MC3T3-E1細胞成骨模型的應(yīng)用及研究進展*

曹志威 武曉蓉 邵國 趙志軍 張春陽

骨的再生修復一直是個世界性難題。骨骼具有很強的再生能力，具體表現(xiàn)在損傷（骨折）修復期間，以及成年后的骨骼發(fā)育和持續(xù)重塑過程中[1]。大量研究表明，骨修復與骨發(fā)育過程相似，其機制十分復雜，涉及多種細胞類型和細胞內(nèi)外分子信號通路[2-3]。骨不連、骨缺損或骨溶解等是臨床上常見的再生修復類型，目前治療手段非常有限，此類疾病都是因骨細胞分化成熟過程出現(xiàn)問題引起的。因此，在體外選取一種成骨細胞模型來探究骨生長及再生修復的分子機制是十分有必要的。

MC3T3-E1細胞（小鼠顱頂前骨細胞）是最常用的成骨樣細胞系之一，通常情況下，MC3T3-E1細胞在含抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松等誘導因子的培養(yǎng)基中能夠很好地向成骨細胞分化[4]，重現(xiàn)體內(nèi)成骨細胞的生長周期。該細胞現(xiàn)已被發(fā)展為研究細胞分化調(diào)節(jié)、細胞因子和激素調(diào)節(jié)、基質(zhì)蛋白的合成和分泌、骨骼疾病的分子機制和藥物藥代動力學的理想模型[5-9]。近年來，MC3T3-E1細胞培養(yǎng)也發(fā)展到對新型生物材料的細胞相容性和成骨活性方面的評估[10-11]。

本文就MC3T3-E1細胞成骨模型的培養(yǎng)、鑒定及應(yīng)用等方面進行綜述。以期明確MC3T3-E1細胞成骨模型的研究方向，并提出幾點新見解。

1 體外培養(yǎng)

MC3T3-E1細胞取自新生小鼠顱頂骨，是一種貼壁生長的成纖維細胞[12]。該細胞系有多個亞克隆，在含抗壞血酸培養(yǎng)基中的成骨分化與礦化能力各有不同[13]。MC3T3-E1亞克隆4和亞克隆14表現(xiàn)出高水平的成骨細胞分化能力，是當前研究者們首選的成骨模型。

不同組分的培養(yǎng)基對MC3T3-E1細胞增殖和成骨的影響有所不同。維生素C（Vitamin C, VC）是抗壞血酸的L-對映體，是生物體不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)[14]。Ⅰzumiya等[15]比較了是否含VC的α-MEM或DMEM培養(yǎng)基對MC3T3-E1細胞增殖和成骨的影響，結(jié)果顯示無論細胞密度如何，α-MEM都會促進細胞增殖，即使在不含VC的α-MEM中也是如此。此外，細胞在含或不含VC的DMEM培養(yǎng)基中增殖能力都明顯低于α-MEM培養(yǎng)基。這些結(jié)果表明VC并不是MC3T3-E1細胞的必需營養(yǎng)物質(zhì)，α-MEM似乎是此細胞培養(yǎng)的更優(yōu)選擇。在使用VC和β-甘油磷酸成骨誘導后，出現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象[15]，在額外添加VC的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞鈣化程度明顯高于在α-MEM培養(yǎng)基中自帶VC培養(yǎng)的細胞，這或許是因為商業(yè)α-MEM培養(yǎng)基中的VC失去了生物活性，而新鮮的VC發(fā)揮了重要作用。相反，使用DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來誘導成骨，其效果并不明顯，在3周時幾乎沒有鈣化。

上述研究表明，用于培養(yǎng)MC3T3-E1細胞的兩種主要培養(yǎng)液α-MEM和DMEM在增殖、成骨和鈣化等方面存在很大差異，這些差異影響了生物材料的評估，即使評估相同的材料，也可能產(chǎn)生不同的結(jié)果。目前大部分實驗對于該細胞的培養(yǎng)及成骨誘導所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基都是α-MEM，如何優(yōu)化培養(yǎng)基的成骨效果是研究者們下一步的研究方向。

2 鑒定方法

2.1 細胞形態(tài)

