活血通絡(luò)膠囊對激素性股骨頭壞死大鼠腸道菌群影響的研究

【摘要】 背景 激素性股骨頭壞死（SONFH）是一種常見且致殘性高的疾病，活血通絡(luò)膠囊已被多次證明在防治股骨頭壞死上療效顯著，但是治療是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群目前少見研究。目的 建立SONFH大鼠模型并采用活血通絡(luò)膠囊進(jìn)行干預(yù)，分析比較各組大鼠腸道菌群的多樣性，篩選出SONFH特異性改變的菌屬并觀察活血通絡(luò)膠囊對腸道菌群的作用。方法 2022年4—10月選取雄性SD大鼠24只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（n=8）、模型組（n=8）、活血通絡(luò)組（n=8），建造SONFH模型，活血通絡(luò)組造模第3～28天給予0.63 g·kg-1·d-1活血通絡(luò)膠囊灌胃，空白組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。藥物干預(yù)結(jié)束后收集大鼠股骨進(jìn)行HE染色、Micro-CT分析。收集大鼠糞便進(jìn)行16S rDNA測序。采用α多樣性和β多樣性分析評估物種組間和組內(nèi)群落的多樣性及差異性，采用線性判別分析（LEfSe）比較三組大鼠腸道菌群差異。采用COG功能預(yù)測三組大鼠腸道菌群功能。結(jié)果 模型組空骨陷窩率高于空白組、活血通絡(luò)組（Plt;0.05）。模型組骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）低于空白組，骨小梁分離度（Tb.Sp）高于空白組（Plt;0.05）；活血通絡(luò)組BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于模型組，Tb.Sp低于模型組（Plt;0.05）。三組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，與空白組相比，模型組腸道菌群ASV數(shù)目增加；與模型組比較，活血通絡(luò)組腸道菌群ASV數(shù)目減少。模型組Shannon指數(shù)高于空白組（Plt;0.05）。β多樣性分析主坐標(biāo)分析（PCoA）圖顯示，三組樣本存在部分重疊，但是能區(qū)分三組的群落結(jié)構(gòu)。相似性分析結(jié)果顯示，組間差異大于組內(nèi)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R=2 062，P=0.01）。LEfSe分析結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組脫硫弧菌（Desulfovibrio）、Hafnia-Obesumbacterium、明串珠菌屬（Leuconostoc）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）豐度升高，擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬_UCG-001豐度降低（Plt;0.05）；與模型組比較，活血通絡(luò)組草酸桿菌屬（Oxalobacteraceae）、扭鏈胃球菌屬（Ruminococcus_torques_group）豐度升高，理研菌屬（Rekenella）、Kineothrix菌屬豐度降低（Plt;0.05）。三組大鼠COG功能預(yù)測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組菌群COG功能主要集中于碳水化合物運(yùn)輸與代謝、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；與模型組比較，活血通絡(luò)組功能集中于無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸與代謝，且復(fù)制、重組和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂和染色體分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能水平升高。結(jié)論 SONFH大鼠菌群多樣性較正常大鼠增加，增加的菌屬主要是致病菌屬，而相應(yīng)有益菌屬則出現(xiàn)減少。活血通絡(luò)膠囊可能通過改變腸道菌群的豐度和多樣性以及調(diào)控Oxalobacteraceae、Ruminococcus_torques_group等菌屬豐度而實(shí)現(xiàn)治療SONFH的目的。

【關(guān)鍵詞】 股骨頭壞死；激素性股骨頭壞死；活血通絡(luò)；活血通絡(luò)膠囊；腸道菌群；大鼠；生物多樣性

【中圖分類號】 R 681.8 R 242.294 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0144

【引用本文】 韋雨柔，田佳慶，肖方駿，等. 活血通絡(luò)膠囊對激素性股骨頭壞死大鼠腸道菌群影響的研究［J］. 中國全科醫(yī)學(xué)，2023，26（29）：3674-3682. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0144. ［www.chinagp.net］

WEI Y R，TIAN J Q，XIAO F J，et al. Effect of Huoxue Tongluo Capsule on intestinal flora of rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head［J］. Chinese General Practice，2023，26（29）：3674-3682.

