不同熱處理方式對牛奶乳清蛋白的影響

摘 要：目的：比較不同熱處理方式對牛奶中乳清活性蛋白的影響。方法：以奶場牛乳、巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌（UHT）乳和蒸汽侵入式直接殺菌（INF）乳4種不同熱處理方式的牛奶作為研究對象，觀察4種牛奶活性蛋白含量及熱處理后牛奶中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量等的變化情況；采用SEM、FTIR、熒光光譜分析儀和Malvern納米粒度儀分析微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果：4種熱處理牛奶中，奶場牛乳的乳清蛋白含量最高，INF殺菌乳與巴氏殺菌乳中乳清蛋白含量和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量相當；UHT滅菌乳的粒徑及其乳清蛋白極性環(huán)境均顯著增加；4種牛奶乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲逐漸增加，乳清蛋白結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)化。結(jié)論：蒸汽侵入式直接殺菌對乳清活性蛋白的損傷程度小于超高溫瞬時滅菌，與巴氏殺菌相當，且此方法處理的牛乳保存期高于巴氏殺菌乳。

關(guān)鍵詞：熱處理；乳清蛋白；巴氏殺菌；超高溫瞬時滅菌；蒸汽侵入式直接殺菌

牛奶營養(yǎng)成分豐富，是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾臓I養(yǎng)來源之一[1-5]。為消滅牛奶中對人體有害的微生物和酶，工業(yè)生產(chǎn)中會對牛奶進行熱處理[6]，而牛奶中的乳清蛋白經(jīng)熱處理后極易發(fā)生變性，使其活性蛋白喪失活性。巴氏殺菌和超高溫瞬時滅菌（UHT）仍是國內(nèi)外目前乳制品熱處理的主要方式[7]，隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的不斷發(fā)展，蒸汽侵入式直接殺菌（INF）技術(shù)成為目前國際上一種先進的牛奶殺菌方式，該技術(shù)將牛乳在159℃、0.09 s條件下瞬時加熱，采用此技術(shù)制備牛奶，對蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的破壞度小，營養(yǎng)成分保留更高，口感更新鮮[8]。美拉德反應(yīng)是液態(tài)乳殺菌過程中的重要反應(yīng)之一，其產(chǎn)物會對乳品質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。美拉德反應(yīng)的兩個產(chǎn)物糠氨酸和羥甲基糠醛（HMF），分別是作為反應(yīng)指示物的初始產(chǎn)物，以及作為反應(yīng)進行程度評價指標的中間產(chǎn)物[9]。乳果糖可鑒別不同熱處理牛乳，目前國際上通常用糠氨酸和乳果糖作為評估熱處理對奶制品質(zhì)量影響的指標[10]。本研究通過對INF殺菌乳及其他3種常見熱處理滅菌乳的研究，分析不同熱處理方式對牛奶乳清蛋白的影響，包括活性蛋白組成、含量及微觀結(jié)構(gòu)的改變，從而提高消費者對熱處理滅菌乳的認識，改變消費理念，這也與我國目前提倡的“國家優(yōu)質(zhì)乳工程”相契合[11]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津；pH計（精度0.1）；離心機（轉(zhuǎn)速≥10 000 r/min）；ME204分析天平，METTLEER TOLEDO；1600PC紫外-可見分光光度計，上海普美達；S-3400N掃描電子顯微鏡（SEM），HITACHI；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀，SHIMADZU；日立F-2700熒光光譜分析儀；Zetasizer Nano S90納米粒度測定儀，Malvern；FW-4A 粉末壓片機，天津托普儀器有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器。

1.2 材料與試劑

磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙酸銨、辛醇、過氧化氫（質(zhì)量分數(shù)為30%）、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、硫酸銨、硫酸鎂（均為分析純）；冰醋酸（優(yōu)級純，室溫保存）、三氟乙酸（色譜純，99.9%，4℃保存）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、肝素親和柱（4℃冰箱內(nèi)儲存）。