MC3T3-E1細胞在使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)時形態(tài)與成纖維細胞類似，呈梭形，而進行成骨誘導后細胞逐漸伸展呈多角形，并伸出多個樹枝狀突起，胞體和胞核逐漸變大[16]。大部分研究鑒定該成骨模型時未將細胞形態(tài)納入其評價指標，這些學者認為細胞形態(tài)與細胞狀態(tài)、代數(shù)及培養(yǎng)基的不同都有關(guān)系，甚至不同人培養(yǎng)出來的細胞形態(tài)可能都會略有差異，故單從細胞形態(tài)來判斷MC3T3-E1細胞成骨模型建立是否成功沒有意義。

形態(tài)決定功能，盡管細胞形態(tài)對于MC3T3-E1細胞成骨的鑒定沒有太大幫助，但對細胞成骨前后的形態(tài)對比研究可能會揭示細胞的某些功能。

2.2 堿性磷酸酶活力檢測

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）是成骨細胞的標志性酶，在MC3T3-E1細胞成骨早期產(chǎn)生，很容易在細胞表面找到[17]。文獻報道，MC3T3-E1細胞的ALP活力隨著成骨誘導時間的延長而增加[18]。

目前檢測成骨細胞中ALP表達的主要技術(shù)有基因檢測法、染色法和活力檢測法。傳統(tǒng)的ALP活力檢測基本原理是在特定條件下，ALP可以將底物對-硝基苯磷酸鹽（Para-nitrophenyl phosphate, PNPP）分解成對-硝基苯酚（p-Nitrophenol, PNP）和磷酸鹽，通過測定PNP的吸光度來間接反映ALP的活力[19]。雖然該方法已廣泛應(yīng)用于成骨細胞的鑒定，但仍存在靈敏度低、干擾強、可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果等問題。在過去的幾年里，隨著光學、電化學及熒光探針等新興材料的出現(xiàn)[20-21]，各種ALP活性分析方法得到了蓬勃發(fā)展。這將為檢測ALP活性提供更多潛在的原則和策略。

2.3 礦化結(jié)節(jié)染色

礦化結(jié)節(jié)是MC3T3-E1細胞分化成熟的標志[22]，同時也是其行使成骨功能的主要形態(tài)學表現(xiàn)。正常成骨條件下，細胞在培養(yǎng)至第14天后會有少量礦化結(jié)節(jié)形成，隨著誘導時間的延長，礦化結(jié)節(jié)逐漸增加[23]，且在一些促成骨藥物的作用下，礦化結(jié)節(jié)也可提前出現(xiàn)。

目前實現(xiàn)商品化的礦化結(jié)節(jié)染色方法包括Von Kossa法、茜素紅S法和四環(huán)素法[24-26]。Von Kossa法是礦化結(jié)節(jié)染色的經(jīng)典方法，但由于其特異性較差，在成骨培養(yǎng)中觀察到的陽性染色可能不僅僅是羥基磷酸鈣結(jié)節(jié)，也有可能是某些來源不明的營養(yǎng)不良礦化[27]，現(xiàn)在大多數(shù)實驗均不使用此方法。茜素紅S法是檢測礦化結(jié)節(jié)的最常用方法，它是一種蒽醌類衍生物，作為陰離子染料，能夠與鈣離子以螯合方式形成橘紅色或紫紅色復合物[24]。值得一提的是，茜素紅并不是鈣特異性染料，會受到其他金屬離子（如鎂、錳、鋇、鍶等）的干擾，但是這些離子含量往往很低，因此并不會影響最終的染色結(jié)果。與Von Kossa法相比，茜素紅S法的優(yōu)勢在于對少量的礦化結(jié)節(jié)能夠得到更可靠的結(jié)果。此外，四環(huán)素可以與礦化結(jié)節(jié)中的鈣離子螯合并形成熒光的磷酸復合物，這一特性使得四環(huán)素也可用來檢測成骨過程中的礦化情況[25]。

除上述三種染色方法外，研究者們還嘗試利用各種熒光染料對礦化結(jié)節(jié)進行檢測，Querido等[28]首次證實Giemsa可作為體外礦化結(jié)節(jié)的熒光染料。掃描電鏡通常用于觀察骨的膠原結(jié)構(gòu)，而廖乃順等[29]首次利用掃描電鏡來觀察成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，雖然該方法可更加精確地顯示礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量及微觀結(jié)構(gòu)，且具有一定的新穎性，但此方法成本較大，不利于推廣。

