腸道微生物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠/小鼠調(diào)節(jié)作用機(jī)制的研究進(jìn)展

秦 銳，郭 剛，張世峰，郭 健*

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院疼痛科，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730030

腸道微生物群由胃腸道中的基因組成分、產(chǎn)物和微生物組成，具有較為穩(wěn)定的種群結(jié)構(gòu)，該微生物群數(shù)量龐大，種類(lèi)繁多。腸道菌群對(duì)健康具有積極的影響，例如，腸道菌群會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子，這些因子能夠調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)、加強(qiáng)細(xì)胞保護(hù)、維持屏障完整性和穩(wěn)態(tài)等。其中，有益細(xì)菌是保障腸道功能穩(wěn)定性的必要菌群，維持腸道處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，起到儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)、提高免疫力、對(duì)抗腸道微環(huán)境改變等作用。但同時(shí)，機(jī)體功能受到飲食不當(dāng)、藥物使用、細(xì)胞衰老、情緒焦慮等多種負(fù)面因素影響，導(dǎo)致腸道微生物群成分發(fā)生改變，人體內(nèi)多項(xiàng)慢性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增大，如糖尿病、肥胖、骨質(zhì)疏松等[1]。腸道微生物會(huì)對(duì)宿主生理產(chǎn)生巨大影響，因此，以腸道微生物為目標(biāo)靶點(diǎn)或診斷方向成為熱門(mén)的研究主題。骨質(zhì)疏松（OP）是以骨強(qiáng)度和骨密度下降為標(biāo)志的骨骼疾病，病因多為機(jī)體衰老、糖皮質(zhì)激素干擾或雌激素缺乏，容易改變骨結(jié)構(gòu)、增加骨脆性，同時(shí)還伴隨著劇烈疼痛、行為障礙，骨折發(fā)生的幾率大大提高。當(dāng)前已有明確的報(bào)道指出腸道微生物群的變化會(huì)影響到骨密度和骨結(jié)構(gòu)?！肮俏⑸飳W(xué)”是一門(mén)將骨骼生物學(xué)與微生物學(xué)相結(jié)合的學(xué)科，但目前仍需對(duì)關(guān)于腸道微生物如何調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松的論題進(jìn)行深入的研究。本文通過(guò)闡述腸道微生物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠/小鼠調(diào)節(jié)作用機(jī)制問(wèn)題，以期為如何使用益生菌預(yù)防骨質(zhì)疏松提供新思路。

1 腸道菌群與骨質(zhì)疏松的關(guān)系

骨健康是確保成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在一定程度上保持動(dòng)態(tài)平衡，使機(jī)體在從成長(zhǎng)到逐漸衰老的過(guò)程中保持相對(duì)穩(wěn)定的骨骼微環(huán)境。當(dāng)破骨細(xì)胞生成速率高于成骨細(xì)胞的生成速率時(shí)，會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)流失，造成骨質(zhì)疏松。OP 可分為兩種形式：原發(fā)性或繼發(fā)性，其具體屬于哪種形式取決于它是作為自然衰老的過(guò)程(雌激素缺乏)還是疾病病理的過(guò)程。這兩種形式都是由骨重建過(guò)程中的不平衡引發(fā)的，骨吸收/形成量明顯低于骨丟失量，導(dǎo)致骨骼微環(huán)境發(fā)生變化。在OP 發(fā)生時(shí)，往往會(huì)表現(xiàn)出骨量低、骨小梁變薄、骨質(zhì)流失等特征，骨折風(fēng)險(xiǎn)增大，嚴(yán)重性不可小覷。

腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量超過(guò)100 萬(wàn)億，種類(lèi)多達(dá)29 個(gè)細(xì)菌門(mén)。微生物群落的物種多樣性與健康息息相關(guān)，微生物群通過(guò)產(chǎn)生必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，消化其他無(wú)法消化的食物成分，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的成熟，有益于宿主的身體健康。微生物群群落組成的不健康失衡，稱(chēng)為生態(tài)失調(diào)，與多種代謝、炎癥、腸道屏障受損密切相關(guān)。一旦發(fā)生菌群失調(diào)，將會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的影響。腸道菌群是腸道中非常重要的穩(wěn)態(tài)成分，腸道菌群失調(diào)可以顯著改變部分前體細(xì)胞活性，如巨噬細(xì)胞RAW264.7 等，該細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量增加，同時(shí)骨髓中CD4+T4細(xì)胞占比降低，輔助免疫作用減弱。Metzger 等[2]通過(guò)給小鼠口服有害菌，發(fā)現(xiàn)該菌群會(huì)引發(fā)小鼠腸道炎性病癥和骨質(zhì)丟失。無(wú)菌小鼠的骨量均高于普通小鼠。Hathaway 等發(fā)現(xiàn)GF 小鼠比無(wú)特定病原體小鼠的骨密度高，將無(wú)特定病原體小鼠的腸道菌群移植給GF 小鼠，發(fā)現(xiàn)GF 小鼠骨密度下降。Li 等[3]發(fā)現(xiàn)對(duì)于由性類(lèi)固醇誘導(dǎo)造成的小鼠骨丟失，GF 小鼠具有抵抗作用。

糖皮質(zhì)激素（GCs）是一種有效的免疫調(diào)節(jié)藥物，具有顯著的副作用，包括由糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥（GIO）。GCs 會(huì)直接誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡，也會(huì)改變腸道菌群組成。盡管已知腸道微生物群有助于調(diào)節(jié)骨密度，但其在GIO 中具體起著什么作用尚未被研究過(guò)。Jonathan 等為了測(cè)試其相關(guān)性，給雄性C57/Bl6J 小鼠使用糖皮質(zhì)激素（潑尼松龍，GC-Tx）造模8 周，使小鼠成為GIO 小鼠，同時(shí)飼以廣譜抗生素，以耗盡微生物群，使得該小鼠骨小梁明顯丟失。用益生菌（路氏乳桿菌）補(bǔ)充調(diào)節(jié)腸道微生物，可防止骨小梁的丟失。這充分體現(xiàn)了腸道微生物群對(duì)GIO 的需求，長(zhǎng)期ABX 預(yù)防了GC-Tx誘導(dǎo)的骨小梁丟失。微生物群分析結(jié)果表明，糖皮質(zhì)激素治療改變了Verrucomicobiales 和Bacteriodales 門(mén)的豐度，隨機(jī)森林分析表明，不同類(lèi)群之間卟啉單胞菌科和梭菌目操作分類(lèi)單元（OTU）的豐度存在顯著差異。此外，將GC-Tx 小鼠的糞便移植給未經(jīng)治療的野生型WT 小鼠會(huì)導(dǎo)致其骨丟失，說(shuō)明微生物群對(duì)于GIO 的治療能夠改善骨丟失。

2 動(dòng)物品系選擇

在腸道微生物與大鼠/小鼠骨質(zhì)疏松之間的聯(lián)系的相關(guān)研究中，常用的大鼠品系為Wistar 大鼠和SD 大鼠。常用的小鼠品系較多，包含C57BL6 小鼠、CB6F1 小鼠、SAMP6 小鼠、SAMR1 小鼠、ICR 小鼠、無(wú)菌小鼠等。在特殊的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因小鼠也可以被用作試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，如純合子敲除護(hù)骨素基因小鼠，隨著鼠齡的增長(zhǎng)OP 癥狀加強(qiáng)。其中，無(wú)菌小鼠憑借其自身無(wú)任何細(xì)菌、無(wú)任何病原微生物的優(yōu)勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)中成為首選動(dòng)物品系，但缺點(diǎn)是對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境要求高，價(jià)格昂貴。

3 動(dòng)物模型的制備

基于OP 發(fā)生的生理病理過(guò)程，常見(jiàn)的造模方式主要包括兩種，即原發(fā)性和繼發(fā)性O(shè)P 模型。其中原發(fā)性O(shè)P 模型造模方法主要包含雄鼠切除睪丸法、雌鼠切除卵巢法，大多數(shù)品系大/小鼠均可以使用該方法進(jìn)行造模。繼發(fā)性O(shè)P 多由疾病發(fā)生、藥物干預(yù)等造成，包括常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝OP 模型（鏈脲佐菌素+卵巢切除）和藥物性骨質(zhì)疏松模型（糖皮質(zhì)激素造模）等，通過(guò)上述造模過(guò)程，誘發(fā)OP。實(shí)驗(yàn)室多用切除雙側(cè)卵巢誘發(fā)造模，其優(yōu)點(diǎn)是造模手術(shù)操作簡(jiǎn)單，死亡率低，造模成功率高。

