出，導致細菌死亡。Hayouni 等[54]表明鼠尾草根部和金參漿果根部提取的精油可以提高細胞膜的滲透性，使三磷酸腺苷滲出，細菌裂解，生物被膜被破壞。另外，Islam 等[55]用枯草芽孢桿菌乙酸乙酯提取物處理食源性致病菌成熟的生物被膜，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物可以穿透細菌細胞膜并喚起誘導細胞裂解，從而清除生物被膜。

4 結語

食源性致病菌生物被膜形成后，其黏合強度和黏附特性會使其難以徹底清除，對食品安全和公眾健康造成嚴重威脅。傳統(tǒng)的物理手段難以完全消除生物被膜，而長期使用化學手段則可能導致細菌產(chǎn)生抗性。因此，迫切需要安全有效的策略來控制食源性致病菌的生物被膜。當前，天然抗生物被膜劑以其良好的殺菌效果、清除生物被膜的能力以及對環(huán)境和人體無危害等優(yōu)點成為控制生物被膜的潛在新型策略。降低細菌表面黏附能力和EPS 產(chǎn)率、抑制群體感應系統(tǒng)、降解胞外聚合物EPS 組分及破壞細菌的細胞膜結構和生理功能是天然抗生物被膜劑的主要作用機制。

盡管噬菌體、抗菌肽、植物提取物等在致病菌生物被膜的形成控制與清除方面極具潛力，但部分天然抗菌劑在抑制生物被膜形成的廣譜性、持久性和穩(wěn)定性方面存在一些不足，且現(xiàn)有研究多集中在對作用效果的探究上，針對天然抗菌劑對生物被膜的作用機制尤其是分子層面的解析不深入，未能從根源上找到控制措施。今后，針對天然物質(zhì)抗生物被膜的研究可從以下幾方面開展：1）進一步挖掘和開發(fā)高效廣譜的天然抗菌劑；2）系統(tǒng)研究QS 對不同細菌信號分子相關基因及蛋白的動態(tài)調(diào)控，尋找抑制QS 系統(tǒng)的新方法，明確抑制生物被膜形成的復雜機制；3）探索天然抗生物被膜劑與其他方法（如光療、抗生素等）的協(xié)同效應，提高生物被膜的清除效果；4）將使用天然抗菌劑與抗附著劑或生物界面材料相結合，開發(fā)具有抗生物被膜特性的新型材料，以降低致病菌形成生物被膜對食品安全的影響，保障公眾的生命健康。