轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果測量不確定度的自上而下評定方法研究及應用

李俊，趙新，陳紅，李飛武，梁晉剛，李允靜，王顥潛，高鴻飛，張華，陳子言，吳剛，沈平，徐利群，武玉花

轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果測量不確定度的自上而下評定方法研究及應用

李俊1，趙新2，陳紅3，李飛武4，梁晉剛3，李允靜1，王顥潛3，高鴻飛1，張華3，陳子言3，吳剛1，沈平3，徐利群3，武玉花

1中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物溯源重點實驗室，武漢 430062；2天津市農(nóng)業(yè)科學院，天津 300384；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100025；4吉林省農(nóng)業(yè)科學院，長春 130033

【目的】定量檢測標準體系是實施轉(zhuǎn)基因定量標識的基礎，而不確定度評定是定量檢測標準體系的重要組成部分。急需建立適合一般實驗室采用的標準化轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果不確定度的自上而下評定方法，以便檢測實驗室自行評定定量檢測結(jié)果的測量不確定度?！痉椒ā繙y量方法精密度不確定度評定有2種方法，一種是根據(jù)“不確定度函數(shù)”的一般概念，利用15個不同濃度的常規(guī)樣品，建立測量方法精密度引入的不確定度評定公式；另一種是重復測量有證標準物質(zhì)，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)的中間精密度，計算方法精密度引入的不確定度。用有證標準物質(zhì)或?qū)嶒炇遗渲茦悠纷麝栃远抠|(zhì)控品進行偏倚不確定度評定，實驗室配制樣品標稱值的不確定度由實驗室根據(jù)制備過程采用簡易程序自行評定。將測量方法精密度引入的不確定度和測量過程的偏倚不確定度合成，評定試樣定量結(jié)果的標準不確定度，然后乘以包含因子，獲得擴展不確定度?！窘Y(jié)果】以轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936定量檢測方法為例，分別用模擬的DBN9936常規(guī)樣品和有證基體標準物質(zhì)（GBW（E）100901）評定測量方法精密度引入的不確定度，分別為0.76%和0.33%，與常規(guī)樣品相比，用有證標準物質(zhì)評定的測量方法精密度不確定度顯著偏小。用有證標準物質(zhì)（GBW（E）100901）評定的偏倚不確定度為0.26%；用實驗室配制粉末樣品和基因組DNA樣品（標稱值均為3.0%）評定的偏倚不確定度分別為0.20%和0.19%。采用簡易程序評定實驗室配制樣品標稱值引入的不確定度時，部分不確定度分量被忽略，評定的偏倚不確定度偏小。將測量方法精密度不確定度和偏倚不確定度分別合成，用常規(guī)樣品評定的擴展不確定度為1.26%、1.20%和1.20%；用有證標準物質(zhì)評定的擴展不確定度為0.84%、0.78%和0.76%?！窘Y(jié)論】建立了轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果自上而下的不確定度評定方法，檢測實驗室要優(yōu)先選擇用常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的不確定度。在評定偏倚不確定度時，檢測實驗室原則上要優(yōu)先選擇有證標準物質(zhì)作陽性定量質(zhì)控品。

轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果；測量不確定度；自上而下；有證標準物質(zhì)；陽性定量質(zhì)控品

