云南省3個(gè)海拔區(qū)域滇牡丹主要葉部病害發(fā)生動(dòng)態(tài)分析

潘悅 楊貴釵 陳婉東 劉建福 王俊威 王娟

關(guān)鍵詞：云南??；滇牡丹；海拔區(qū)域；葉部病害；動(dòng)態(tài)分析

滇牡丹Paeo-nia dela'oayi屬芍藥科Paeoniaceae芍藥屬Paeonia，分布于滇中、滇西北至藏東南和川西南海拔1900～4000m的灌叢、林緣和林下等生境，是我國(guó)西南山地特有珍稀物種。滇牡丹表型性狀多樣、花色豐富，是具有較高觀賞價(jià)值的特有園藝資源，同時(shí)其籽油中富含a-亞麻酸等多種不飽和脂肪酸，根皮有抗炎、鎮(zhèn)痛等功效，因而發(fā)展滇牡丹種植產(chǎn)業(yè)對(duì)其優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保護(hù)和利用具有重要意義。

近年來，云南省多地積極開展滇牡丹人工種植，然而病害的發(fā)生，尤其葉部病害的廣泛傳播嚴(yán)重影響了滇牡丹植株的生長(zhǎng)、品質(zhì)與產(chǎn)量。目前對(duì)滇牡丹病害的報(bào)道非常有限，繆福俊等發(fā)現(xiàn)紅斑病、灰霉病和黑斑病是滇牡丹的主要病害，病原菌為牡丹枝孢Cladosporiurn paeonzae、牡丹葡萄孢Botrytispaeoniae和鏈格孢Alternarza alternata。而關(guān)于北方油用牡丹病害調(diào)查的報(bào)道則較多，研究表明山東菏澤牡丹栽培區(qū)紅斑病發(fā)生普遍，80%的園區(qū)發(fā)病率在50%左右，重病園區(qū)發(fā)病率為90%，病情指數(shù)達(dá)20以上。該病于3月底至4月初發(fā)病，6月中旬至7月下旬為發(fā)病高峰，發(fā)生嚴(yán)重度與初侵染源、牡丹品種及土壤酸堿度等因素相關(guān)。宣俊好等對(duì)洛陽市4個(gè)牡丹種植區(qū)葉部病害樣本進(jìn)行分離鑒定，確定主要病害紅斑病、炭疽病和黑斑病的病原菌分別為枝孢Cladosporiurn sp、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和鏈格孢Alternar-ia alternata。長(zhǎng)沙地區(qū)的菏澤牡丹主要病害為灰霉病、褐斑病、紅斑病、枝枯病和根腐病，發(fā)病高峰期為6月-8月，且病情隨降雨量的增加而加重。趙旭等對(duì)甘肅臨洮紫斑牡丹重點(diǎn)栽培區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其葉部病害為灰霉病、褐斑病、白粉病和病毒病。由此表明，葉部病害在牡丹組植物中尤為普遍，不同區(qū)域不同牡丹種類病害發(fā)生情況各有不同。

云南省是滇牡丹主要分布區(qū)，目前該區(qū)域葉部病害的發(fā)生動(dòng)態(tài)未見報(bào)道。本研究通過選取云南省3個(gè)滇牡丹原生地所處海拔區(qū)域的種植基地開展葉部病害調(diào)查，結(jié)合不同區(qū)域的溫度和降雨變化，探討海拔、溫度和降雨等環(huán)境因素對(duì)滇牡丹病害發(fā)生的影響，為滇牡丹病害防治提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣地選擇

2021年3月至10月間，對(duì)云南省3個(gè)滇牡丹種植基地開展病害調(diào)查（樣地具體信息詳見表1），種植的滇牡丹均為4年生苗木。根據(jù)種植地實(shí)際面積，選取玉溪市梁王山和香格里拉高山植物園各1個(gè)樣地，玉溪市稗子鄉(xiāng)3個(gè)樣地，每個(gè)樣地1334m2，對(duì)滇牡丹葉部病害的主要種類和危害程度進(jìn)行調(diào)查。每個(gè)滇牡丹樣地內(nèi)取3份土樣等量混合后用四分法取10g風(fēng)干土樣，過篩混勻后按水土比2.5：1使用pH計(jì)進(jìn)行土壤pH的測(cè)定。

1.2調(diào)查方法

每個(gè)樣地采用五點(diǎn)取樣法，每月中旬定點(diǎn)定株調(diào)查滇牡丹葉部病害種類及危害程度，每點(diǎn)50株，共計(jì)250株。滇牡丹紅斑病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照吳玉柱等，其他葉部病害參照易圖永等的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)每塊樣地不同病害的發(fā)病率及病情指數(shù)，發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)／調(diào)查株數(shù)×100%；病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）／（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）×100。

