藥企環(huán)境菌庫在實際工作中的應(yīng)用

郭心怡，林 燕*，曹長雷，陳文俊

1.華蘭生物工程重慶有限公司，重慶 涪陵 408100；2.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 涪陵 408100

制藥企業(yè)的潔凈生產(chǎn)環(huán)境作為一種典型的受控環(huán)境，其運行和管理占據(jù)著非常重要的地位。

近年來，藥品安全突發(fā)事件頻繁發(fā)生，這些事件與潔凈室的微生物控制存在著極為密切的聯(lián)系。2011年實施的《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》修訂了無菌藥品附錄[1]，對制藥潔凈生產(chǎn)環(huán)境提出了更加嚴(yán)格的要求，尤其在潔凈環(huán)境監(jiān)測的內(nèi)容納入2015年版《中國藥典》[2]附錄之后，法規(guī)對潔凈環(huán)境監(jiān)測的要求變得越來越高，這就要求制藥企業(yè)，尤其是無菌制劑企業(yè)要投入更多的人力和物力對生產(chǎn)的潔凈環(huán)境進行有效的監(jiān)控，從而達到提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑

革蘭氏染色液、4%氫氧化鉀水溶液、氧化酶檢測指示條、3%過氧化氫溶液、API 鑒定試劑盒、PCR擴增試劑、基因組DNA 提取試劑盒。

1.2 主要儀器

BSC-1000-Ⅱ-A2 生物安全柜、培養(yǎng)箱、顯微鏡、VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統(tǒng)、全自動快速微生物檢測系統(tǒng)、RiboPrinter 全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)、梯度PCR 儀和核酸微量分析儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法

收集從藥品生產(chǎn)潔凈區(qū)、制藥用水系統(tǒng)、原輔材料等環(huán)境中檢出的微生物，將其分離純化后采用生化鑒定技術(shù)和基因型鑒定技術(shù)進行鑒定，然后保存并建立環(huán)境菌庫，定期進行統(tǒng)計，分析各板塊微生物的分布情況及變化，采取相應(yīng)的措施，為微生物污染控制提供指導(dǎo)[3]。

2.2 完善性能測試

統(tǒng)計無菌灌裝模擬試驗潔凈環(huán)境的微生物數(shù)據(jù)，根據(jù)微生物的種類和占比，選取2 種占比高且分屬不同種屬的微生物作為無菌灌裝模擬中培養(yǎng)基促生長試驗的指示菌。環(huán)境中微生物流動性強且高級別潔凈環(huán)境中微生物的含量極低，可根據(jù)每年微生物的變化調(diào)整指示菌，以便于更全面地監(jiān)測培養(yǎng)基對于環(huán)境中微生物的促生長能力。2020年無菌灌裝模擬試驗中增加了科氏葡萄球菌科氏亞種和巨大芽孢桿菌作為環(huán)境指示菌，2021年無菌灌裝模擬試驗中選擇表皮葡萄球菌和巨大芽孢桿菌作為環(huán)境指示菌（見表1、表2）。

表1 2020年潔凈環(huán)境檢出的微生物占比

表2 2021年潔凈環(huán)境檢出的微生物占比

2.3 消毒劑效果評價

統(tǒng)計潔凈環(huán)境的微生物數(shù)據(jù)，可知環(huán)境中微生物占比最高的為葡萄球菌屬，其次為芽孢桿菌屬。根據(jù)微生物的種類和占比，選取科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus cohniisubsp.cohnii）、阿爾萊特葡萄球菌（Staphylococcus arlettae）、少動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis）、 云南微球菌（Micrococcus yunnanensis）、 克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）、蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycodes）作為測試菌株；消毒劑選用常見的75%乙醇、0.2%新潔爾滅溶液和0.05%的84 消毒液；將消毒液與高濃度的測試菌株作用1～15 min，發(fā)現(xiàn)常用消毒液對無芽孢的污染菌的消殺效果良好，而對含芽孢的污染菌的消殺效果不理想。基于環(huán)境中芽孢桿菌屬微生物占比較高，且該類微生物耐極端環(huán)境能力強的特性，選取7.9%過氧化氫殺孢子劑對芽孢桿菌進行消毒效果測試。結(jié)果表明7.9%過氧化氫殺孢子劑對含芽孢的污染菌的消殺效果良好（結(jié)果見表3、表4）。