0 引言

【研究意義】我國急需實施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標識制度，規(guī)定標識閾值，解決生物育種產(chǎn)業(yè)化后的產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分無意混雜或低水平混雜問題，降低生產(chǎn)經(jīng)營者的標識成本和管理成本，提升生物育種產(chǎn)業(yè)化的經(jīng)濟效益[1-3]。實施定量標識的前提是建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測標準體系、研制出配套的有證標準物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果不確定度評定是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測標準體系的重要組成部分，測量不確定度是一個始終與定量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，它表征合理地賦予被測量之值的分散性[4]。檢測實驗室在報告定量檢測結(jié)果時，要同時報告試樣轉(zhuǎn)基因含量的測量值及其測量不確定度，以確定測量結(jié)果的可靠性和可比性[5]。【前人研究進展】當報告測量結(jié)束時，必須報告測量不確定度，測量不確定度就是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征[5-6]。測量不確定度最早由國際計量局提出，通過國際標準化組織ISO發(fā)布，第一個被廣泛認可的測量不確定度評定方法是《測量不確定度表示指南》（guide to the expression of uncertainty in measurement，GUM），通常被稱為GUM法，是采用“不確定度傳播率”得到被測量估計值的測量不確定度的方法[7]。對GUM法等同采用，中國國家標準化管理委員會聯(lián)合國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布了標準《測量不確定度評定和表示》（GB/T 27418—2017）[8]、國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布了《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1－2012）[9]。GUM法是所有測量不確定度評定的基礎，規(guī)定了不確定度的定義，將其與誤差區(qū)分開來，為測量不確定度的評定和表達制定了一般規(guī)則[10]。GUM法要求先建立特性值和其輸入量之間的數(shù)學模型，然后使用因果圖（魚骨圖）作為可視化輔助工具，剖分檢測過程中所有的不確定度分量來源，對各不確定度分量逐一分析，最后將各個不確定度分量合成，獲得總不確定度[11-12]。因為GUM方法是基于剖分每個輸入量對不確定度的貢獻，該方法被稱作“自下而上（bottom-up）”的不確定度評定方法[13-14]。GUM法是測量領(lǐng)域?qū)Σ淮_定度進行評定的基本方法，廣泛應用于醫(yī)療檢測、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、工程項目等各個領(lǐng)域[15-18]。GUM法是一種“自下而上”的不確定度評定方法，需要操作者深入了解測量方法，并建立特性值和輸入量間的數(shù)學模型，采用“不確定度傳播率”評估各個不確定度分量的貢獻，應用門檻高，難以被一般的檢測實驗室采用；若遺漏了關(guān)鍵不確定度分量，會導致錯估不確定度；而且對于沒有建立數(shù)學模型的測量，檢測實驗室難以利用GUM方法進行不確定度評定[14, 19]。于是提出了利用實驗室內(nèi)或?qū)嶒炇议g驗證數(shù)據(jù)進行不確定度評定的“自上而下”的不確定度評定方法[12]，我國對ISO/TS 21748:2004指南等同采用，于2010年發(fā)布了《利用重復性、再現(xiàn)性和正確度的估計值評估測量不確定度的指南》（GB/Z 22553-2010/ISO/TS 21748:2004），給出了基于再現(xiàn)性或中間精密度的估計值來評定測量不確定度的技術(shù)指導[20-21]。為規(guī)范轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果的不確定度評定，歐盟發(fā)布了轉(zhuǎn)基因檢測實驗室不確定度評定指南《Guidance Document on Measurement Uncertainty for GMO Testing Laboratories》[22]。歐盟提出的不確定度評估原則與ISO/TS 21748:2004指南相似，注重整個方法在測量中的性能，被稱作“自上而下（top-down）”的不確定度評定方法。與GUM法相比，自上而下的不確定度評定方法不考慮測量方法的數(shù)學模型，無須對測量過程的各個不確定度分量一一評價，簡化了不確定度評定程序，便于檢測實驗室采用，并且已成功應用于醫(yī)學檢測[23-24]?！颈狙芯壳腥朦c】《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定評審準則》（市場監(jiān)管總局2023年第21號）和《檢測和校準實驗室能力的通用要求》（GB T 17025-2017）均要求檢驗機構(gòu)/檢測實驗室建立和保持應用測量不確定度的程序[25-26]，在定量測量時，應針對結(jié)果給出相應的測量不確定度。我國生物育種產(chǎn)業(yè)化急需實施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標識制度，需要每個檢測實驗室建立轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果的不確定度評定程序，自行評定每個試樣定量結(jié)果的測量不確定度。前期，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗總局等同采用歐盟發(fā)布的第1版不確定度評定標準，發(fā)布了《轉(zhuǎn)基因檢測實驗室測量不確定度評估指南》SN/T 4562-2016[27]，由于歐盟第1版不確定度評定標準已經(jīng)廢止，該標準已不再適用。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2021年發(fā)布了《轉(zhuǎn)基因成分定量檢測結(jié)果不確定度評定與表示》農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第423號-10-2021[28]，該標準提供了“自下而上”的不確定度評定方法。為支撐轉(zhuǎn)基因定量標識制度的實施，本研究將建立一種可替代的、更適用于一般轉(zhuǎn)基因檢測實驗室采用的“自上而下”的測量不確定度評定方法，并在轉(zhuǎn)基因檢測實驗室間推廣應用。在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，我國還未建立起適合一般實驗室采用的“自上而下”的定量檢測結(jié)果不確定度評定方法。參考《利用重復性、再現(xiàn)性和正確度的估計值評估測量不確定度的指南》和歐盟不確定度評定指南[20-22]，建立了檢測實驗室自行評定定量檢測結(jié)果測量不確定度的“自上而下”方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究針對我國標準物質(zhì)體系不完善的現(xiàn)狀，擬提出用實驗室配制樣品作為偏倚質(zhì)控，并進行偏倚不確定度評定的方法。以轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936定量檢測方法為例進行應用示范，一般檢測實驗室可以參照執(zhí)行，填補國內(nèi)轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果“自上而下”不確定度評定的空白。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合種子和非轉(zhuǎn)基因受體DBN318種子由大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供。用轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合體基因組DNA制備的純品基因組DNA標準物質(zhì)（GBW10266）以及用轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合種子粉末和非轉(zhuǎn)基因玉米受體粉末混合制備的基體標準物質(zhì)（GBW（E）100901）由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心和本單位聯(lián)合研制，并取得有證標準物質(zhì)證書，標準值和擴展不確定度為（3.49±0.33）%。

1.2 常規(guī)樣品制備

以轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合種子和非轉(zhuǎn)基因受體粉末為材料，用天平稱量法配制轉(zhuǎn)基因含量（質(zhì)量分數(shù)）為0.10%—4.00%的混合樣品，模擬實驗室檢測過程中遇到的低濃度常規(guī)樣品。共配制15個樣品，質(zhì)量分數(shù)依次為0.10%、0.12%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.50%、0.70%、1.00%、2.00%、2.50%、3.00%和4.00%，15個模擬常規(guī)樣品依次命名為R1—R15。將15個模擬常規(guī)樣品分為2組，R1—R6的濃度小于或等于0.30%，接近方法的定量限，稱為低濃度常規(guī)樣品；R7—R15的濃度為0.30%—4.00%，稱為高濃度常規(guī)樣品。

1.3 陽性定量質(zhì)控品制備

若沒有有證標準物質(zhì)進行偏倚控制，需實驗室自己配制轉(zhuǎn)基因含量與標識閾值相當?shù)姆勰悠坊蚧蚪MDNA樣品，作為陽性定量質(zhì)控品。

用轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936粉末和非轉(zhuǎn)基因玉米粉末混合配制粉末質(zhì)控品。在配制粉末樣品前，先單粒檢測轉(zhuǎn)基因種子基因型和純度，至少檢測50粒種子；用至少3 000粒種子制備的混樣，檢測非轉(zhuǎn)基因種子純度。將研磨的轉(zhuǎn)基因粉末和非轉(zhuǎn)基因粉末暴露在相同的試驗條件下至少24 h，平衡2種粉末的含水量，以減小含水量差異對標稱值不確定度的影響。然后用校準的天平稱量配制轉(zhuǎn)基因含量是3.0%的粉末樣品。

用轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合體基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA混合制備基因組DNA質(zhì)控品。在配制之前，首先鑒定轉(zhuǎn)基因單株和非轉(zhuǎn)基因單株的基因型，分別提取轉(zhuǎn)基因單株和非轉(zhuǎn)基因單株的基因組DNA，評定基因組質(zhì)量后，用0.1×TE緩沖液將基因組DNA濃度調(diào)整到約100 ng·μL-1，然后用數(shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA的內(nèi)標準基因拷貝數(shù)濃度進行多次測量，確定二者的拷貝數(shù)濃度后，用校準的移液器配制轉(zhuǎn)基因含量是3.0%的基因組DNA樣品。

1.4 DNA提取

用Qiagen基因組DNA提取試劑盒（Qiagen DNeasy Plant Mini Kit，1540355331）提取標準物質(zhì)（GBW（E）100901）及模擬常規(guī)樣品的基因組DNA。標準物質(zhì)（GBW（E）100901）取5個平行子樣，每個模擬常規(guī)樣品取2個平行子樣，每個平行子樣獨立提取1份DNA。提取的DNA溶解到100 μL 0.1×TE緩沖液中?；蚪MDNA完全溶解后，用Nanodrop1000紫外分光光度計檢測DNA溶液的濃度及純度，將DNA濃度調(diào)整到50 ng·μL-1。

1.5 熒光定量PCR

采用前期建立的DBN9936轉(zhuǎn)化體特異性熒光定量PCR方法檢測模擬常規(guī)樣品的轉(zhuǎn)基因含量[29]，轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936轉(zhuǎn)化體特異性引物探針和玉米內(nèi)標基因引物探針序列詳見表1。DBN9936轉(zhuǎn)化體和內(nèi)標基因的反應體系和程序相同。熒光定量PCR反應體系：2×TaqMan? Universal PCR Master Mix 10 μL、正向引物和反向引物各0.8 μL、探針0.4 μL、DNA模板2 μL，加ddH2O至總體積20 μL。反應程序為95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，45個循環(huán)；在第二階段的退火延伸（60 ℃）時段收集熒光信號。以梯度稀釋的基因組DNA標準物質(zhì)（GBW10266）為校準品繪制DBN9936轉(zhuǎn)化體和內(nèi)標基因標準曲線。每個模擬常規(guī)樣品檢測2個平行子樣，每個子樣提取1份DNA，每份DNA設置2個PCR重復。對有證標準物質(zhì)（GBW（E）100901）進行定量時，在短時間內(nèi)重復測量5 d（t=1,...,5），不同時間可用不同的檢測員、不同的試劑、或不同的設備進行檢測。每天檢測5個平行子樣，每個子樣提取1份DNA，每份DNA設置2個PCR重復。

表1 DBN9936轉(zhuǎn)化體及zSSIIb內(nèi)標基因引物和探針序列

1.6 用常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的不確定度

可用實驗室收集或配制的常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的測量不確定度[22]，用較低濃度樣品評定恒定標準差，用較高濃度樣品評定相對恒定標準差。

1.6.1 用低濃度樣品評定恒定標準差用6個低濃度常規(guī)樣品（不同濃度的樣品用下標表示，=1,...,6）評定恒定標準差。每個子樣的測量值為2個PCR重復的平均值，每個低濃度樣品的2個子樣的測量值分別記為1,j和2,j，二者的絕對差值計算為：

恒定標準差計算為：

每個高濃度樣品的2份子樣DNA測量值的相對差值計算為：

相對恒定標準差計算為：

1.6.3測量方法精密度引入的不確定度評定 根據(jù)確定的恒定標準差和相對恒定標準差評定樣品檢測過程中測量方法精密度引入的不確定度（u），不確定度u計算為：

1.7 用有證標準物質(zhì)評定測量方法精密度引入的不確定度

若檢測實驗室沒有收集到足量的常規(guī)樣品，可用認定值與標識閾值相當?shù)挠凶C標準物質(zhì)評定測量方法精密度引入的不確定度[22]。

1.7.1 檢測數(shù)據(jù)分析 對有證基體標準物質(zhì)重復測量5 d，每天測量5個平行子樣的檢測數(shù)據(jù)，進行單因素方差分析。每天5個平行子樣的檢測數(shù)據(jù)為一組數(shù)據(jù)，檢測數(shù)據(jù)的組內(nèi)均方MS計算為：

檢測數(shù)據(jù)的組間均方MS計算為：

式中，u表示測量方法精密度引入的不確定度；表示重復性方差；表示試樣的平行子樣數(shù)；表示組間方差。

1.8 偏倚不確定度評定

1.8.1 用有證標準物質(zhì)評定偏倚不確定度 陽性定量質(zhì)控品次（=3）重復檢測數(shù)據(jù)平均值的標準不確定度計算為：

陽性定量質(zhì)控品次重復檢測數(shù)據(jù)平均值偏倚的標準不確定度計算為：

若||＜2×u（擴展不確定度，95%置信水平下包含因子為2），表明該次試驗陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)的偏倚不顯著，評定的偏倚不確定度可用于合成標準不確定度。

