槲寄生多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

蔣大珍，馬佰誠(chéng)，楊 皎，羅進(jìn)城，孫雪薇，李佳琳

（佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007）

槲寄生（Viscum coloratum）作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，歷史悠久，2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載并明確槲寄生為桑寄生科植物槲寄生，以冬季至次春采割，除去粗莖，切段，干燥，或蒸后干燥入藥，功能主治去風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、安胎元、用于風(fēng)濕痹痛[1]。研究表明，槲寄生含有的多糖具有細(xì)胞免疫和體液免疫作用，能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1 的分泌[2-3]。目前，植物多糖的提取方法包括熱水浸提、酸提取、堿提取、醇提取[4]、酶輔助提取、超聲輔助提取、微波輔助提取和超臨界萃取等多種方法。熱水浸提比較耗時(shí)，酸、堿提取容易破壞多糖結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)在熱水浸提、乙醇沉淀法基礎(chǔ)上輔以超聲波，進(jìn)行了單因素及響應(yīng)面工藝優(yōu)化試驗(yàn)的研究，以期減少提取時(shí)間、提高提取效率，尋求最優(yōu)提取工藝條件，并初步探究槲寄生的抗氧化活性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

槲寄生莖、葉于2022 年12 月采摘自黑龍江省佳木斯市樺川縣橫頭山鎮(zhèn)申家店村（130.652 9°N，46.602 23°E）。2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，2，2′-聯(lián)氮基雙二銨鹽購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，VC 購(gòu)自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，所用三蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制。

試驗(yàn)所用儀器為RE-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州生化儀器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（鄭州生化儀器有限公司）、KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、YB-FD-1 冷凍干燥機(jī)（上海億倍實(shí)業(yè)有限公司）、中藥粉碎機(jī)（長(zhǎng)沙步源制藥機(jī)械設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 槲寄生的預(yù)處理

將槲寄生莖、葉剪成小段洗凈，70 ℃烘箱烘干，粉碎，過(guò)篩（0.45 mm）后得到槲寄生粉末，將粉末浸泡于95%乙醇24 h，除去脂類雜質(zhì)，抽濾，濾渣烘干后作為提取原料。

1.2.2 槲寄生多糖的提取

稱取2 g 槲寄生粉末，每組3 份，按照一定料液比加入蒸餾水浸泡2 h 后放入超聲數(shù)控清洗機(jī)中，設(shè)置一定溫度、時(shí)間、功率進(jìn)行槲寄生多糖提取，抽濾取濾液，減壓濃縮到10 mL，加入4 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，4 500 r/min 離心10 min 收集沉淀，冷凍干燥2 d 得到槲寄生粗多糖[5-6]。

式中，W 表示槲寄生多糖得率（%）；m 表示干燥所得槲寄生多糖質(zhì)量（g）；M 表示槲寄生粉末質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

通過(guò)觀察多糖得率，探究不同因素（料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率）對(duì)槲寄生多糖得率的影響，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)。稱取2 g 槲寄生多糖粉末，固定料液比［1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）］、超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、超聲功率（0、200、300、400、500 W），其余操作同1.2.2。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以多糖得率作為響應(yīng)變量，選擇料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率4 個(gè)因素作為自變量，使用Design-Expert 13 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行4 因素3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Designed factor level of the response surface method

1.2.5 槲寄生粗多糖的分離

將提取工藝優(yōu)化后所得槲寄生粗多糖用蒸餾水復(fù)溶，按照1∶5 的比例加入Sevage 試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4），置于分液漏斗中，振蕩，去掉中間層變性蛋白和下層有機(jī)溶劑，重復(fù)多次，取上層多糖溶液，離心，取上清液濃縮至一定體積后裝入透析袋（截留3 500 Da）流水透析48 h，濃縮，所得多糖溶液加入無(wú)水乙醇至80%，4 ℃醇沉淀12 h，收集醇沉淀結(jié)果，分別用乙醚、丙酮潤(rùn)洗3 次，冷凍干燥后得到初步除鹽、除蛋白的槲寄生粗多糖。

1.3 槲寄生多糖抗氧化活性測(cè)定

精確稱取上述方法制備的干燥至恒重的槲寄生多糖粉末200 mg，蒸餾水溶解，定容至100 mL 容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的槲寄生多糖溶液，準(zhǔn)備7 支試管，分別稀釋成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的槲寄生多糖溶液備用。陽(yáng)性對(duì)照VC 溶液同上配制。