2.4 成骨相關(guān)基因檢測

在MC3T3-E1細胞成骨分化過程中，許多基因參與其中，如矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2, Runx2）、ALP、骨鈣素（osteocalcin, OCN）和骨橋蛋白（osteopontin, OPN）等。利用蛋白印跡法和聚合酶鏈式反應(yīng)等技術(shù)手段檢測這些基因的表達，往往也可作為一種佐證來判斷細胞是否成骨。正常成骨條件下，隨著誘導時間的延長，成骨相關(guān)基因的表達也隨之增加。但細胞和培養(yǎng)基的不同可能會使部分基因的表達出現(xiàn)略微差異。

在MC3T3-E1細胞正常成骨誘導過程中，成骨相關(guān)基因的表達在14天前大致呈上升趨勢[23]。茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)也在該時間節(jié)點出現(xiàn)，說明在此之后細胞可能已經(jīng)分化成熟。因此做成骨相關(guān)研究時，選取成骨誘導14天前的細胞較為合適。若培養(yǎng)周期過長，細胞污染幾率和時間成本也會增加。

3 細胞培養(yǎng)環(huán)境

MC3T3-E1細胞通常在體外二維微環(huán)境中培養(yǎng)。然而，該培養(yǎng)環(huán)境與成骨細胞的組織內(nèi)環(huán)境非常不同，不能完全模擬體內(nèi)骨環(huán)境。三維細胞培養(yǎng)技術(shù)是一種新穎的細胞培養(yǎng)技術(shù)，可以通過支架或特殊裝置模擬細胞在體內(nèi)的生長狀態(tài)[30]。水凝膠能模擬天然細胞外基質(zhì)的生物化學和力學環(huán)境，已被廣泛用于細胞培養(yǎng)和組織工程。Ⅰ型膠原是骨骼細胞外基質(zhì)的主要成分，其為成骨細胞提供了一個良好的培養(yǎng)環(huán)境。已經(jīng)證明，在3D膠原凝膠中培養(yǎng)細胞會影響細胞形態(tài)、細胞間相互作用和對可溶性因子的反應(yīng)[31]。Matthews等[32]將MC3T3-E1細胞接種于3D Ⅰ型膠原凝膠中，并與2D凝膠中培養(yǎng)的細胞進行比較，結(jié)果顯示，前者礦化結(jié)節(jié)及成骨細胞標志基因的上調(diào)出現(xiàn)較早。此外，有研究團隊研發(fā)出了3D羥基磷灰石（HAP）-多肽雜化水凝膠[33]，該水凝膠具有良好的生物相容性、機械穩(wěn)定性及低細胞毒性等特點，可長期用于細胞培養(yǎng)。

利用MC3T3-E1細胞來研究成骨細胞在體外的生物學變化成為當前的熱點。微重力（microgravity, MG）和輻射（radiation, RA）是太空中的主要環(huán)境因素[34]，對人體尤其是骨組織有多種影響。Dong等[35]模擬微重力和X射線單獨或聯(lián)合作用MC3T3-E1細胞，與對照組相比，細胞活性降低，成骨相關(guān)基因Runx2表達降低。等離子體能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，特別是活性氧（reactive oxygen species,ROS），各種實驗表明ROS可以影響細胞活性[36]。Tominami等[37]證明短期適當?shù)牡入x子體照射可促進MC3T3-E1細胞分化，且不會對細胞造成損傷，但其潛在機制仍不清楚。

隨著人們對MC3T3-E1細胞培養(yǎng)環(huán)境的研究進一步深入，越來越多骨骼疾病的發(fā)病機制被揭示。通過模擬不同情境下體內(nèi)骨細胞所處的微環(huán)境來探究某些疾病的發(fā)病機制已成為現(xiàn)階段的研究熱點。

4 細胞模型的體外應(yīng)用及優(yōu)劣勢

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨折風險增加、骨量減少和骨結(jié)構(gòu)紊亂為特征的全身代謝性骨骼疾病[38]。成骨細胞是骨的主要成分，對骨的發(fā)育和形成至關(guān)重要。骨形成在很大程度上取決于成骨細胞的數(shù)量和活性，成骨細胞功能障礙是導致骨質(zhì)疏松的直接原因[39]。因此，探索促進成骨細胞活性和分化的方法可能有助于預防骨質(zhì)疏松。MC3T3-E1細胞成骨模型是其理想選擇之一。