1.8.2 用實驗室配制樣品評定偏倚不確定度 用實驗室配置樣品作陽性定量質(zhì)控品時，需要實驗室自行評定陽性定量質(zhì)控品標稱值的不確定度。考慮到檢測實驗室的可操作性，對不確定度評定過程進行一定的簡化處理。

根據(jù)配制粉末質(zhì)控品所用的轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的純度不確定度，以及用來稱量轉(zhuǎn)基因粉末和非轉(zhuǎn)基因粉末的電子天平的不確定度，評定粉末質(zhì)控品標稱值的標準不確定度。粉末質(zhì)控品標稱值的相對不確定度按下式計算：

粉末質(zhì)控品標稱值的標準不確定度計算為：

u=c·u,r（16）

式中，u,r表示粉末質(zhì)控品的合成相對不確定度；p表示95%置信度下轉(zhuǎn)基因種子純度；p-GM表示95%置信度下非轉(zhuǎn)基因種子純度；m表示轉(zhuǎn)基因粉末質(zhì)量；m-GM表示非轉(zhuǎn)基因粉末質(zhì)量；U表示電子天平的擴展不確定度；u表示粉末質(zhì)控品標稱值的標準不確定度；c表示粉末質(zhì)控品標稱值。

根據(jù)配制基因組DNA質(zhì)控品所用的轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA拷貝數(shù)濃度測定的不確定度，以及用來移取轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA的移液器的不確定度，評定基因組DNA質(zhì)控品標稱值的標準不確定度。基因組DNA質(zhì)控品標稱值的相對不確定度按下式計算：

式中，u,r表示基因組DNA質(zhì)控品的合成相對不確定度；表示轉(zhuǎn)基因DNA拷貝數(shù)濃度相對不確定度；表示非轉(zhuǎn)基因DNA拷貝數(shù)濃度相對不確定度；v表示轉(zhuǎn)基因DNA體積；v-GM表示非轉(zhuǎn)基因DNA體積；u表示移液器的不確定度，若移液器使用校準證書，則u=U/(=2)；若移液器使用檢定證書（為檢定證書中對應級別給出的最大允許誤差）。

基因組DNA質(zhì)控品標稱值的標準不確定度按公式（10）計算。然后按公式（15）和公式（16）評定用實驗室配制樣品進行偏倚控制引入的不確定度。

若陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)的相對標準差≤25%，且偏倚||≤25%，表明陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)的偏倚不顯著，本次試驗陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)合格。評定的偏倚不確定度可用于合成標準不確定度。

1.9 試樣測量結(jié)果的標準不確定度評定

1.9.2 用有證標準物質(zhì)評定的測量方法精密度不確定度與偏倚不確定度合成 基于有證基體標準物質(zhì)的檢測數(shù)據(jù)，按公式（12）評定測量方法精密度不確定度u。用有證標準物質(zhì)或?qū)嶒炇遗渲茦悠纷鲫栃远抠|(zhì)控品，評定測量偏倚引入的不確定度u。按下式將u與用有證標準物質(zhì)或?qū)嶒炇遗渲茦悠吩u定的u分別合成，計算試樣定量結(jié)果的標準不確定度：

式中，u表示定量結(jié)果的合成標準不確定度；2表示重復性方差；表示試樣的平行子樣數(shù)；2表示組間方差；u表示陽性定量質(zhì)控品次重復檢測平均值偏倚的標準不確定度。

1.9.3 計算擴展不確定度 試樣定量檢測結(jié)果的擴展不確定度（）計算為：

=ku（20）

式中，表示擴展不確定度；u表示定量結(jié)果的合成標準不確定度；表示包含因子（95%置信度下，=2）。

2 結(jié)果

2.1 測量方法精密度引入的不確定度評定

根據(jù)歐盟發(fā)布的轉(zhuǎn)基因檢測實驗室測量不確定度評定指導文件（第3版）[22]，可用常規(guī)樣品或有證標準物質(zhì)評定測量方法精密度引入的不確定度。

2.1.1 用常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的不確定度 用常規(guī)樣品評定測量方法引入的不確定度，測量過程包含了樣品制備、DNA提取純化、PCR檢測和數(shù)據(jù)分析等全部程序，用于評定測量不確定度的數(shù)據(jù)涵蓋了所有不確定度分量，反映了從樣品制備到數(shù)據(jù)處理全過程的所有變異，因此，用常規(guī)樣品評定測量不確定度是進行轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果不確定度評定的首選方法。

Thompson等[30]提出“不確定度函數(shù)”（）的一般概念（公式（7）），不確定度大小取決于參數(shù)“”和參數(shù)“”。參數(shù)“”描述在轉(zhuǎn)基因含量接近定量限（limit of quantification，LOQ）時對不確定度的恒定貢獻，當轉(zhuǎn)基因含量接近定量限時，測量不確定度是一個常數(shù)；參數(shù)“”表示轉(zhuǎn)基因含量較高時的恒定相對標準偏差，當轉(zhuǎn)基因含量較高時，測量不確定度貢獻量依賴于被測量值，即測量不確定度與轉(zhuǎn)基因含量成正比。

2.1.2 用有證標準物質(zhì)評定測量方法精密度引入的不確定度 ISO/IEC 17025規(guī)定，認可實驗室必須對標準測量方法進行實驗室內(nèi)驗證，以證明實驗室能正確地實施標準方法，且標準方法滿足預期用途[31]。因此，檢測實驗室必須在方法驗證的框架內(nèi)，用標準方法檢測有證標準物質(zhì)（轉(zhuǎn)基因含量標準值與標識閾值相當）的轉(zhuǎn)基因含量，證明檢測實驗室的偏倚和精密度能得到較好的控制。標準GB/Z 22553—2010/ISO/TS 21748:2004提出，利用重復性、再現(xiàn)性和正確度的估計值評估測量不確定度[23-24]。在檢測實驗室的偏倚和精確度能得到較好控制的前提下，實驗室內(nèi)方法驗證的中間精密度是測量不確定度評定的有效依據(jù)，因此，本方法根據(jù)中間精密度評定定量方法精密度引入的測量不確定度。