1.3 牛奶樣品的采集和熱處理

奶場牛乳：當天采集，不進行任何熱處理；巴氏殺菌乳：取奶場牛乳于65℃的水浴鍋中加熱30 min；INF殺菌乳：取奶場牛乳在157℃的條件下加熱0.09 s；UHT滅菌乳：取奶場牛乳于137℃下加熱處理4 s。

1.4 乳清蛋白的制備

將1.3中的4種熱處理牛奶樣品進行離心脫脂，離心條件為4℃、10 000 r/min離心10 min，棄去上層脂肪后得到脫脂乳。利用酸等電點沉淀離心法制備乳清蛋白：用1 mol/L HCL將脫脂乳的pH調(diào)至4.6，于4℃、5 000 r/min離心20 min[12]，取上清液密封置于-20℃冰箱內(nèi)待測。

1.5 乳清蛋白中活性蛋白的檢測方法

1.5.1 免疫球蛋白的測定 精確稱取各樣品20 g（精確到0.001 g）置于50 mL容量瓶中，加入適量pH為6.5的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（流動相A），超聲提取20 min，冷卻至室溫后用pH為2.5的甘氨酸鹽酸緩沖液（流動相B）定容，搖勻后將樣品移至離心管4℃ 10 000 r/min離心10 min。取過濾液2.5 mL，通過Pharmacia HI-Trap Protein G柱凈化后定容至1.5 mL，液相色譜分析。采用色譜柱CAPCELL PAK C18（4.6m mL.D.×250 mm，5 μm）等度洗脫，流動相為乙腈：0.1%三氟乙酸=6：4，流速為1 mL/min，進樣體積為20 μL，在紫外280 nm下進行檢測。

1.5.2 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的測定 參考河北省奶業(yè)協(xié)會發(fā)布的《活性蛋白牛乳（牛）》中的方法對4種牛奶中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行測定[13]。取1.4中制備的4種乳清蛋白各1 mL稀釋10倍后，過0.22 μm濾膜，上機待測。采用色譜柱：BEH300 C4（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，300 ），進行梯度洗脫分離。流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液、流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈，流速為0.3 mL/min，進樣體積為10 μL，在紫外280 nm下檢測。

1.5.3 乳鐵蛋白的測定 （1）配制由84 mmol/L Na2HPO4和16 mmol/L NaH2PO4制成的結(jié)合緩沖液。（2）精確稱取5 g牛奶樣品于100 mL三角瓶中，加入30 mL結(jié)合緩沖液渦旋振蕩1 min后移至50 mL容量瓶，加入結(jié)合緩沖液定容；（3）將樣本移至離心管，離心條件為4℃、12 000 r/min、10 min，使用移液器輕輕吸出10～30 mL中間液作為樣品提取液；（4）配制由42 mmol/L NaH2PO4、8 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaCl制成的淋洗液以及由42 mmol/L NaH2PO4、8 mmol/L NaH2PO4、1 mol/L NaCl制成的洗脫液；（5）加5 mL結(jié)合緩沖溶液于肝素親和柱內(nèi)進行平衡，加樣品提取液，待其完全流出后，加入10 mL淋洗液，并棄去全部流出液，再加入2.5 mL洗脫液，收集全部流出液，并定容至3.5 mL，過濾膜供液相色譜檢測用。（6）采用色譜柱：BEH300 C4（Waters，100 mm×2.1 mm，1.7 μm，300 ）進行梯度洗脫。流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液、流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈，流速為0.45 mL/min，進樣體積為10 μL，在紫外280 nm下檢測。

1.6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的測定

1.6.1 糠氨酸的測定 參考NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》測定糠氨酸含量[14]。吸取1.3中4種不同熱處理的牛奶各2 mL和10.6 mol/L鹽酸溶液6 mL一同加入密閉耐熱試管中，混勻后將試管置于干燥箱，110℃下加熱水解12 h以上，加熱結(jié)束后，冷卻過濾，濾液為水解液。吸取1 mL水解液于試管中，加入6 g/L乙酸銨溶液5 mL，混勻后過0.22 μm水相濾膜，濾液上機測定。采用色譜柱：C18硅膠色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）梯度洗脫、流動相A為0.1%三氟乙酸溶液、流動相B為甲醇，流速為1 mL/min，進樣體積為10 μL，在紫外280 nm下檢測。