1.3.1 DPPH 自由基清除率測(cè)定

取上述不同濃度樣品溶液各2 mL，加入2 mL DPPH 醇（0.2 mmol/L）溶液，室溫避光反應(yīng)30 min。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，VC 溶液為陽(yáng)性對(duì)照，重復(fù)測(cè)定3 次。DPPH 自由基清除率[7-9]計(jì)算公式如下

式中，A0為2 mL 無(wú)水乙醇+2 mL DPPH 醇溶液的吸光度；A1為2 mL 樣品溶液+2 mL DPPH 醇溶液的吸光度；A2為2 mL 樣品溶液+2 mL 無(wú)水乙醇的吸光度。

1.3.2 ABTS 自由基清除率測(cè)定

配制7.4 mmol/L ABTS 溶液，2.6 mmol/L 過(guò)硫酸鉀溶液，等體積1∶1 混合，定容至100 mL，避光，室溫，反應(yīng)12 h，得到ABTS 儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇稀釋至A734nm=0.70±0.02，得到ABTS 工作液。取0.1 mL不同濃度槲寄生多糖溶液和陽(yáng)性對(duì)照VC 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL）加入3.9 mL ABTS工作液進(jìn)行反應(yīng)，常溫避光反應(yīng)10 min，在A734nm下測(cè)定混合溶液的吸光值A(chǔ)1，用無(wú)水乙醇代替ABTS工作液測(cè)定其吸光值，記為A2，等體積無(wú)水乙醇重復(fù)以上操作，記為A0，ABTS 自由基清除率計(jì)算公式[10]如下

1.3.3 三價(jià)鐵離子總還原力測(cè)定

吸取1 mL pH 值為6.6 的磷酸鹽緩沖液，加入1 mL 0.03 mol/L 的鐵氰化鉀，加入不同濃度槲寄生多糖溶液和陽(yáng)性對(duì)照VC 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL），50 ℃水浴20 min，加入1 mL 0.6 mol/L 三氯乙酸混勻，隨后加入2 mL 0.006 mol/L 的氯化鐵溶液，4 500 r/min 離10 min，取上清液于A700nm處測(cè)量吸光值，對(duì)照組取2 mL水代替氯化鐵溶液，空白組取1 mL 水代替樣品溶液[11]。重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 軟件分析數(shù)據(jù)、Design Expert 13 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)槲寄生多糖得率的影響

由圖1 可知，料液比為1∶20～1∶50（g∶mL）時(shí)，槲寄生多糖得率呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，料液比為1∶30（g∶mL）多糖得率最高，為3.85%；之后緩慢降低，1∶50（g∶mL）時(shí)多糖得率下降為3.36%，其原因可能是隨著提取溶劑體積的增加，多糖與溶劑面積增加，多糖浸出率也隨之增加；但料液比過(guò)高，也同時(shí)增加了其他物質(zhì)的溶出，抑制了多糖的浸出[12-13]。

圖1 料液比對(duì)槲寄生多糖得率的影響Figure 1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of mistletoe polysaccharide

由圖2 可知，當(dāng)超聲溫度為40 ℃時(shí)，多糖得率僅為2.28%，當(dāng)超聲溫度達(dá)70 ℃時(shí)，多糖得率為5.59%，但當(dāng)超聲溫度達(dá)80 ℃時(shí)，多糖得率反而降低，這是由于過(guò)高的溫度可能引起多糖氧化分解，使多糖得率降低[14]。

圖2 超聲溫度對(duì)槲寄生多糖得率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of mistletoe polysaccharide

由圖3 可知，當(dāng)超聲時(shí)間為10 min 時(shí)，多糖得率為7.34%，超聲時(shí)間為20 min 時(shí)，多糖得率達(dá)到頂峰，為8.60%，但超聲時(shí)間為30 min 時(shí)，多糖得率開(kāi)始急劇下降，僅為3.42%，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間超聲對(duì)多糖結(jié)構(gòu)造成破壞，影響多糖的溶出[15]。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)槲寄生多糖得率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on the yield of mistletoe polysaccharide

由圖4 可知，當(dāng)超聲功率達(dá)到300 W 時(shí)，多糖得率最高，為5.86%，隨著超聲功率的增加，多糖得率開(kāi)始持續(xù)下降，其原因可能是與在較大功率的超聲作用下，糖苷鍵發(fā)生斷裂有關(guān)[16]。因此，選擇最優(yōu)值附近進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 超聲功率對(duì)槲寄生多糖得率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic power on the yield of mistletoe polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

