低溫脅迫對(duì)辣椒果實(shí)形態(tài)和抗氧化酶系統(tǒng)的影響

邵登魁,鄧昌蓉,王亞玲,文軍琴,3,張彥君

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016;2.青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016;3.青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)

辣椒(CapsicumannuumL.)屬茄科辣椒屬植物[1],冬春季辣椒生產(chǎn)主要在日光溫室中,由于青海省為高原溫帶、高原亞寒帶和寒帶氣候[2],所以辣椒易受低溫影響。辣椒受到低溫脅迫后,會(huì)出現(xiàn)生理代謝紊亂、形態(tài)發(fā)育失調(diào)、生活力下降、植株發(fā)育遲緩和生殖生長(zhǎng)失調(diào)[3]。根據(jù)報(bào)道,當(dāng)植物遭遇逆境脅迫時(shí),細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧和自由基,其大量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害,為了確保生長(zhǎng)發(fā)育,植物體會(huì)激活主動(dòng)防御系統(tǒng)。

本試驗(yàn)選擇了青海省廣泛種植的兩個(gè)辣椒品種:華美105和樂都長(zhǎng)辣椒為試驗(yàn)材料,在人工氣候培養(yǎng)箱中對(duì)其進(jìn)行低溫處理,測(cè)定其生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)中的酶活性變化,研究低溫脅迫對(duì)辣椒果實(shí)形態(tài)及生理特性的影響,旨在為辣椒抗低溫冷害育種和?；ū９夹g(shù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇兩種耐低溫性不同的辣椒品種材料:樂都長(zhǎng)辣椒(耐低溫結(jié)實(shí)性弱)和華美105(耐低溫結(jié)實(shí)性強(qiáng)),其中樂都長(zhǎng)辣椒的種子由青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝所提供,華美105種子由山東省春禾種業(yè)公司提供。每個(gè)品種育苗150株,在辣椒4葉1心期時(shí)轉(zhuǎn)入人工氣候箱中進(jìn)行不同溫度處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)品種4個(gè)處理,每處理設(shè)3次重復(fù),每個(gè)處理樣本量為50株;試驗(yàn)條件如表1。培養(yǎng)箱低溫處理25 d后移栽到大田,進(jìn)行后續(xù)觀察。試驗(yàn)在青海省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所3號(hào)試驗(yàn)園及青海省蔬菜遺傳與生理實(shí)驗(yàn)室中開展。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 植物形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

株高用直尺(20 cm)測(cè)量;展葉數(shù)是對(duì)全株葉長(zhǎng)大于2 cm的葉片數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);鮮重用千分之一電子天平稱重,將鮮株體置于電加熱恒溫鼓風(fēng)爐中,在105 ℃下殺青30 min,然后在80 ℃下烘干,用電子天平稱量植株干重。

1.2.3 辣椒花芽分化及花器官觀察

花器官和幼果用OLYMPUS-SZX 7體視顯微鏡觀察拍照。分別于初現(xiàn)蕾期、開花前3 d、開花當(dāng)日、開花1日、開花3日和開花5日進(jìn)行觀察。

1.2.4 生理指標(biāo)測(cè)定

可溶性糖測(cè)定采用蒽酮比色法[4];葉綠素含量測(cè)定采用乙醇法[5];超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定和氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定參考陳建勛等的方法[6-7];過氧化物酶(POD)活性測(cè)定參考《植物生理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》的方法;抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測(cè)定參考趙世杰等的方法[8]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算;采用Origin 2019 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)辣椒花器官顯微結(jié)構(gòu)的影響