1.6.2 表面巰基含量的測定 采用Ellman’s 5，5’-雙硫代雙（2-硝基苯甲酸，DTNB）法測定不同熱處理后乳清蛋白溶液的表面巰基含量。稱取適量樣品，溶于蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，吸取1 mL蛋白溶液，加入4.0 mL Tris-甘氨酸緩沖液I和50 μL Ellman’s試劑，混合均勻后于37℃恒溫培養(yǎng)15 min；并于412 nm波長下測定吸光度[15]。

1.7 乳果糖的測定

參考NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》測定乳果糖含量[14]。

1.8 乳清蛋白微觀特性研究

1.8.1 粒徑的測定 室溫下采用Malvern納米粒度測定儀進行粒徑分布的測定。將4種乳清蛋白樣品用去離子水稀釋5倍，調(diào)整顆粒折射率為1.59，分散劑折射率為1.33，分散劑吸收率為0.887 2。

1.8.2 熒光光譜分析 將4種乳清蛋白溶液用去離子水稀釋適當?shù)谋稊?shù)，設(shè)置激發(fā)波長為290 nm，在此波長下進行發(fā)射波長的掃描，掃描光譜范圍為300～450 nm，掃描速度為60 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.8.3 掃描電子顯微鏡的測定 取1.4中4種熱處理牛奶乳清蛋白各5 mL樣品平鋪于培養(yǎng)皿中，冷凍干燥48 h制成凍干粉。用稱量勺挑取少量凍干粉樣品置于粘有雙面膠的樣品臺上，用洗耳球吹去附著的和未固定牢的樣品，噴金120 s后用掃描電鏡觀察。

1.8.4 紅外光譜儀的測定 采用傅里葉變換紅外光譜儀測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[16]。準確稱取1.5 mg 1.8.3中的凍干粉樣品置于瑪瑙研缽中，再稱取150 mg干燥的溴化鉀（樣品：溴化鉀=1：100），研磨均勻后用壓片機制成供試片備用。測定時將供試片置于紅外光譜儀的樣品光路中，設(shè)置分辨率為4 cm-1，在波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1進行掃描，掃描次數(shù)為32次，利用Origin 2021對紅外光譜進行分峰擬合計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳清蛋白中活性蛋白的檢測結(jié)果

如圖1可知，奶場樣品中乳清活性蛋白總量在4種不同熱處理樣品中最高，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量均為最高，分別為1 413.3 、4 024.4 mg/L。UHT滅菌乳中乳清活性蛋白總量最低，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量均為最低，分別為116.2、378.9 mg/L，且乳鐵蛋白和免疫球蛋白基本沒有檢出。INF殺菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的含量與巴氏殺菌乳相當，但免疫球蛋白含量低于巴氏殺菌乳。從4種不同熱處理牛奶中乳清活性蛋白的含量可以看出，隨著熱處理溫度的升高和時間的增加，乳清蛋白中活性蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢。

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果分析

由表1可知，奶場樣品中乳果糖和糠氨酸含量均為最低，分別為7.25 、3.65 mg/100 g；巴氏殺菌乳和INF殺菌乳中兩者含量基本相當；UHT滅菌乳中兩者含量均為最高，分別為13.97 、166.3 mg/100 g，其中糠氨酸含量是其他熱處理牛奶的10倍以上。Leen Mortier等[17]對比利時市場上的各種奶類共154個奶樣進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UHT滅菌乳中的平均乳果糖和糠氨酸含量是巴氏殺菌乳中的10倍以上，具有顯著性差異，這也與本實驗的結(jié)果一致。由圖2可知，UHT滅菌乳中表面巰基含量最高，為52.7 μmol/L，奶場樣品中含量最低，為17.5 μmol/L，巴氏殺菌乳和INF殺菌乳中表面巰基含量相當，分別為27.8 、32.9 μmol/L。牛乳中約90%的巰基位于β-乳球蛋白上，每個β-乳球蛋白單體均含有1個游離巰基及2個二硫鍵，β-乳球蛋白隨著熱處理溫度的升高以及加熱時間的增加，發(fā)生熱變性，從而使其分子鏈展開，將其巰基暴露出來，故表面巰基的含量逐漸增加[18-19]。