表2 15個常規(guī)樣品的定量檢測數(shù)據(jù)及分析結(jié)果

表3 恒定標準差α計算過程及結(jié)果

當轉(zhuǎn)基因含量接近標識閾值時，準確評定其不確定度是轉(zhuǎn)基因定量檢測的關(guān)鍵，因此，選用標準值（轉(zhuǎn)基因含量）與標識閾值相當?shù)挠凶C轉(zhuǎn)基因基體標準物質(zhì)評定測量不確定度。本研究選用了轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936的有證標準物質(zhì)（GBW（E）100901）作陽性定量質(zhì)控品，評定DBN9936轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR方法的測量不確定度，標準值DBN9936轉(zhuǎn)化體/拷貝數(shù)比值為3.49%，擴展不確定度為0.33%。每天測試5個平行子樣，連續(xù)測量5 d（表5）。對檢測數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，剖分組內(nèi)方差（平行子樣間方差，又稱重復性方差）和組間方差（日期間方差），計算中間精密度。每天5個平行子樣的檢測數(shù)據(jù)為一組數(shù)據(jù)，按公式（8）—公式（11），先計算數(shù)據(jù)的組內(nèi)均方MS和組間均方MS，然后計算檢測數(shù)據(jù)的重復性方差2和組間方差2（表5）。

表4 相對恒定標準差β計算過程及結(jié)果

表5 有證標準物質(zhì)GBW（E）100901的定量檢測數(shù)據(jù)

試樣檢測了3個PCR重復，根據(jù)公式（12），測量方法精密度引入的不確定度評定為

與常規(guī)樣品相比，有證標準物質(zhì)少了檢測過程中樣品制備這個步驟，用有證標準物質(zhì)評定的不確定度顯著偏小，而且評定的不確定度是1個常數(shù)，反映不出試樣轉(zhuǎn)基因含量不同時，其檢測數(shù)據(jù)精密度的變化。

2.2 偏倚不確定度評定

原則上，實驗室在定量檢測過程中，要用標準值與標識閾值相當?shù)挠凶C標準物質(zhì)作陽性定量質(zhì)控，進行偏倚控制，但考慮到我國的標準物質(zhì)體系還不完善，大部分標準物質(zhì)還在研制中，在沒有有證標準物質(zhì)可用的情況下，允許實驗室對原材料進行鑒定和確認后，自行配制轉(zhuǎn)基因含量與標識閾值相當?shù)臉悠纷鲫栃远抠|(zhì)控，并自行評定實驗室配制樣品標稱值的標準不確定度。我國還未公布定量標識閾值，本文假定標識閾值為3%，模擬偏倚不確定度評定方法。

表6 陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)

a用有證標準物質(zhì)作質(zhì)控品，認證值的標準不確定度根據(jù)標準物質(zhì)證書提供的擴展不確定度計算；b用實驗室配制樣品作質(zhì)控品，標稱值的標準不確定度由實驗室根據(jù)制備過程自行評定

aUsing a CRM as quality control, the standard uncertainty of the certified value is calculated based on the expanded uncertainty provided by the certificate;bUsing a laboratory prepared sample as quality control, the standard uncertainty of the nominal value is evaluated by the laboratory based on the preparation process

陽性定量質(zhì)控品重復檢測數(shù)據(jù)平均值的偏倚計算為，偏倚擴展不確定度計算為2×u=2×0.260%=0.52%。因為0.217%＜0.52%，即||＜2×u。表明該次試驗陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)的偏倚不顯著，評定的偏倚不確定度u（0.260%）可用于合成標準不確定度。

2.2.2 用實驗室配制樣品作陽性定量質(zhì)控品評定偏倚不確定度 若無有證標準物質(zhì)，則檢測實驗室配制標稱值與標識閾值相當?shù)臉悠纷鳛殛栃远抠|(zhì)控品，進行偏倚控制。實驗室可用經(jīng)純度鑒定的轉(zhuǎn)基因純合體種子粉末和非轉(zhuǎn)基因粉末，用校準的天平稱量配制轉(zhuǎn)基因含量與標識閾值相當?shù)姆勰悠纷鳛殛栃远抠|(zhì)控品；也可用轉(zhuǎn)基因純合體基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因單株基因組DNA，用校準的移液器配制轉(zhuǎn)基因含量與標識閾值相當?shù)幕蚪MDNA樣品作為陽性定量質(zhì)控品。與有證標準物質(zhì)相比，實驗室配制樣品的標稱值沒有認證的不確定度，需實驗室自行評定配制樣品標稱值的標準不確定度。

2.2.2.1 粉末質(zhì)控品偏倚不確定度評定 根據(jù)公式（14），要評定粉末質(zhì)控品的偏倚不確定度，需分別評定其標稱值的標準不確定度和重復檢測數(shù)據(jù)平均值的標準不確定度。本次實驗室配制一個轉(zhuǎn)基因含量為3%的粉末質(zhì)控品，共配制1 g。首先對轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子進行原材料純度鑒定，轉(zhuǎn)基因種子純度采用單粒法檢測，為保證檢測樣本對總體的代表性，至少抽檢50粒種子進行單粒檢測。經(jīng)檢測，50粒種子全部為純合體，在95%置信度下，根據(jù)泊松分布，轉(zhuǎn)基因種子純度≥94.2%；檢測3 000粒非轉(zhuǎn)基因種子，結(jié)果為陰性，非轉(zhuǎn)基因種子純度≥99.9%。將轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因種子研磨干燥后，用校準的電子天平（校準證書上擴展不確定度為0.2 mg）稱量0.97 g非轉(zhuǎn)基因粉末、0.03 g轉(zhuǎn)基因粉末，混勻制備標稱值為3%的粉末陽性定量質(zhì)控樣品。按公式（15），粉末陽性定量質(zhì)控品標稱值的相對不確定度計算為：