Effect of Huoxue Tongluo Capsule on Intestinal Flora of Rats with Steroid-induced Osteonecrosis of the Femoral Head WEI Yurou1，2，TIAN Jiaqing1，2，XIAO Fangjun1，2，HE Xianshun1，2，ZHAN Zhiwei1，2，WEI Tengfei1，2，LIN Tianye2，3，HE Mincong2，3，WEI Qiushi2，3*

1.Third Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510378，China

2.Guangdong Research Institute for Orthopedics and Traumatology of Chinese Medicine，Guangzhou 510378，China

3.Department of Joint Orthopedics，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510378，China

*Corresponding author：WEI Qiushi，Associate chief physician；E-mail：weiqshi@126.com

【Abstract】 Background Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head（SONFH）is common and disabling. The efficacy of Huoxue Tongluo Capsule has been consistently demonstrated in the prevention and treatment of osteonecrosis of the femoral head，but there is no research on whether the treatment can be carried out by regulating the intestinal flora. Objective To establish SONFH rat model intervened by Huoxue Tongluo Capsule，analyze and compare the diversity of intestinal flora in each group of rats，screen out SONFH-specific altered bacterial genera and observe the effect of Huoxue Tongluo Capsule on intestinal flora. Methods 24 male SD rats were selected from April to October 2022 and divided into the blank group（n=8），model group（n=8）and Huoxue Tongluo group（n=8）by random number table method. The SONFH model was prepared. The Huoxue Tongluo group was given 0.63 g·kg-1·d-1 Huoxue Tongluo Capsule by gavage on the 3rd to 28th day of modeling. The blank group and model group were given an equal volume of 0.9% sodium chloride solution by gavage. After drug intervention，rat femurs were collected for HE staining and Micro-CT analysis. Rat feces were collected for 16S rDNA sequencing. α diversity analysis was used to evaluate species diversity，β diversity analysis was used to explore the similarity or dissimilarity of sample community composition，and linear discriminant analysis（LEfSe） was used to compare the differences of intestinal flora among the three groups. COG function was used to predict the intestinal flora function of the rats in the three groups. Results There were significant differences in the rate of empty bone lacunae among the three groups，and the rate of empty bone lacunae in the model group was higher than that in the blank group，while the rate of empty bone lacunae in the Huoxue Tongluo group was lower than that in the model group（Plt;0.05）. There were significant differences in the bone volume（BV/TV），bone trabeculae number（Tb.N），bone trabeculae thickness（Tb.Th）and bone trabeculae separation（Tb.Sp）among the three groups，and the BV/TV，Tb.N and Tb.Th of the model group were lower than those of the blank group，while the Tb.Sp of the model group was higher than that of the blank group（Plt;0.05）. The BV/TV，Tb.N，Tb.Th of the Huoxue Tongluo group were lower than those of the blank group，while the Tb.Sp was higher than that of the blank group（Plt;0.05）. There were significant differences in the intestinal flora structure of rats among the three groups，the number of intestinal flora ASVs in the model group was higher than the blank group，the number of intestinal flora ASVs in the Huoxue Tongluo group was lower than the model group（Plt;0.05）. There were significant differences in the Shannon index among the three groups，and the Shannon index in the model group was higher than the blank group（Plt;0.05）. The PCoA plot of β-diversity analysis showed that there was partial overlap among the three groups，but the community structure of the three groups could be distinguished. The results of similarity analysis showed that the differences among the groups were greater than that within groups，and the differences were statistically significant（R=2 062，P=0.01）. The results of LEfSe analysis showed that the abundances of Desulfovibrio，Hafnia-Obesumbacterium，Leuconostoc and Staphylococcus were increased，the abundances of Bacteroides and Prevotella _UCG-001 were decreased（Plt;0.05）. The abundances of Oxalobacteraceae and Ruminococcus_torques_group were increased and the abundances of Rekenella and Kineothrix were decreased in the Huoxue Tongluo group compared with the model group（Plt;0.05）. The prediction results of COG function in the three groups of rats showed that compared with the blank group，COG function of the model group mainly focused on carbohydrate transport and metabolism，inorganic ion transport and metabolism，amino acid transport and metabolism，lipid transport and metabolism，cell wall/membrane/envelope biogenesis. The function of the Huoxue Tongluo group focused on inorganic ion transport and metabolism，carbohydrate transport and metabolism，and the levels of replication，recombination and repair，transcription，cell cycle control，cell division，chromosome division，and cell motor function were increased compared with the model group. Conclusion The bacterial diversity of SONFH rats was higher than that of normal rats，and the increased bacteria genera was mainly pathogenic bacteria，with the decrease of corresponding beneficial bacteria genera. Huoxue Tongluo Capsule may achieve the therapeutic purpose of SONFH by changing the abundance and diversity of intestinal flora and regulating the abundance of Oxalobacteraceae，Ruminococcus_torques_group and other genera.