2.3 不同熱處理對乳清蛋白微觀特性的影響

2.3.1 對乳清蛋白粒徑的影響 由圖3可知，4種不同熱處理的牛奶樣品中，UHT滅菌乳的乳清蛋白平均粒徑最大，其次是INF殺菌乳，巴氏殺菌乳和奶場樣品的乳清蛋白平均粒徑大小相當。粒徑是影響牛奶穩(wěn)定性的重要因素之一，不同熱處理方式牛奶中的乳清蛋白會發(fā)生不同程度的變性，導(dǎo)致蛋白的平均粒徑發(fā)生變化，這可能是因為乳清蛋白分子之間生成凝聚物[20]。

2.3.2 對乳清蛋白熒光強度的影響 由表2可知，本試驗中4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白最大熒光強度均＞330 nm，由Halder U C等[21]的研究可知，最大熒光強度值反映色氨酸殘基的微環(huán)境，當色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中時，最大熒光強度值＞330 nm，故本實驗4種熱處理牛奶的乳清蛋白均處于極性環(huán)境中。與奶場樣品相比，巴氏殺菌乳和INF殺菌乳的最大熒光強度值無明顯變化，而UHT滅菌乳的乳清蛋白最大熒光強度大于其他3種熱處理奶樣，可能是因為UHT滅菌乳經(jīng)高溫較長時間熱處理后，導(dǎo)致維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的疏水相互作用被破壞，蛋白的極性環(huán)境增加[20]。3種熱處理牛奶相較奶場樣品其乳清蛋白熒光強度均有降低，雖然INF殺菌乳熱處理溫度最高，但其加熱時間不足1 s，明顯小于UHT滅菌乳的加熱時間，故UHT滅菌乳蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞嚴重，其熒光強度降低最為顯著[22]。

2.3.3 不同熱處理牛奶乳清蛋白在掃描電鏡（SEM）下的微觀結(jié)構(gòu) 圖4為4種不同熱處理牛奶乳清蛋白的掃描電鏡圖，其中圖A為未經(jīng)熱處理的奶場樣品，可以看出其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)大小比較均勻，表面比較光滑。與圖A相比，圖B到圖D開始呈現(xiàn)更不規(guī)則且無序的結(jié)構(gòu)，其中UHT殺菌乳的乳清蛋白結(jié)構(gòu)明顯增大且有片層出現(xiàn)，這可能是因為高溫較長時間的加熱可以破壞蛋白質(zhì)非共價力，導(dǎo)致多層聚集體和大聚集體的形成[23]。Long G等[24]對大豆蛋白進行干熱處理，掃描電鏡結(jié)果也顯示樣品呈現(xiàn)出多層片狀的破碎結(jié)構(gòu)。