基于響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析，以料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）、超聲功率（D）作為獨(dú)立自變量，以槲寄生多糖得率作為因變量，得到以下二次項(xiàng)回歸方程

Y=8.300 00+0.055 80A-0.062 58B-0.032 50AD+0.095 75BC+0.095 00BD+0.020 00CD-0.049 74A2-1.100 00B2-1.110 00C2-0.964 90D2

2.2.1 方差分析結(jié)果

由表2 可知，多元函數(shù)方程模型的F 值為1.16，P 值小于0.000 1，表明回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而失擬項(xiàng)的P 值為0.698 7，大于0.05，表示模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，因此方程是可靠的；該方程的決定系數(shù)R2為0.954 9，說(shuō)明其數(shù)據(jù)擬合性好，可以用來(lái)代替試驗(yàn)數(shù)據(jù)，描述變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。校正系數(shù)R2Adj為0.909 8，表明模型能解釋槲寄生多糖得率的90.98%變化，而變異系數(shù)為4.930 0%，遠(yuǎn)低于10%，這表明非試驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果影響較小。根據(jù)各項(xiàng)F 值所知，各單因素對(duì)多糖得率的影響程度最大的是超聲溫度（C），其次是超聲時(shí)間（B）、超聲功率（D），最后是料液比（A）。其中，BC、A2、B2、C2、D2對(duì)多糖得率的影響極顯著（P<0.01），而其余項(xiàng)對(duì)指標(biāo)影響不顯著（P>0.05）。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Regression model analysis of variance

2.2.2 各因素二次項(xiàng)交互作用分析

由圖5 可知，在回歸模型方差分析結(jié)果基礎(chǔ)上，創(chuàng)建響應(yīng)面圖及等高線圖，以分析選定的各因素對(duì)槲寄生多糖得率的影響。響應(yīng)面圖和等高線圖可以清晰地展示交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度。當(dāng)響應(yīng)面曲面更為陡峭，等高線更為密集時(shí)，說(shuō)明影響程度更顯著。此外，如果等高線圖更接近橢圓形，表示兩個(gè)因素之間的交互作用更強(qiáng)；而如果等高線圖趨近圓形，則可以幾乎忽略兩個(gè)變量之間的交互作用[17-18]。由圖5 可知，表示超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)槲寄生多糖得率的交互作用，當(dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)，隨著超聲溫度的增加，槲寄生多糖得率減少；然而，當(dāng)超聲時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，隨著超聲溫度的增加，槲寄生多糖得率增加。響應(yīng)曲面的傾斜度高且坡度陡峭，表明超聲時(shí)間和超聲溫度之間的交互作用呈極顯著差異（P<0.01），這與表2 結(jié)果一致。由圖6 可知，超聲溫度和超聲功率的交互作用接近于圓形，表明兩者之間的交互作用幾乎可以忽略。

圖6 超聲溫度與超聲功率的交互作用對(duì)槲寄生多糖得率的影響Figure 6 The effect of interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic power on the yield of mistletoe polysaccharid

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程模型確定了最佳工藝參數(shù)：料液比1∶29.36（g∶mL）、超聲時(shí)間14.58 min、超聲溫度64.48 ℃、超聲功率271.09 W，在該條件下理論得率為8.74%，根據(jù)實(shí)際操作及試驗(yàn)條件，將其修正為料液比1∶29、超聲時(shí)間15 min、超聲溫度64 ℃、超聲功率300 W，在該條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，求取平均值，槲寄生多糖得率為8.17%，理論值與實(shí)際得率僅差0.57%，說(shuō)明該工藝優(yōu)化條件穩(wěn)定合理。

2.3 槲寄生多糖的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 槲寄生多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力

由圖7 可知，槲寄生多糖對(duì)DPPH 自由基具有明顯的清除效果，此外，隨著槲寄生多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)DPPH 自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，VC 溶液的清除率已達(dá)到95.90%，槲寄生多糖清除率也達(dá)到（79.07±0.60）%，其IC50為0.612 mg/mL，表明槲寄生多糖具有較好的抗氧化活性。

圖7 槲寄生多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力Figure 7 Scavenging ability of DPPH free radicals by mistletoe polysaccharides