按公式（16）計算粉末質(zhì)控品標稱值的標準不確定度u=3%×0.018=0.06%。

2.2.2.2 基因組DNA質(zhì)控品偏倚不確定度評定 配制一個轉(zhuǎn)基因含量為3%的基因組DNA質(zhì)控品，共配制1 ml。用內(nèi)標基因數(shù)字PCR分別檢測DBN9936純合體基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA的濃度，每種DNA至少重復測量3次（表7），計算3次重復檢測數(shù)據(jù)平均值的相對標準差（表7）。

表7 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因DNA濃度測量及分析數(shù)據(jù)

經(jīng)濃度檢測，轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA的拷貝數(shù)濃度相似，直接用移液器按體積量取轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA溶液，配制轉(zhuǎn)基因含量為3%的基因組DNA溶液。用量程為100—1 000 μL的檢定移液器（檢定證書上移取500—1 000 μL溶液，容量允差為±1.0%）移取970 μL的非轉(zhuǎn)基因DNA溶液，用量程為20—200 μL的檢定移液器（檢定證書上移取20—100 μL溶液，容量允差為±2.0%）移取30 μL非轉(zhuǎn)基因溶液，混勻制備1 ml標稱值為3%的基因組DNA陽性定量質(zhì)控樣品。按公式（17），基因組DNA陽性定量質(zhì)控品標稱值的相對不確定度計算為：

（移液器鑒定證書直接給出了容量允差的相對值，因此，評定移液體積引入的不確定度無須再除以移取體積）?；蚪MDNA質(zhì)控品標稱值的標準不確定度u= 3%×0.021=0.063%。

用實驗室配制粉末樣品和基因組DNA樣品作為定量檢測的陽性定量質(zhì)控品，檢測數(shù)據(jù)的相對標準差RSD分別為10.21%和9.23%，均小于規(guī)定的25%，因此，評定的偏倚不確定度可用于試樣定量結(jié)果測量不確定度的合成。

實驗室自行評定配制樣品標稱值的標準不確定度時，在充分考慮原材料純度、設備校準不確定度、測量數(shù)據(jù)標準差等因素的基礎上，考慮到一般檢測實驗室的可操作性，本文提出了不確定度評定的簡易程序（公式（15）、（17）），忽略了均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗等不確定分量，評定的實驗室配制樣品標稱值標準不確定度顯著小于有證標準物質(zhì)認證值的標準不確定度，進而導致用實驗室配制樣品評定的偏倚不確定度略小于用有證標準物質(zhì)評定的偏倚不確定度（表6）。

2.3 試樣擴展不確定度評定

本研究檢測了一個含玉米DBN9936轉(zhuǎn)化體的試樣，檢測3個子樣，每個子樣3個PCR重復，檢測平均值為4.15%。試樣定量結(jié)果的合成標準不確定度主要包括2個分量，分別是測量方法精密度引入的不確定度，和試樣檢測過程中偏倚引入的不確定度。測量方法精密度引入的不確定度用常規(guī)樣品或有證標準物質(zhì)評定，試樣的轉(zhuǎn)基因含量為4.15%時，用常規(guī)樣品評定的測量方法精密度不確定度為0.76%，用有證標準物質(zhì)評定的不確定度為0.33%。偏倚引入的不確定度用陽性定量質(zhì)控品評定，首選有證標準物質(zhì)作質(zhì)控，若沒有有證標準物質(zhì)用實驗室配制的粉末樣品或基因組DNA樣品作質(zhì)控，3種質(zhì)控品評定的偏倚不確定度u見表6。將評定的方法精密度不確定度與不同質(zhì)控品的偏倚不確定度分別合成，評定試樣定量結(jié)果的標準不確定度。

2.3.1 將常規(guī)樣品評定的測量方法精密度不確定度與偏倚不確定度合成 用公式（18）將常規(guī)樣品評定的測量方法精密度不確定度與偏倚不確定度合成，計算試樣定量檢測結(jié)果的合成標準不確定度。采用3種不同的質(zhì)控品評定偏倚引入的不確定度：1）若用有證標準物質(zhì)評定偏倚不確定度，則試樣定量結(jié)果的測量不確定度計算為

2）若用實驗室配制的粉末樣品評定偏倚不確定度，則試樣定量結(jié)果的測量不確定度計算為

3）若用實驗室配制的基因組DNA樣品評定偏倚不確定度，則試樣定量結(jié)果的測量不確定度計算為

（表8）。與有證標準物質(zhì)相比，用實驗室配制樣品作為陽性定量質(zhì)控品評定的偏倚不確定度雖然偏?。ū?），但用3種不同質(zhì)控品進行偏倚控制，評定的試樣合成標準不確定度相近（表8）。根據(jù)公式（20）計算定量結(jié)果的擴展不確定度，用有證標準物質(zhì)、實驗室配制粉末樣品、實驗室配制基因組DNA樣品做陽性定量質(zhì)控品，計算的擴展不確定度依次為1.26%、1.20%、1.20%，定量結(jié)果依次表示為（4.15± 1.26）%、（4.15±1.20）%、（4.15±1.20）%（表8）。