如圖1A所示,樂都長(zhǎng)辣椒部分胚珠壞死,只有授粉管伸長(zhǎng)正常的部位胚珠發(fā)育比較正常,其余胚珠大量壞死呈褐色。結(jié)合對(duì)照分析,樂都長(zhǎng)辣椒花朵脫落是低溫環(huán)境造成辣椒授粉不完全,胚珠發(fā)育受阻,導(dǎo)致大部分胚珠壞死,從而影響辣椒子房發(fā)育,造成結(jié)果期落果現(xiàn)象的發(fā)生。樂都長(zhǎng)辣椒在低溫條件下落花落果的可能原因是低溫影響花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng),導(dǎo)致胚珠受精不良而敗育,進(jìn)而引起子房體發(fā)育不良或停止。從圖2和圖3比較可以看出,在低溫脅迫下,樂都長(zhǎng)辣椒在開花后子房體發(fā)育緩慢,花瓣脫落晚(圖2e,圖2f),而華美105花瓣在開花后3日就萎蔫脫落(圖3e),開花后5日子房體明顯長(zhǎng)大(圖3f),二者的差異可能就來源于受精或花粉管生產(chǎn)刺激與否。由于華美105屬于耐低溫結(jié)實(shí)性品種,試驗(yàn)當(dāng)季未發(fā)生明顯的落花落果現(xiàn)象,而樂都長(zhǎng)辣椒不耐低溫結(jié)實(shí),發(fā)生了落花落果。

圖1 低溫處理下樂都長(zhǎng)辣椒脫落花器官圖Fig.1 Low temperature treatment led to the fall of the long pepper shedding flower organ map

圖2 低溫脅迫下樂都長(zhǎng)辣椒花器官結(jié)構(gòu)Fig.2 Ledulong peppe flower organ structure under low temperature stress

圖3 低溫脅迫下華美105花器官結(jié)構(gòu)Fig.3 Huamei 105 flower organ microstructure under low temperature stress

2.2 低溫脅迫對(duì)辣椒表型及生物量的影響

由圖4可知,低溫對(duì)辣椒表型有明顯的影響,在低溫處理下,兩種材料生長(zhǎng)變緩。華美105辣椒在處理25 d后株高、完全功能葉片數(shù)、鮮重、干重較對(duì)照分別降低63%、39.3%、63.5%、73.7%;樂都長(zhǎng)辣椒在低溫處理25 d后株高、完全功能葉片數(shù)、鮮重、干重較對(duì)照分別降低50%、30%、64.9%、71.4%。但是華美105在低溫條件下生物量積累優(yōu)于樂都長(zhǎng)辣椒,其它指標(biāo)樂都長(zhǎng)辣椒受溫度影響比華美105較小。由此看見,低溫條件下兩個(gè)品種的株高、功能葉片數(shù)、鮮重、干重均低于對(duì)照。

圖4 不同溫度處理對(duì)辣椒株高、完全功能葉數(shù)、鮮重、干重的影響Fig.4 The effects of high,leaf,fresh weight,and dry weight of chili pepper were treated at different temperatures

2.3 低溫脅迫對(duì)辣椒葉綠素含量及可溶性糖含量的影響

由圖5a可知,常溫條件下兩個(gè)品種葉綠素含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加,25 d時(shí)都達(dá)到最大值。低溫處理下兩個(gè)品種葉綠素含量呈先降低后升高的趨勢(shì),在低溫處理的第10 d時(shí)兩個(gè)品種的葉綠素含量值均最低,然后又隨著時(shí)間延長(zhǎng)葉綠素含量逐漸增加,但是低溫處理的葉綠素含量始終低于常溫條件下兩個(gè)品種葉綠素含量,且華美105的葉綠素含量始終高于樂都長(zhǎng)辣椒。

圖5 不同溫度處理對(duì)辣椒葉綠素和可溶性糖含量的影響Fig.5 Effects of different temperature treatments on the content of capsaicin and soluble sugars

由圖5b可知,常溫下隨著時(shí)間的推移,兩個(gè)材料的可溶性糖含量整體上均呈先上升后下降趨勢(shì);而低溫下兩種材料可溶性糖含量呈現(xiàn)先降低再緩緩增加后降低的趨勢(shì),5 d后降低到最小,但是兩個(gè)品種低溫處理的可溶性糖含量始終明顯低于常溫條件下可溶性糖含量。

由此可知,低溫處理可使得葉綠素含量和可溶性糖含量下調(diào),兩個(gè)品種相比,華美105葉綠素含量和可溶性糖含量降幅相對(duì)較小,說明樂都長(zhǎng)辣椒中葉綠素含量和可溶性糖變化對(duì)低溫處理更敏感。