2.3.2 槲寄生多糖對(duì)ABTS 自由基清除能力

由圖8 可知，在0.2～2.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，隨著槲寄生多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)ABTS 自由基的清除率也增加。當(dāng)濃度達(dá)到2.0 mg/mL 時(shí)，其對(duì)ABTS 自由基清除率為（51.38±0.29）%，IC50為2.611 mg/mL。由此可知，槲寄生多糖對(duì)ABTS 自由基的清除率與其對(duì)DPPH 自由基的清除率能力相比相對(duì)較弱。

圖8 槲寄生多糖對(duì)ABTS 自由基清除能力Figure 8 Scavenging ability of ABTS free radicals by mistletoe polysaccharides

2.3.3 槲寄生多糖對(duì)三價(jià)鐵離子總還原力

鐵離子總還原力主要基于氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中，多糖溶液中的活性成分將三價(jià)鐵離子還原成二價(jià)鐵離子，吸光度值越大，表明其總還原力越強(qiáng)，相應(yīng)地，表明該多糖抗氧化能力越好[19]。由圖9 可知，槲寄生多糖總還原力弱于VC 溶液，但隨著質(zhì)量濃度的增加，其總還原力呈上升趨勢(shì)，當(dāng)濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，其總還原力為（0.33±0.05），表明槲寄生多糖具有一定的還原能力。

圖9 槲寄生多糖對(duì)三價(jià)鐵離子總還原力Figure 9 Total reducing power of mistletoe polysaccharide on trivalent iron ions

綜上所述，槲寄生多糖對(duì)DPPH 自由基、ABTS自由基均有清除作用，對(duì)三價(jià)鐵離子具有還原作用，但槲寄生多糖對(duì)ABTS 自由基的清除率弱于對(duì)DPPH 自由基的清除率。

3 討論與結(jié)論

與傳統(tǒng)煎煮法相比，超聲輔助提取可以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放多糖等成分，多糖提取時(shí)間顯著縮短，雜質(zhì)少，超聲過(guò)程中產(chǎn)生熱效應(yīng)，增加了有效成分的溶解[20]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度升高時(shí)，分子的平均動(dòng)能增加，分子之間的碰撞頻率和能量也會(huì)增加，因此反應(yīng)速率會(huì)加快；同時(shí)溫度還可以影響反應(yīng)的平衡常數(shù)，即反應(yīng)物和生成物之間的比例，反應(yīng)溫度升高會(huì)使反應(yīng)的平衡常數(shù)向生成物方向移動(dòng)，因此，促進(jìn)多糖的生成。在本試驗(yàn)中，只有超聲溫度和超聲時(shí)間之間的交互作用對(duì)槲寄生多糖的得率有極顯著差異（P<0.01），其他因素之間的交互作用對(duì)多糖得率無(wú)顯著影響（P>0.05）。料液比與各因素之間的交互作用均不顯著（P>0.05），這可能與試驗(yàn)前浸泡2 h 有關(guān)；超聲功率本身對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P<0.05），但與超聲溫度之間的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響微小，這可能是由于參數(shù)設(shè)置的局限性所致。除上述原因外，還可能是與試驗(yàn)未考慮到其他的控制變量或其他試驗(yàn)因素的影響，今后可以進(jìn)行更大范圍的試驗(yàn)，更全面地研究?jī)蓚€(gè)因素之間的交互作用。

本試驗(yàn)以槲寄生莖、葉粉末為提取原料，通過(guò)采取超聲輔助的水提取和醇沉淀方法，經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法的優(yōu)化，確定了最佳的槲寄生多糖提取工藝條件：料液比1∶29（g∶mL）、超聲時(shí)間15 min、超聲溫度64 ℃、超聲功率300 W，此條件下槲寄生多糖得率為8.17%，與預(yù)測(cè)值接近，該方法與熱水浸提法相比，縮短了提取時(shí)間，能夠?yàn)殚渭纳嗵堑牧慨a(chǎn)提供參考。通過(guò)初步抗氧化活性分析，2 mg/mL 的槲寄生多糖對(duì)DPPH 自由基、ABTS 自由基清除率分別為79.07%和51.38%，IC50分別為0.612、2.611 mg/mL；對(duì)三價(jià)鐵離子總還原力為0.33，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，是一種天然的抗氧化劑，可以為槲寄生多糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。未來(lái)可以進(jìn)一步優(yōu)化超聲參數(shù)，深入研究槲寄生多糖的生物活性。