【Key words】 Femur head necrosis；Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head；Activating blood dredging collaterals；Huoxue Tongluo Capsule；Intestinal flora；Rats；Biodiversity

激素性股骨頭壞死（SONFH）為患者因患有免疫性疾病、風(fēng)濕性疾病等原因長時(shí)間或大量應(yīng)用激素所導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)疾病，治療難度大且易致殘［1］。SONFH病程呈進(jìn)行性發(fā)展，如果未得到及時(shí)治療，極易導(dǎo)致股骨頭塌陷，最終造成患者髖關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)及功能嚴(yán)重受限，人工髖關(guān)節(jié)置換將是不可避免的選擇［2-3］。因此，早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)、早治療對SONFH患者至關(guān)重要，選擇一種理想的治療方案也成為醫(yī)患共同關(guān)注的重要問題。隨著各項(xiàng)研究的深入，腸道菌群被學(xué)者發(fā)現(xiàn)與骨骼發(fā)育存在因果關(guān)系［4］，目前的研究主要集中于關(guān)節(jié)炎及骨質(zhì)疏松癥，且腸道菌群被認(rèn)為是骨與關(guān)節(jié)疾病新的治療靶點(diǎn)［5］。然而，SONFH 在腸道菌群機(jī)制方面的研究仍然較少。

中藥防治股骨頭壞死在臨床上已取得顯著成效，其中由木豆、當(dāng)歸、芍藥、紅花、桃仁、川芎、地黃7種草本植物組成的活血通絡(luò)膠囊在治療股骨頭壞死的前期研究中發(fā)揮了重要作用。本團(tuán)隊(duì)前期研究已發(fā)現(xiàn)臨床上使用活血通絡(luò)膠囊能緩解患者髖部疼痛并預(yù)防股骨頭塌陷的發(fā)生、發(fā)展［6-7］?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)膠囊能促進(jìn)人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化［8］。通過建立SONFH動(dòng)物模型，本團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)膠囊可改善SONFH動(dòng)物的股骨頭內(nèi)骨小梁結(jié)構(gòu)［9］。然而，關(guān)于活血通絡(luò)膠囊與腸道菌群的關(guān)系、活血通絡(luò)膠囊是否可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群治療SONFH尚不清楚。綜上所述，本研究旨在探究活血通絡(luò)膠囊對SONFH壞死大鼠腸道菌群的影響，為活血通絡(luò)膠囊在SONFH治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠24只，SPF級，12周齡，體質(zhì)量（275±25）g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號：SCXK（粵）2018-0034。所有大鼠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號為：SYXK（粵）2018-0001。實(shí)驗(yàn)前大鼠在溫度20～24℃、濕度50%～70%、12 h光照/黑暗周期交替的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間自由飲水。本研究通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號：20220117002）。