2.3.4 不同熱處理牛奶乳清蛋白的傅里葉紅外光譜分析 參考相關(guān)文獻可知，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，1 645～1 658 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 665～1 680 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在1 640～1 644 cm-1和1 681～1 690 cm-1，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在1 659～1 664 cm-1[25]。采用Omnic 8.2軟件得到4種不同熱處理牛乳乳清蛋白的紅外光譜分析圖，再用PeakFit 4.2計算各二級結(jié)構(gòu)含量。由圖5可知，隨著熱處理溫度的升高，1 600～1 700 cm-1間子峰的強度發(fā)生改變，說明4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。結(jié)合表3可得，奶場樣品的α-螺旋結(jié)構(gòu)最多，為39.06%，經(jīng)過UHT滅菌后，其含量降低至13.81%，隨著溫度和熱處理時間的增加，α-螺旋有著明顯降低的趨勢。巴氏殺菌乳和INF殺菌乳的二級結(jié)構(gòu)組成基本相當。從表3還可以看到，無規(guī)則卷曲在奶場樣品中最低為7.02%，在UHT滅菌乳中組成最高，為29.61%。蛋白質(zhì)分子外部環(huán)境變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變，使其發(fā)生構(gòu)象改變和折疊[26]。α-螺旋是最常見也是最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，隨著熱處理溫度的升高，α-螺旋的逐漸減少可能是由于蛋白熱變性導(dǎo)致α-螺旋氫鍵斷裂，發(fā)生解螺旋。無規(guī)則卷曲的增多表明，乳清蛋白結(jié)構(gòu)的隨機性隨熱處理增強，使有序結(jié)構(gòu)逐漸向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[27]。

3 結(jié)論

本試驗通過對4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白含量、微觀結(jié)構(gòu)及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量等方面進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）奶場牛奶乳清活性蛋白總量最高，UHT滅菌乳含量最低。INF殺菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的含量與巴氏殺菌乳相當。（2）UHT滅菌乳中糠氨酸和乳清蛋白溶液表面巰基含量均明顯高于其他3種熱處理奶樣，乳果糖含量略高于其他3種奶樣。INF殺菌乳中乳果糖、糠氨酸及表面巰基含量均與巴氏殺菌乳相當。（3）4種熱處理牛奶中，巴氏殺菌乳、INF殺菌乳及UHT滅菌乳的粒徑大小較奶場樣品有不同程度的增加，其中UHT滅菌乳的增加最為顯著；UHT滅菌乳中乳清蛋白極性環(huán)境的增加大于其他3種熱處理牛奶。（4）隨著熱處理時間和溫度的增加，4種牛奶乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋逐漸減少，無規(guī)則卷曲逐漸增加，乳清蛋白結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)化。INF殺菌乳和巴氏殺菌乳的變性趨勢基本一致，優(yōu)于UHT滅菌乳。

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Effects of Different Heat Treatments on Whey Protein in Milk

YUE Shu-qin1，2，HUANG Jian1，2，WANG Shi-jie3，WANG Li-juan1，2，HE Li1，2，TANG Yan-bin1，2

（1National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China；

2Key Laboratory of Trace Element and Nutrition，National Health and Family Planning Commission of the People’s

Republic of China，Beijing 100050，China；3Shijiazhuang Junlebao Dairy Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050221，China）

Abstract：ObjectiveTo compare the effects of different heat treatments on the active protein in milk.MethodRaw milk，pasteurized milk，UHT milk and INF milk were used to study the content of whey protein and Maillard reaction products.The microstructure was analyzed by SEM，F(xiàn)TIR，fluoroanalyzer and Malvern Mastersizer.ResultRaw milk had the highest whey protein content among the four heat-treated milks.The content of whey protein and Maillard reaction products in INF milk was similar to that in pasteurized milk.Both of the particle size of UHT milk and the polar environment of whey protein increased significantly.Random curl in the secondary structure of four kinds of milk whey protein was gradually increased，and the whey protein structure was transformed from order to disorder.ConclusionThe damage degree of whey protein by direct stream infusion was less than that by UHT，which was similar to pasteurization，the shelf life of milk treated by this method was higher than pasteurized milk.

Keywords：heat treatment; whey protein; pasteurization;UHT; INF

基金項目：中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會項目“不同工藝牛奶中活性蛋白研究”。

作者簡介：岳淑琴（1997— ），女，在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

*共同通信作者：何 麗（1966— ），女，碩士，研究員，研究方向：營養(yǎng)與慢性病、營養(yǎng)健康教育；唐艷斌（1983— ），女，博士，副研究員，研究方向：營養(yǎng)干預(yù)與改善。