2.4 低溫脅迫對(duì)辣椒抗氧化酶活性的影響

由圖6可知,低溫條件下,隨著生長(zhǎng)期延伸,兩個(gè)品種辣椒葉片中 SOD活性均是先下降后上升的趨勢(shì),且培育15 d后達(dá)到最低值。與華美105相比,樂都長(zhǎng)辣椒中SOD活性受溫度影響變化更加明顯,變化幅度更大。低溫條件下, 兩個(gè)品種的POD活性均是先升高后下降,低溫處理的POD活性均高于常溫的兩個(gè)品種。兩個(gè)品種CAT活性整體上表現(xiàn)出先降低后升高趨勢(shì),低溫條件與常溫條件相比CAT酶活性明顯降低,且樂都長(zhǎng)辣椒低溫處理后變化幅度更加明顯。在低溫條件下,兩個(gè)品種的APX活性在常溫條件下表現(xiàn)出先下降后升高再下降的趨勢(shì)。APX活性在處理的前10 d酶活性降低,之后與常溫條件酶活性變化趨勢(shì)一致。

圖6 不同溫度處理對(duì)辣椒抗氧化酶活性的影響Fig.6 Effects of different temperature treatmented on antioxidant enzyme activity of chili pepper

由此可知,低溫處理下,除POD酶活性增強(qiáng)外,其它3種抗氧化酶活性均降低。整體上樂都長(zhǎng)辣椒抗氧化酶活性對(duì)低溫響應(yīng)更敏感。

3 討論與結(jié)論

綜上所述,通過對(duì)兩種耐低溫辣椒品種進(jìn)行低溫脅迫處理發(fā)現(xiàn),華美105不像樂都長(zhǎng)辣椒,當(dāng)季未發(fā)生明顯的落花落果現(xiàn)象;兩個(gè)品種的株高、功能葉片數(shù)、鮮重、干重均低于對(duì)照;華美105葉綠素、可溶性糖、SOD、CAT和APX含量降幅相對(duì)小,整體上樂都長(zhǎng)辣椒對(duì)低溫響應(yīng)更敏感。

通過本研究發(fā)現(xiàn),低溫敏感型品種樂都長(zhǎng)辣椒和耐低溫結(jié)實(shí)型品種華美105在花蕾期生長(zhǎng)速度基本一致,開花以后到花后5 d二者的發(fā)育速度明顯不一致,其表現(xiàn)為樂都長(zhǎng)辣椒子房體發(fā)育遲緩,花瓣脫落期延后,華美105在花后3 d花瓣脫落,第5 d子房體明顯長(zhǎng)大。對(duì)樂都長(zhǎng)辣椒低溫落果解剖發(fā)現(xiàn),子房體中只有少數(shù)胚珠顏色正常,其余胚珠全部褐化,由此可知低溫敏感型辣椒品種在冬季低溫設(shè)施條件下的落花落果可能是因?yàn)榛ǚ勖劝l(fā)和花粉管伸長(zhǎng)受阻,進(jìn)而不能完成受精作用或?qū)ε咧榇碳ざ率棺臃矿w發(fā)育畸形或停止,變現(xiàn)為果實(shí)變小皺縮和脫落。這一結(jié)果與王興娥[9]的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn),在低溫脅迫下,樂都長(zhǎng)辣椒和華美105的生長(zhǎng)均受到一定程度的影響,整體上低溫下華美105的生長(zhǎng)量積累要高于樂都長(zhǎng)辣椒,從葉片數(shù)和株高方面而言,樂都長(zhǎng)辣椒受到影響表現(xiàn)較低,這一結(jié)果和宋靜爽等[10]在辣椒苗期對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)的研究結(jié)果存在一定的差異,可能與本試驗(yàn)中處理時(shí)間長(zhǎng)度和處理溫度設(shè)置有關(guān),需進(jìn)一步驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)低溫處理會(huì)導(dǎo)致辣椒苗期葉綠素含量降低,這與常靜等[11]研究發(fā)現(xiàn)低溫弱光脅迫對(duì)辣椒葉片葉綠素光合熒光參數(shù)及部分生理特性均存在一定程度的影響一致。葉綠素作為光合作用的重要色素,其合成經(jīng)常會(huì)受到長(zhǎng)期亞低溫處理和短期低溫處理的影響。有研究表明,低溫導(dǎo)致葉綠素含量下降的觀點(diǎn)有兩種:一是葉綠素的減少,既是因?yàn)樯氐暮铣墒艿阶璧K,又是因?yàn)榈蜏貙?duì)葉綠素的傷害;二是低溫抑制了葉綠素的合成,而非葉綠素的破壞[12-14],本研究中低溫敏感品種葉綠素降低幅度大于耐低溫品種,結(jié)果一定程度上支持上述理論。本研究發(fā)現(xiàn)低溫敏感品種的可溶性糖在低溫條件下變化幅度很大,這可能是這類品種在低溫脅迫初期的應(yīng)激反應(yīng),因?yàn)榭扇苄蕴呛吭黾佑欣谔岣呒?xì)胞的修復(fù),所以低溫敏感品種可溶性糖含量應(yīng)激增加是為了保護(hù)細(xì)胞免遭低溫?fù)p傷,使植物體能夠完成正常的生理代謝;相對(duì)而言耐低溫品種的可溶性糖變幅較小,其應(yīng)激反應(yīng)比較溫和。