1.2 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 2022年4—10月。

1.3 主要試劑和儀器 活血通絡(luò)膠囊（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；批號：Z20071224），甲潑尼龍琥珀酸鈉（Pfizer Manufacturing Belgium NV；批號：H20170199），歐米伽糞便 DNA提取試劑盒（歐米伽生物技術(shù)公司；貨號：D4015-02），AxyPrep PCR Clean-up KitPCR純化試劑盒（愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；貨號：AP-GX-250），雙鏈DNA定量檢測試劑盒（美國Thermo Fisher公司；貨號：P7589），蘇木素/伊紅染色（HE染色）試劑（飛凈生物科技有限公司；貨號：PH0516），中性樹膠（飛凈生物科技有限公司；貨號：PH0407）；Qubit2.0型熒光定量PCR儀、Multiskan SkyHigh型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），TP1020型自動(dòng)臺(tái)式組織脫水機(jī)、HistoCore Arcadia型全自動(dòng)組織包埋機(jī)、HistoCore MULTICUT型半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Leica Bond RXM全自動(dòng)染色機(jī)（德國Leica公司），Miseq測序儀（美國Illumina公司），PANNORAMIC MIDI Ⅱ型病理掃描儀（匈牙利3D HISTECH公司），Skyscan 1176型Micro-CT（比利時(shí)Kontich公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（n=8）、模型組（n=8）、活血通絡(luò)組（n=8）。根據(jù)課題組前期研究使用甲潑尼龍琥珀酸鈉誘導(dǎo)SONFH模型，模型組和活血通絡(luò)組大鼠周一至周三左右臀肌交替注射甲潑尼龍琥珀酸鈉20 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射3周，空白組注射等體積無菌0.9%氯化鈉溶液［9-10］?；钛ńj(luò)組第3～28天給予0.63 g·kg-1·d-1活血通絡(luò)膠囊灌胃，空白組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃［9］。

1.4.2 糞便收集 藥物干預(yù)結(jié)束后給予3%戊巴比妥鈉10 mL/kg麻醉各組大鼠，75%乙醇消毒，提取大鼠盲腸內(nèi)容物并迅速轉(zhuǎn)移至無菌凍存管進(jìn)行凍存。

1.4.3 股骨HE染色 使用無菌手術(shù)器械剝離大鼠雙側(cè)大腿肌肉、韌帶及其他軟組織，留取股骨，固定、脫鈣、脫水后使用石蠟包埋，將蠟塊切割為5 μm的切片進(jìn)行HE染色。使用病理掃描儀及Case Viewer 2.4軟件進(jìn)行骨組織形態(tài)分析，計(jì)算各組間股骨頭空骨陷窩率。計(jì)算公式為：空骨陷窩率（%）=（空骨陷窩數(shù)量/總骨陷窩數(shù)量）×100%。

1.4.4 股骨Micro-CT分析 股骨使用4%多聚甲醛固定48 h，磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次后4 ℃保存。掃描系數(shù)如下：300 μA、50 kV和9 μm。股骨近端被作為感興趣區(qū)域（ROI），該區(qū)域距離生長板底部0.05 mm，總距離約1 mm。測量ROI相關(guān)骨組織學(xué)參數(shù)，包括骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）。

1.4.5 糞便16S rDNA測序及物種多樣性分析 采用隨機(jī)數(shù)字表法各組選取6只大鼠的盲腸內(nèi)容物樣本進(jìn)行DNA提取，檢測其純度及濃度。使用Phusion酶并添加特異性Barcode序列對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物運(yùn)用熒光定量系統(tǒng)分析、定量及混庫，使用Illumina MiSeq平臺(tái)將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過濾、DADA2去噪，獲得最終的ASV（Amplicon Sequence Variants）特征表以及特征序列。使用SILVA（Release 138）以及NT-16S數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類及分析。本研究物種多樣性分析包括α多樣性分析和β多樣性分析。α多樣性分析中Shannon指數(shù)是用來評估物種多樣性的重要指標(biāo)，其值越大說明物種多樣性越高。β多樣性中主坐標(biāo)分析（PCoA）通過對數(shù)據(jù)降維的方法研究樣本群落組成的相似性或相異性，當(dāng)樣本距離越近其菌群結(jié)構(gòu)相似度越高。采用線性判別分析（LEfSe）比較三組大鼠腸道菌群差異。采用COG功能預(yù)測三組大鼠腸道菌群功能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)檢測計(jì)量資料是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以