用常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的不確定度，其大小與待測樣品的測量值呈正相關(guān)（公式7），待測樣品的測量平均值越大，評定的不確定度越大。當待測樣品的測量平均值為4.15%時，評定的方法精密度不確定度為0.76%。而用有證標準物質(zhì)評定的不確定度為1個常數(shù)，為0.33%，不確定度大小不隨試樣轉(zhuǎn)基因含量不同發(fā)生變化。由于用有證標準物質(zhì)評定方法精密度不確定度時，測量過程中少了樣品制備的步驟，用有證標準物質(zhì)評定的不確定度顯著偏小，導致最終評定的試樣測量結(jié)果擴展不確定度顯著偏?。ū?）。建議檢測實驗室優(yōu)先選擇用常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的不確定度。

表8 試樣測量不確定度評定結(jié)果及定量結(jié)果表示

3 討論

3.1 需要建立自上而下的轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果不確定度評定方法

GUM方法要求，在轉(zhuǎn)基因定量檢測過程中，操作者要密切關(guān)注所有可能的不確定性來源[7]。取樣（即樣品收集）通常對總體不確定性有很大影響。但在大多數(shù)情況下，實驗室很難估計這一步驟引入的不確定度，因為根據(jù)試樣（食物/飼料）的類型，通常用不同的方法抽取代表性樣品。此外，抽樣通常由檢測實驗室以外的其他機構(gòu)執(zhí)行。因此，定量檢測結(jié)果不確定度主要評定從樣品制備到結(jié)果分析產(chǎn)生的測量不確定度。測量不確定度主要來源于樣品制備（將實驗室樣品縮減為測試樣品）、DNA提取、純化DNA、定量分析（qPCR或dPCR）及包括校準在內(nèi)的數(shù)據(jù)評估[29]。GUM方法需要考慮所有的不確定度來源，除非可以證明特定的不確定度分量可以忽略不計。實踐證明，采用“自下而上”的不確定度評定方法，需要操作人員對檢測過程有非常深入的理解，適用于校準實驗室采用，而一般的檢測實驗室在使用GUM方法時往往會遭遇困難[14, 19]。

在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，根據(jù)轉(zhuǎn)基因定量檢測的技術(shù)特點，歐盟發(fā)布了轉(zhuǎn)基因檢測實驗室測量不確定度評定指導文件，提出了“自上而下”評定測量不確定度的方法。該指南目前已發(fā)布了3版，最新的第3版于2020年發(fā)布[22]。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗總局等同采用了歐盟發(fā)布的第一版標準，發(fā)布了SN/T 4562-2016《轉(zhuǎn)基因檢測實驗室測量不確定度評估指南》[27]。歐盟的第3版標準與前面2版相比，考慮了歐盟發(fā)布的轉(zhuǎn)基因有證標準物質(zhì)、定量檢測標準，以及檢測實驗室的需求；認為每個檢測實驗室都應該針對每個定量檢測標準評定自己的測量不確定度，而且要求實驗室優(yōu)先選擇用常規(guī)樣品評定方法精密度引入的不確定度，并修正了不確定度評定方法。目前我國參照歐盟第一版標準發(fā)布的《轉(zhuǎn)基因檢測實驗室測量不確定度評估指南》已經(jīng)滯后[27]，需要制定頒布新的轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果不確定度評定指南。

3.2 檢測實驗室優(yōu)先用常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的不確定度

本研究參照歐盟第3版轉(zhuǎn)基因檢測實驗室測量不確定度評定指導文件[22]，模擬了用常規(guī)樣品和有證標準物質(zhì)評定測量方法精密度引入不確定度的方法。與用常規(guī)樣品評定的測量方法精密度不確定度相比，用有證標準物質(zhì)評定的不確定度，少了樣品制備的過程，方法精密度引入的不確定度被低估；而且用有證標準物質(zhì)，基于測量結(jié)果的中間精密度評定的不確定度是一個常數(shù)，不能反映出樣品不確定度隨測量值變化的趨勢。因此，檢測實驗室應優(yōu)先用常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的不確定度。若缺少常規(guī)樣品，檢測實驗室可選用有證標準物質(zhì)評定測量不確定度，但積累了足量的滿足要求的常規(guī)樣品后，要重新評定測量方法精密度引入的不確定度。一旦實驗室對特定標準方法進行了方法精密度不確定度評定，實驗室建立的方法精密度不確定度評定公式（公式（7））及數(shù)值（公式（12））可用于后續(xù)試樣定量檢測結(jié)果的不確定度評定。但前提是試樣檢測結(jié)果是同一實驗室在相同條件下獲得的，且用于檢測過程偏倚控制的陽性定量質(zhì)控品的檢測數(shù)據(jù)合格。

