基于葉綠素a 測(cè)定的監(jiān)測(cè)方法研究與改進(jìn)

何嘉偉

廣東省東莞生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，廣東 東莞 523000

葉綠素a 是浮游植物、藻類(lèi)及一些細(xì)菌中的重要色素，具有將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的作用。當(dāng)水體中葉綠素a 含量超標(biāo)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致藻類(lèi)大量繁殖，引發(fā)赤潮，降低水體透明度，威脅生態(tài)環(huán)境并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。因此，測(cè)定水體中葉綠素a 的濃度，可以精準(zhǔn)判斷水體的富營(yíng)養(yǎng)化程度，明確水體的光合作用能力及營(yíng)養(yǎng)狀況。

目前，葉綠素a 的測(cè)定方法主要有分光光度法[1]、熒光光度法和高效液相色譜法[2]。在實(shí)際操作中，分光光度法是比較常用的分析方法，然而，人們?cè)谶\(yùn)用分光法測(cè)定葉綠素a 濃度的過(guò)程中面臨著不少困擾，如：以9+1 丙酮為參比溶液，樣品吸光度出現(xiàn)負(fù)值情況；人工研磨操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，樣品飛濺問(wèn)題難以控制，操作誤差較大；此外，使用丙酮作為提取液極易揮發(fā)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員身體傷害較大，且會(huì)污染環(huán)境。因此，有必要對(duì)分光光度法進(jìn)行進(jìn)一步探究，以便于測(cè)定水質(zhì)中的葉綠素a 時(shí)更加高效且安全。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑與材料

本次實(shí)驗(yàn)用水為新鮮制備的去離子水，用到的試劑及各材料情況見(jiàn)表1。

表1 使用試劑及材料情況登記表

1.2 儀器和設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)所用到的儀器設(shè)備：CARY 60 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（配10 mm 石英比色皿）；F6/10 手持式高速勻漿機(jī)；離心機(jī)TG16-WS；過(guò)濾裝置HDG-6A。

2 實(shí)驗(yàn)方法

除以下實(shí)驗(yàn)部分外，本實(shí)驗(yàn)方法的具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容均依據(jù)HJ 897-2017 規(guī)定[1]進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)分為三部分：1）在測(cè)定過(guò)程中，將9+1 丙酮、經(jīng)過(guò)針式濾器的9+1 丙酮及空白試驗(yàn)樣品分別作為參比，分別在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm處測(cè)量其吸光度。2）分別采用玻璃研磨杵和手持式高速勻漿機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行研磨，使用9+1 丙酮將樣品浸泡提取2 h，離心后，以經(jīng)過(guò)針式濾器的9+1 丙酮為參比測(cè)量吸光度，計(jì)算實(shí)際樣品結(jié)果[3]。3）采用玻璃研磨杵對(duì)樣品進(jìn)行研磨，使用9+1 丙酮和95%乙醇分別浸泡提取，離心后，再分別以經(jīng)過(guò)針式濾器的9+1 丙酮和95%乙醇為參比測(cè)量吸光度[4-8]。

3 結(jié)果與討論

3.1 空白試驗(yàn)

按照HJ 897-2017 的操作要求[9]，對(duì)空白試樣進(jìn)行過(guò)濾—研磨—浸泡提取—離心過(guò)濾等操作。鑒于9+1 丙酮在使用過(guò)程中極易揮發(fā)，樣品經(jīng)過(guò)研磨—浸泡提取—離心過(guò)濾后，樣品管內(nèi)的丙酮含量遠(yuǎn)低于9+1，含水量升高，同時(shí)純度不高的丙酮中很可能含有黃色的丙酮酸，以9+1 丙酮為參比溶液，空白試樣在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 處均出現(xiàn)了負(fù)值的異常情況。

本實(shí)驗(yàn)又以經(jīng)過(guò)針式濾器的9+1 丙酮和試驗(yàn)空白樣品分別為參比，對(duì)空白試樣進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各吸光度結(jié)果為負(fù)值的情況均得到了改善。不同參比溶液的空白試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同參比溶液的空白試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

3.2 研磨方式

使用玻璃研磨杵手工研磨需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力，故而僅適用于小批量樣品處理，難以滿足高批量的實(shí)驗(yàn)需要。同時(shí)，手工研磨的不可控性，決定了樣品研磨可能不均勻，會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。此外，手工研磨需要較高的技術(shù)水平和極強(qiáng)的耐心，對(duì)人員操作水平的要求較高[10]。

本研究對(duì)使用玻璃研磨杵手工研磨方式與搗碎濾紙后使用手持式高速勻漿機(jī)的半自動(dòng)研磨方式進(jìn)行比較，測(cè)試不同研磨方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，玻璃研磨杵操作簡(jiǎn)單，破壁充分，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，丙酮使用過(guò)程中揮發(fā)嚴(yán)重且溶液飛濺，有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)；而使用手持式高速勻漿機(jī)操作簡(jiǎn)單，破壁充分，且省時(shí)省力，能夠減少丙酮飛濺，有利于降低實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)。其詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同研磨方式的實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果（單位：μg/L）

3.3 提取液種類(lèi)

經(jīng)查閱相關(guān)資料了解到，葉綠素a 可溶于丙酮、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑中，考慮到丙酮試劑受公安部管制且使用過(guò)程中存在安全風(fēng)險(xiǎn)，而乙醇容易獲得且無(wú)毒安全，故本實(shí)驗(yàn)使用95%乙醇作為提取液與標(biāo)準(zhǔn)要求的9+1 丙酮提取液進(jìn)行比對(duì)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，使用95%乙醇提取液的浸提效果與9+1 丙酮相當(dāng)，同時(shí)也能解決參比溶液調(diào)零后吸光度為負(fù)值的問(wèn)題。其詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同提取液的實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果（單位：μg/L）

4 結(jié)論

使用9+1 丙酮作為參比溶液時(shí)對(duì)空白試樣進(jìn)行測(cè)量和對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 處均出現(xiàn)了吸光度為負(fù)值的異常情況，而采用經(jīng)過(guò)針式濾器處理的9+1 丙酮或空白樣品作為參比溶液，可以有效改善空白試樣的負(fù)值問(wèn)題。

本文對(duì)比了使用玻璃研磨杵和手持式高速勻漿機(jī)兩種不同研磨方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。研究結(jié)果表明，手持式高速勻漿機(jī)操作簡(jiǎn)單，效率高且更加安全，能夠有效降低實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)。因此，運(yùn)用分光光度法時(shí)應(yīng)使用手持式高速勻漿機(jī)進(jìn)行研磨處理，以獲得更加準(zhǔn)確且可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)比對(duì)，使用95%乙醇與9+1 丙酮提取液浸提效果相當(dāng)，故而，95%乙醇可取代受管制的丙酮用作提取試劑。此外，使用95%乙醇還能有效解決參比溶液調(diào)零后吸光度為負(fù)值的問(wèn)題。因此，建議使用95%乙醇作為9+1 丙酮的替代試劑，應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域中。