（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)使用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)使用Welch檢驗(yàn)整體觀察，Dunnet T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠股骨組織病理改變 HE染色結(jié)果顯示，模型組骨小梁空間結(jié)構(gòu)紊亂，間隙增寬，形狀變細(xì)；活血通絡(luò)組與模型組比較，骨小梁結(jié)構(gòu)排列較規(guī)整，間隙減小，形狀增粗（圖1）。三組大鼠空骨陷窩率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），其中模型組空骨陷窩率高于空白組（Plt;0.001），活血通絡(luò)組空骨陷窩率低于模型組（Plt;0.001），見表1。

2.2 大鼠股骨Micro-CT分析結(jié)果 大鼠股骨Micro-CT分析結(jié)果顯示，模型組骨小梁稀疏、變細(xì)并出現(xiàn)斷裂，骨丟失嚴(yán)重，活血通絡(luò)組較模型組骨小梁緊密、粗壯且斷裂較少（圖2）。計(jì)算相關(guān)骨組織學(xué)參數(shù)，三組大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），其中模型組BV/TV（Plt;0.001）、Tb.N（Plt;0.001）、Tb.Th（Plt;0.001）低于空白組，Tb.Sp高于空白組（Plt;0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；活血通絡(luò)組BV/TV（P=0.006）、Tb.N（P=0.002）、Tb.Th（P=0.013）高于模型組，Tb.Sp低于模型組（P=0.002），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3 腸道菌群測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估與ASV分析 對三組大鼠共18例糞便樣本進(jìn)行16S rDNA進(jìn)行測序，對檢測的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，結(jié)果表明，當(dāng)Shannon指數(shù)為6～7時(shí)，稀釋曲線末端趨于平滑，測序質(zhì)量良好，測序數(shù)據(jù)量已達(dá)到飽和，可進(jìn)行后續(xù)分析（圖3）?；贏SV的韋恩（Venn）圖中，3種不同顏色的圓對應(yīng)三組大鼠糞便所含的菌群，重疊部分為各組共同含有的菌群。三組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，與空白組相比，模型組腸道菌群ASV數(shù)目增加；與模型組比較，活血通絡(luò)組腸道菌群ASV數(shù)目減少（圖4）。

2.4 腸道菌群多樣性分析

2.4.1 α多樣性分析 三組大鼠Shannon指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），其中模型組高于空白組（Plt;0.05），見表3。

2.4.2 β多樣性分析 PCoA圖顯示，三組樣本存在部分重疊，但是能區(qū)分三組的群落結(jié)構(gòu)。相似性分析結(jié)果顯示，組間差異大于組內(nèi)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R=

2 062，P=0.01），見圖5。

2.5 腸道菌群差異物種分析 選擇三組門水平上豐度前30的物種，繪制物種相對豐度柱狀圖（圖6），由圖可見，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）為優(yōu)勢菌群，占總菌群數(shù)的97%以上?？瞻捉M、模型組、活血通絡(luò)組Firmicutes豐度分別為67.71%、68.12%、67.61%；空白組、模型組、活血通絡(luò)組Bacteroidota豐度分別為25.90%、21.88%、22.44%；空白組、模型組、活血通絡(luò)組Proteobacteria豐度分別2.88%、4.17%、3.59%；空白組、模型組、活血通絡(luò)組Desulfobacterota豐度分別為0.58%、3.02%、3.58%。

選擇三組屬水平上豐度前30的物種，繪制物種相對豐度柱狀圖（圖7），由圖可見，三組樣本主要包括Muribaculaceae_unclassified菌屬、毛螺菌屬_NK4A136、Firmicutes_unclassified菌屬、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、疣微菌屬（UCG-005）?？瞻捉M、模型組、活血通絡(luò)組Muribaculaceae_unclassified菌屬豐度分別為12.16%、15.24%、13.69%；空白組、模型組、活血通絡(luò)組毛螺菌屬_NK4A136豐度分別為15.23%、11.38%、7.46%；空白組、模型組、活血通絡(luò)組Firmicutes_unclassified菌屬豐度分別為5.43%、10.52%、9.94%；空白組、模型組、活血通絡(luò)組Ruminococcus菌屬豐度分別為5.58%、3.58%、2.11%；空白組、模型組、活血通絡(luò)組UCG-005菌屬豐度分別為2.10%、4.26%、4.58%。