4 常用益生菌調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松方式和作用機(jī)制

益生菌的定義為含有活的非致病性微生物的膳食補(bǔ)充劑。其中，多種細(xì)菌作為有益的益生菌得到了廣泛應(yīng)用，如腸球菌屬、雙歧桿菌、乳酸菌屬等，少數(shù)酵母菌也具有益生菌特性。益生菌具有如下特征：在胃腸道系統(tǒng)中生存（耐酸和膽酸）、表型和基因型穩(wěn)定性、與黏膜表面的黏附性、抗生素耐藥性、抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生和抑制病原體的能力。此外，益生菌或其發(fā)酵產(chǎn)物不能對(duì)宿主產(chǎn)生危害，不得使用含有可傳播耐藥基因的細(xì)菌，除非對(duì)病原微生物進(jìn)行誘導(dǎo)，引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)。研究表明補(bǔ)充益生菌對(duì)于骨組織微環(huán)境有潛在改善, 主要通過(guò)提升其數(shù)量和豐度來(lái)調(diào)節(jié)腸道酸堿度，影響其抗菌肽的分泌；通過(guò)增強(qiáng)宿主免疫功能和促進(jìn)生成黏液來(lái)增強(qiáng)屏障功能, 但具體機(jī)制不詳。許多研究已經(jīng)開(kāi)始利用動(dòng)物模型來(lái)研究益生菌是否可以用于預(yù)防原發(fā)性和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松性骨丟失。通過(guò)對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠更年期（OVX）模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)添加多種不同的益生菌（羅伊氏乳桿菌ATCC 6475、副干酪乳桿菌（NTU 101）或植物乳桿菌（NTU 102）、鼠李糖乳桿菌GG、副干酪乳桿DSM13434、植物乳桿菌DSM 15312、DSM 1531 等），均能夠有效改善OVX 模型鼠骨質(zhì)疏松病癥，骨體積分?jǐn)?shù)、骨密度、骨小梁厚度和數(shù)量均明顯上調(diào)，與空白對(duì)照組小鼠指標(biāo)水平相當(dāng)；骨質(zhì)中RANKL 蛋白、TRAP5 m、皮質(zhì)骨RNARANKL/OPG 比值均減少，血清吸收標(biāo)志物c 末端肽和尿鈣排泄分?jǐn)?shù)也有所下降，而成骨細(xì)胞相關(guān)基因不變（見(jiàn)表1）。這些結(jié)果進(jìn)一步為益生菌通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的吸收防止雌激素缺乏導(dǎo)致小鼠骨丟失的觀點(diǎn)提供了支持。在非益生菌組中相關(guān)指標(biāo)無(wú)明顯變化，說(shuō)明非益生菌無(wú)法改善OP。OVX 大鼠中股骨的成骨細(xì)胞減少但骨表面的破骨細(xì)胞增加。在對(duì)OVX 大鼠模型進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌治療16 周后，發(fā)現(xiàn)其骨密度增加，骨小梁數(shù)量增加、厚度也增加，破骨細(xì)胞受到抑制。這表明與小鼠OVX 模型類(lèi)似，益生菌能夠有效調(diào)節(jié)大鼠OVX 模型中的破骨細(xì)胞[4]。

表1 益生菌/非益生菌與骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中的骨骼健康的作用機(jī)制

5 結(jié)論

骨質(zhì)疏松是一種發(fā)生率極高的骨骼并發(fā)癥，鑒于此今后科研工作重心不僅要關(guān)注如何緩解骨質(zhì)疏松，更需要重視對(duì)其的預(yù)防。益生菌能夠正向調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境，維持腸道菌群穩(wěn)定性，提高骨密度，增加骨小梁的數(shù)量。但如何提升益生菌的豐度和定植，提高菌群作用效率，減少有害菌的入侵，幫助預(yù)防骨質(zhì)流失等問(wèn)題仍需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。