顱骨缺損通常由創(chuàng)傷、感染、腫瘤、先天性畸形或骨骼疾病引起[40]，骨重建是目前最主流的治療方法。顱骨修復過程中發(fā)揮主要作用的是前骨細胞和間充質(zhì)干細胞，二者向成骨細胞的分化能夠幫助缺損部位的快速修復。組織工程技術(shù)在近幾年發(fā)展迅速，一種典型方式是將合適的種子細胞和生長因子添加到可降解的多孔支架中[41]。MC3T3-E1細胞作為前骨細胞，在體外成骨后與支架結(jié)合能促進缺損部位的骨修復。

牙齒脫落后會導致牙槽骨的破壞和吸收減少[42]。這可能會給后期恢復拔除部位的美觀和功能帶來困難。目前最可靠、最有效的治療方法是用植骨材料填充拔牙后的缺損區(qū)[43]。利用體外實驗尋找一種促成骨因子或藥物是當下研究的熱點，不少研究者選擇MC3T3-E1細胞作為體外實驗的種子細胞。

原代培養(yǎng)的成骨細胞可以很好地模擬體內(nèi)成骨過程[44]，但存在增殖能力差、培養(yǎng)時間受限、轉(zhuǎn)染效率低等問題，在骨組織工程的應(yīng)用方面受到了限制。研究者們開發(fā)出了多種成骨細胞系，其中包括骨樣細胞MLO-Y4、骨肉瘤細胞MG-63、前骨細胞MC3T3-E1等。MC3T3-E1細胞的生物學功能與原代培養(yǎng)的成骨細胞最為接近，其增殖能力強、能無限傳代，并且作為成骨細胞的前體，可用于研究細胞的整個成骨過程。而其他成骨細胞系雖能無限傳代，但由于其取自成熟的骨細胞或瘤樣細胞，部分生物學特性與原代培養(yǎng)的成骨細胞略有不用，故不作為細胞成骨模型的首選。所以，在當前骨組織工程的大背景下，MC3T3-E1細胞被廣泛地用于研究成骨細胞的分化、增殖和分子機制，并且作為眾多疾病的靶細胞類型的首選。

盡管MC3T3-E1細胞是一種幾乎能替代原代人成骨細胞的體外模型，適用于各研究領(lǐng)域，但在臨床轉(zhuǎn)化方面，最令人擔憂的是物種差異，有一定的局限性。因此，應(yīng)謹慎推斷結(jié)果，根據(jù)具體研究情況得出結(jié)論。另外，目前商業(yè)化的MC3T3-E1細胞系來源于新生小鼠的顱頂骨，而在現(xiàn)階段的大部分研究中，MC3T3-E1細胞系多應(yīng)用于四肢骨的研究，顱頂骨的生長方式以膜內(nèi)成骨為主，而四肢骨則以軟骨內(nèi)成骨為主，二者的生長方式不一樣，當MC3T3-E1細胞應(yīng)用于四肢骨的成骨過程研究時所得出的結(jié)論是否嚴謹需要進一步討論。

5 展望

合適的細胞模型有助于更好地了解所涉及的生理、病理和再生過程。MC3T3-E1細胞是一種前骨細胞，其在早期具有較強的增殖、礦化和分化能力，已被廣泛用于研究成骨細胞在體外的生物學變化。必須指出的是，許多因素可以影響MC3T3-E1細胞的生長，例如，用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其添加劑、細胞接種密度及培養(yǎng)系統(tǒng)本身，這可能會導致不同的結(jié)果。長期以來，單層培養(yǎng)一直是MC3T3-E1細胞體外培養(yǎng)的標準方法。但這不能反映自然條件下的骨生長，因此人們對建立一個更接近細胞自然環(huán)境的細胞系統(tǒng)更感興趣。研究表明，在3D系統(tǒng)中培養(yǎng)的細胞，與普通培養(yǎng)的細胞有很大的差異，其更能體現(xiàn)細胞的真實狀態(tài)，這將會是未來研究的重點。此外，許多研究已經(jīng)將MC3T3-E1細胞成骨模型用于生物材料的評估，并將注意力放在參與細胞成骨的信號通路上。隨著研究深入和其他技術(shù)的發(fā)展，有望擴大其應(yīng)用前景。