2.6 腸道菌群LEfSe分析 LEfSe分析結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組脫硫弧菌（Desulfovibrio）、Hafnia-Obesumbacterium、明串珠菌屬（Leuconostoc）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）豐度升高，擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬_UCG-001豐度降低（Plt;0.05）；與模型組比較，活血通絡(luò)組草酸桿菌屬（Oxalobacteraceae）、扭鏈胃球菌屬（Ruminococcus_torques_group）豐度升高，理研菌屬（Rekenella）、Kineothrix菌屬豐度降低（Plt;0.05），見圖8。

2.7 腸道菌群功能預(yù)測 三組大鼠COG功能預(yù)測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組菌群COG功能主要集中于碳水化合物運(yùn)輸與代謝、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；與模型組比較，活血通絡(luò)組功能集中于無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸與代謝，且復(fù)制、重組和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂和染色體分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能水平升高，見圖9。

3 討論

SONFH是使用激素引起的股骨頭內(nèi)血液循環(huán)破壞，局部骨細(xì)胞死亡，骨小梁壞死，股骨頭內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、塌陷、變形，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的關(guān)節(jié)功能障礙，在中醫(yī)學(xué)中名為“骨蝕”或“骨痹”。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)“血瘀”貫穿股骨頭壞死病程的始終，因而認(rèn)為活血通絡(luò)是治療SONFH的重要方法［11-13］，從而達(dá)到“瘀去”而“新生”最后“骨合”的治療效果［14］。本團(tuán)隊(duì)前期臨床研究發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)膠囊對國際骨循環(huán)學(xué)會(huì)（ARCO）分期為ARCO Ⅱ期的股骨頭壞死患者具有較好的療效，當(dāng)股骨頭的前部和外側(cè)部分保持完整時(shí)，使用活血通絡(luò)膠囊可以延緩塌陷的發(fā)生［6］。本團(tuán)隊(duì)體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)膠囊可以促進(jìn)骨形成并改善骨小梁破壞情況［8-9］。本研究HE染色結(jié)果提示使用活血通絡(luò)膠囊能夠明顯降低空骨陷窩率。Micro-CT結(jié)果顯示活血通絡(luò)組大鼠BV/TV、Tb.Th，Tb.N增加，Tb.Sp減少，證明活血通絡(luò)膠囊對SONFH大鼠具有明顯療效。

近年研究者發(fā)現(xiàn)腸道菌群能夠影響骨代謝、骨免疫，參與多種骨骼疾病，“骨微生物學(xué)”的提出更是體現(xiàn)了其在骨骼疾病中的重要性［15］。本團(tuán)隊(duì)前期研究認(rèn)為腎、腦、腸、骨四者之間存在關(guān)系軸?；谀I-腦-腸-骨軸理論，可以考慮從腸道入手防治骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死等骨科疾?。?6］。另一項(xiàng)研究也基于《靈樞》中“治痿獨(dú)取陽明”的理論討論了SONFH與腸道菌群的相關(guān)性［17］。由此可見無論是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)還是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，腸道菌群對股骨頭壞死的治療均具有重要意義。

本研究通過16S rDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，與空白組對比，模型組Desulfovibrio、Hafnia-Obesumbacterium、Leuconostoc、Staphylococcus豐度明顯上升，而Bacteroides和普雷沃氏菌屬_UCG-001豐度明顯下降。Desulfovibrio作為一種革蘭陰性菌，可引起機(jī)體炎癥，與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并可能通過影響硫化氫的代謝參與纖維化進(jìn)程［18-20］。而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化大鼠骨吸收加強(qiáng)［21-22］，并且纖維化程度與骨密度呈負(fù)相關(guān)［23］。研究發(fā)現(xiàn)硫化氫不僅在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，還密切參與骨代謝的調(diào)節(jié)［24］。因此，Desulfovibrio可能參與骨代謝的調(diào)節(jié)參與股骨頭壞死相關(guān)進(jìn)程，其具體機(jī)制可能與肝纖維化、硫化氫代謝相關(guān)。Hafnia-Obesumbacterium是一種變形菌門的罕見潛在致病菌，與感染相關(guān)，包括敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)感染等［25-26］。此外，Leuconostoc也是一種罕見潛在致病菌，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其能引發(fā)骨髓炎［27］。在本次研究模型組中這兩種致病菌屬明顯升高，但其與股骨頭壞死的具體關(guān)系尚不清楚，仍值得進(jìn)一步研究。Bacteroides作為眾所周知的一種有益菌，參與了人體中碳水化合物運(yùn)輸與代謝、各類生物合成等代謝活動(dòng)，可以通過參與機(jī)體免疫等方式保護(hù)人體，且對SONFH患者及大鼠腸道菌群測序均發(fā)現(xiàn)Bacteroides豐度下降［17，28］，