低溫脅迫使植物體產(chǎn)生破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、膜結(jié)構(gòu)和核酸等細(xì)胞成分的活性氧,植物體細(xì)胞通過生成SOD、POD、CAT等小分子抗氧化酶,消除自由基使之保持在一定水平,防止活性氧對(duì)植物造成過度傷害[15]。研究中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種低溫脅迫下SOD和CAT活性是先降低后增高,POD和APX活性是先增高后降低,整體上華美105在低溫脅迫下四種酶活性變化幅度均小于樂都長(zhǎng)辣椒,反映了兩種不同抗性辣椒品種之間的應(yīng)激酶活性差異。吳琴等對(duì)抗氧化酶活性的研究發(fā)現(xiàn),SOD能通過歧化作用將有害環(huán)境中產(chǎn)生的超氧自由基去除,避免植物體內(nèi)O2-和H2O2結(jié)合,最終形成羥自由基-OH,對(duì)細(xì)胞造成損傷[16]。SOD催化歧化反應(yīng)生成的H2O2可被其它酶去除,但CAT只存在于過氧化酶體中,而細(xì)胞質(zhì)中的H2O2不會(huì)被CAT清除,所以在細(xì)胞質(zhì)中存在的APX以抗壞血酸為底物來清除H2O2。在本試驗(yàn)中,POD活性在低溫處理全過程中都表現(xiàn)為高于對(duì)照,SOD、APX和CAT酶活性在低溫處理時(shí)均低于對(duì)照,說明辣椒可以通過抗氧化酶活性的提高來緩解低溫初期損傷。在低溫過程中兩個(gè)品種的SOD活性在短暫下降后又表現(xiàn)出上升,說明在其它抗氧化酶作用變?nèi)鹾骃OD才啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制,但隨著脅迫作用的不斷持續(xù),POD和APX保護(hù)作用逐漸降低,而CAT作為抗氧化酶體中的保護(hù)性機(jī)制也同時(shí)啟動(dòng),SOD的作用也持續(xù)加強(qiáng),形成比較持久的保護(hù)機(jī)制。

筆者對(duì)低溫處理后移栽至田間的辣椒落花現(xiàn)象進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):樂都長(zhǎng)辣椒85%的門椒脫落,而對(duì)椒未受到低溫影響表現(xiàn)正常生長(zhǎng);華美105門椒未脫落,說明低溫脅迫早期容易造成落花落果,隨著多個(gè)抗氧化保護(hù)機(jī)制的啟動(dòng),植株在一定程度上可以適應(yīng)低溫,從而減少落花落果,耐低溫結(jié)實(shí)品種表現(xiàn)更加優(yōu)良。下一步將對(duì)低溫脅迫下辣椒落花、假果形成過程中內(nèi)源激素水平,以及不同品種相應(yīng)低溫關(guān)鍵基因表達(dá)水平方面開展研究,為今后的育種工作提供更加科學(xué)的理論支持。