3.3 檢測實驗室原則上用有證標準物質(zhì)進行偏倚控制

在定量檢測過程中，要設置陽性定量質(zhì)控品對檢測全過程進行監(jiān)控，并根據(jù)陽性定量質(zhì)控品的數(shù)據(jù)評定檢測過程引入的偏倚不確定度[22]。原則上，檢測實驗室應該選擇有證標準物質(zhì)作為陽性定量質(zhì)控品，且有證標準物質(zhì)的標準值要與轉(zhuǎn)基因定量標識閾值相當。由于目前我國的有證標準物質(zhì)還存在缺口，大部分轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品還沒有研制出相應的標準物質(zhì)。實驗室在定量檢測過程中，會面臨缺乏有證標準物質(zhì)的難題。在這種情況下，實驗室只能自行配制轉(zhuǎn)基因含量與標識閾值相當?shù)姆勰悠坊蚧蚪MDNA樣品，作為定量檢測的陽性定量質(zhì)控品。對于實驗室配制的質(zhì)控品，沒有認證的不確定度，如果忽略陽性定量質(zhì)控品引入的偏倚不確定度，試樣的測量不確定度將會被嚴重低估。因此本研究提出了實驗室配制質(zhì)控品標稱值不確定度的評定方法（公式（15）—（17）），考慮到檢測實驗室的可操作性，對不確定度評定過程進行了一定的簡化處理。粉末質(zhì)控品未考慮含水量差異、均勻性、穩(wěn)定性等因素引入的不確定度；基因組DNA質(zhì)控品未考慮用數(shù)字PCR測量拷貝數(shù)濃度過程中微滴體積差異、微滴識別，以及均勻性、穩(wěn)定性等因素引入的不確定度。與有證標準物質(zhì)相比，實驗室評定的配制樣品標稱值的不確定度偏低，因此，實驗室在檢測過程中要優(yōu)選有證標準物質(zhì)作為陽性定量質(zhì)控品。

4 結(jié)論

基于我國的標準物質(zhì)體系建設情況，建立了轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果“自上而下”的不確定度評定方法。在評定測量方法精密度引入的不確定度時，用有證標準物質(zhì)評定會低估測量不確定度，檢測實驗室要優(yōu)先選擇用常規(guī)樣品評定測量方法精密度引入的不確定度。在評定偏倚不確定度時，原則上要選擇有證標準物質(zhì)作陽性定量質(zhì)控品，在沒有有證標準物質(zhì)的情況下，允許用實驗室配制樣品作陽性定量質(zhì)控品，但實驗室要自行評定實驗室配制樣品標稱值的標準不確定度?？紤]到一般檢測實驗室的可操作性，提出了標稱值標準不確定度的簡易評定方法，雖然評定的標稱值標準不確定度偏低，但合成后評定的偏倚不確定度與有證標準物質(zhì)相近。每個檢測實驗室都要根據(jù)本實驗室的檢測數(shù)據(jù)評定自己的測量不確定度水平。在重復試驗條件下，實驗室評定的測量方法精密度不確定度可用于后續(xù)試樣定量檢測結(jié)果的不確定度評定，但隨著檢測數(shù)據(jù)的積累，檢測實驗室要定期更新測量不確定度評定數(shù)據(jù)，讓測量不確定度準確反映實驗室當前的測量水平。

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Development and application of top-down approaches for estimating measurement uncertainty of GMO quantitative results

LI Jun1, Zhao Xin2, CHEN Hong3, LI FeiWu4, Liang JinGang3, LI YunJing1, Wang HaoQian3, GAO HongFei1, Zhang Hua3, CHEN ZiYan3, WU Gang1, SHEN Ping3, XU LiQun3,WU YuHua1

1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of agricultural genetically modified organism traceability, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062;2Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300384;3Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100025;4Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033

【Objective】The enforcement of labeling regulations on genetically modified organisms (GMOs) requires establishing a standard system for accurate quantification of GMOs that includes the standard or guide for estimating measurement uncertainty (MU). It is urgent to establish a standardized top-down approach for estimating MU of quantitative results, which is conveniently adopted by the general testing laboratories. 【Method】There are two approaches for estimating the MU introduced by precision of quantitative method, one is to establish the equation of MU estimation using data obtained on 15 routine samples based on the "uncertainty function", the other is to evaluate the MU by repeatedly measuring a certified reference material (CRM) and calculating the intermediate precision. The uncertainty introduced by bias is evaluated using a CRM or a sample prepared by laboratory as bias control. The uncertainty of the nominal value of the sample prepared by laboratory is evaluated by using a simplified program based on the preparation process. The MU contributed by method precision and bias are combined into the standard uncertainty of the quantitative results, and then multiplied by the coverage factorto obtain the expanded uncertainty. 【Result】The event-specific PCR method of genetically modified maize DBN9936 was took as an example. The MU of method precision was evaluated to be 0.76% using simulated DBN9936 routine samples, and to be 0.33% using a CRM (GBW (E) 100901). Compared with routine samples, the MU of method precision evaluated using a CRM is significantly underestimated. The uncertainty introduced by bias was evaluated to be 0.26% using a CRM (GBW (E) 100901) as a bias control. Using a laboratory prepared powder sample and a genomic DNA sample (nominal values of 3.0%) as bias control, the bias uncertainty was evaluated to be 0.20% and 0.19%, respectively. Since the simplified program ignored some uncertainty components, the uncertainty of the nominal value of laboratory prepared samples was estimated to be smaller. By combining the MU of method precision and bias, the expanded uncertainty using routine samples was obtained to be 1.26%, 1.20%, and 1.20%, respectively, the expanded uncertainty using a CRM was 0.84%, 0.78%, and 0.76%, respectively. 【Conclusion】This study established the top-down approaches for MU estimation of quantitative results, testing laboratories should prioritize routine samples to estimate the MU contributed by the method precision, and select CRMs as bias control in principle to evaluate bias uncertainty during GMO quantification.

quantitative results of GMO content; measurement uncertainty; top-down approach; certified reference materials; bias control

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.002

2023-04-30；

2023-07-27

科技創(chuàng)新2030—重大項目（2022ZD0402010）

李俊，E-mail：lijuner@caas.cn。通信作者徐利群，E-mail：gmotest@126.com。通信作者武玉花，E-mail：wuyuhua@oilcrops.cn

（責任編輯 李莉）