本研究結(jié)果與之一致。同時(shí)，相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)SONFH模型組中普雷沃氏菌屬較空白組降低［28］，本研究結(jié)果與之一致。本研究中α多樣性分析提示模型組大鼠菌群多樣性較空白組增加，腸道菌群差異物種分析結(jié)果提示增加的菌屬主要是致病菌屬，而相應(yīng)有益菌屬則減少。

為了明確活血通絡(luò)膠囊是否通過作用于腸道菌群治療SONFH，本研究進(jìn)一步探究了活血通絡(luò)組大鼠菌群的變化。ASV分析和α多樣性分析結(jié)果顯示，活血通絡(luò)膠囊降低了模型組大鼠ASV數(shù)目及Shannon指數(shù)，推測活血通絡(luò)膠囊對SONFH的治療可能是通過改變其物種豐度和多樣性實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，本研究通過LEfSe分析發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)組Oxalobacteraceae、Ruminococcus_torques_group豐度上升。Oxalobacteraceae是一種革蘭陰性菌，研究發(fā)現(xiàn)其缺乏能夠?qū)е碌凸敲芏鹊陌l(fā)生［29］，但Oxalobacteraceae調(diào)節(jié)骨代謝的具體機(jī)制尚不清楚。Ruminococcus_torques_group是一種有益菌，在人體內(nèi)能產(chǎn)生丁酸鹽以發(fā)揮抗炎作用［30］。研究發(fā)現(xiàn)腸道中能夠產(chǎn)丁酸鹽的有益菌豐度下降時(shí)相關(guān)炎癥因子呈現(xiàn)增高趨勢［31］。炎癥反應(yīng)參與了SONFH與酒精性股骨頭壞死的發(fā)生、發(fā)展，在SONFH中相關(guān)炎癥因子（白介素1β、白介素6以及腫瘤壞死因子α）大量釋放，進(jìn)一步加速了疾病的發(fā)生、發(fā)展［32-34］。因此，通過增加產(chǎn)丁酸鹽有益菌的數(shù)量，促進(jìn)其釋放丁酸影響炎癥相關(guān)反應(yīng)可延緩SONFH的進(jìn)展，而本研究發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)膠囊可以提高Ruminococcus_torques_group豐度，推測這可能是其治療SONFH的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)膠囊可能通過改變腸道菌群的豐度和多樣性以及調(diào)控Oxalobacteraceae、Ruminococcus_torques_group等菌屬豐度而實(shí)現(xiàn)治療SONFH的目的。但由于腸道菌群的復(fù)雜性及多樣性，其在活血通絡(luò)膠囊防治SONFH中發(fā)揮的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。因此本次研究結(jié)果為相關(guān)研究提供了方向性指導(dǎo)，同時(shí)為相關(guān)微生物制劑等研究奠定了重要基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：魏秋實(shí)提出研究思路、負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制，對論文負(fù)責(zé)；韋雨柔設(shè)計(jì)研究方案、進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，論文撰寫；韋雨柔、田佳慶、肖方駿、何憲順負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施；詹芝瑋、魏騰飛進(jìn)行樣本收集及檢測；林天燁收集整理數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；何敏聰負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)和文章的校對。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2023-02-13；修回日期：2023-04-07）

（本文編輯：鄒琳）