表3 6 種測試菌株消毒測試效果

2.4 環(huán)境微生物污染控制

結(jié)合消毒劑效果試驗結(jié)果，對人員、設(shè)備和房間清潔消毒程序進行微生物調(diào)查，優(yōu)化程序，采取嚴(yán)格的管理措施，并針對空間增設(shè)定期的過氧化氫熏蒸。經(jīng)過1年的控制，觀察發(fā)現(xiàn)微生物檢出率和種類明顯下降，特別是人源的G（+）球菌和難消殺的G（+）芽孢桿菌作為環(huán)境微生物控制的難點得到了顯著的控制，降低了微生物的污染。微生物的檢出率和種類數(shù)對比趨勢見圖1、圖2。

圖1 微生物檢出率對比

圖2 微生物種類數(shù)對比

2.5 制藥用水系統(tǒng)質(zhì)量控制

制藥用水系統(tǒng)中的微生物主要來源于純化水系統(tǒng)。對其中微生物的種類和占比進行統(tǒng)計分析[4]，發(fā)現(xiàn)主要為少動鞘氨醇單胞菌和皮氏羅爾斯頓氏菌（見表5）。隨著企業(yè)對水系統(tǒng)質(zhì)量控制要求的不斷提高，2020—2021年持續(xù)監(jiān)控數(shù)據(jù)顯示菌落數(shù)正在穩(wěn)步下降。通過對數(shù)據(jù)進行評估分析，可知提高對純化水行動限控制的標(biāo)準(zhǔn)，可以優(yōu)化純化水系統(tǒng)質(zhì)量管理。

表5 2020—2021年持續(xù)監(jiān)控數(shù)據(jù)

2.6 生產(chǎn)工藝中微生物溯源

對原料袋表面清洗消毒調(diào)查中微生物的種類和占比進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)其主要為少動鞘氨醇單胞菌，這種菌是廣泛存在于水源和環(huán)境中的微生物。結(jié)合原料袋表面清洗消毒工藝分析：微生物的主要來源與消毒效果、原料袋表面清洗水污染或帶入有很大的關(guān)系。應(yīng)當(dāng)聯(lián)合生產(chǎn)部、質(zhì)量保證部啟動微生物溯源調(diào)查，優(yōu)化消毒劑、消毒方式、清洗消毒工藝，并挖掘根本原因，據(jù)此制定有效的控制措施，持續(xù)監(jiān)控并加以改進（表6），加大對微生物污染的控制力度。

表6 2020—2021年持續(xù)監(jiān)控數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

如何對生產(chǎn)環(huán)境中微生物污染的控制進行有效監(jiān)控，是制藥企業(yè)需要應(yīng)對的一個難題，這就需要其建立一套科學(xué)、嚴(yán)格的監(jiān)督管理模式，從建立環(huán)境監(jiān)測計劃、收集、分離、鑒別環(huán)境污染菌以及鑒別數(shù)據(jù)的應(yīng)用分析等方面入手實現(xiàn)對潔凈環(huán)境中微生物污染的有效監(jiān)控，以保證潔凈環(huán)境處于生產(chǎn)所需的受控狀態(tài)。

建立環(huán)境的監(jiān)測計劃，收集、分離、鑒別環(huán)境污染菌和鑒別數(shù)據(jù)的應(yīng)用分析，可以找出生產(chǎn)中存在的微生物污染情況及其規(guī)律，從而更好地對生產(chǎn)過程進行控制，以滿足藥品GMP 的嚴(yán)格監(jiān)管要求。首先，企業(yè)可以對通過生產(chǎn)潔凈環(huán)境監(jiān)控建立起的菌庫數(shù)據(jù)進行分析和統(tǒng)計，從而為制藥企業(yè)的相關(guān)工藝驗證（例如無菌灌裝模擬試驗、消毒劑效果評價等）提供環(huán)境菌和有效的評價；其次，可以根據(jù)菌庫數(shù)據(jù)和微生物溯源對制藥的生產(chǎn)過程進行微生物風(fēng)險分析，及時發(fā)現(xiàn)異常趨勢，并采取有效的措施，降低微生物污染的風(fēng)險，提高質(zhì)量管理體系的有效性[5]；最后，持續(xù)不斷地對環(huán)境菌庫進行更新補充，形成動態(tài)管理的環(huán)境菌庫，能夠為潔凈環(huán)境中的微生物控制提供有效的保障。

實驗結(jié)果證實，對制藥潔凈生產(chǎn)環(huán)境進行監(jiān)控、研究并建立環(huán)境菌庫，在實際生產(chǎn)過程中非常有必要，發(fā)揮的作用也是強大且有效的。