同時(shí)通過中國(guó)氣象網(wǎng)（ http：∥WWW．weather．com. cn/）杏詢記錄調(diào)杏樣地所在區(qū)域每月的月平均溫度和降雨量。

1.3滇牡丹葉部病害的樣品采集及病原真菌的分離純化

每月在不同海拔區(qū)域滇牡丹種植基地分東西南北4個(gè)方位，每個(gè)方位隨機(jī)采集4片癥狀明顯的發(fā)病葉片編號(hào)裝入自封袋后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離鑒定。從滇牡丹葉片病健交界處取0.5cm×0.5cm的組織，洗凈晾干后，經(jīng)75%乙醇浸泡2min，0.5%次氯酸鈉溶液浸泡1min，無菌水漂洗3次，自然風(fēng)干后，用滅菌鑷子將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，每皿4塊，25℃黑暗培養(yǎng)3～5d。分別挑取接種組織周圍不同形態(tài)菌落的邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)后將其純化至單菌落，并接種于PDA斜面4℃保藏。

1.4滇牡丹葉部病害病原真菌的初步鑒定

將純化后不同菌落形態(tài)的代表菌株接種于PDA培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)7d后，觀察菌落的形態(tài)、顏色和質(zhì)地等，并將鏈格孢屬、枝孢屬和刺盤孢屬代表菌株分別接種于馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、PDA和玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA），25℃自然光照培養(yǎng)5～10d，通過光學(xué)顯微鏡觀察菌株的分生孢子梗、分生孢子等結(jié)構(gòu)。

1.5數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016對(duì)滇牡丹3個(gè)海拔區(qū)域調(diào)查樣地每月的病害發(fā)病率及病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 17.0分析主要病害在不同海拔區(qū)域發(fā)病率、病情指數(shù)與溫度、降雨量的相關(guān)性。使用Origin2018作圖。

2結(jié)果與分析

2.1滇牡丹主要葉部病害癥狀特征

通過對(duì)云南省3個(gè)海拔區(qū)域滇牡丹種植基地的病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)稗子鄉(xiāng)和梁王山種植的滇牡丹4月初開始出現(xiàn)葉部病害癥狀，8月底逐漸進(jìn)入枯萎期，香格里拉種植的滇牡丹受高寒氣候影響，6月初開始出現(xiàn)病狀，10月底進(jìn)入枯萎期。3個(gè)海拔區(qū)域種植的滇牡丹葉部病害主要有黑斑病、紅斑病和炭疽病。其中黑斑病在發(fā)病前期葉片上出現(xiàn)圓形或橢圓形褐色小斑，隨后病斑逐漸擴(kuò)大，中部顏色更深或呈灰褐色。潮濕天氣感病部位會(huì)覆黑色霉層，嚴(yán)重時(shí)病斑連片、穿孔，導(dǎo)致枯死和提前落葉（圖1a～c）。紅斑病前期葉尖和葉緣出現(xiàn)綠色或黃色針尖狀小斑，隨后逐漸擴(kuò)大至圓形或不規(guī)則紫褐色病斑，后期病斑連片、枯焦（圖1d～f）。炭疽病前期葉片出現(xiàn)圓形或不規(guī)則褐色小斑，病斑逐漸擴(kuò)大，中央灰白色，邊緣黃褐或紫褐色，受主脈和大側(cè)脈限制，嚴(yán)重時(shí)病斑中部呈穿孔狀（圖1g～i）。

2.2滇牡丹同種葉部病害在云南省3個(gè)海拔區(qū)域的發(fā)生動(dòng)態(tài)

如圖2a～b所示，稗子鄉(xiāng)和梁王山滇牡丹種植基地4月初出現(xiàn)黑斑病癥狀，5月-8月發(fā)病率和病情指數(shù)持續(xù)升高，8月發(fā)病率高達(dá)92.13%和86.80%，病情指數(shù)為39.42和42.44。香格里拉高山植物園滇牡丹6月開始出現(xiàn)癥狀，隨后發(fā)病率和病情指數(shù)快速上升，8月后發(fā)病率增幅變緩，病害持續(xù)至10月，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為75.20%和40.50。三地的滇牡丹黑斑病發(fā)病率呈現(xiàn)隨海拔升高逐漸減弱的趨勢(shì)。

稗子鄉(xiāng)和梁王山種植基地的滇牡丹均在4月初開始出現(xiàn)紅斑病癥狀，隨后發(fā)病率和病情指數(shù)上升，其中梁王山紅斑病發(fā)病率和病情指數(shù)較高，8月分別達(dá)76.40%和45.07。香格里拉高山植物園滇牡丹自6月開始出現(xiàn)紅斑病癥狀，發(fā)病率和病情指數(shù)持續(xù)上升，10月達(dá)到發(fā)病高峰，分別為81.60%和31.40。結(jié)果表明，梁王山和香格里拉的滇牡丹紅斑病發(fā)生較為嚴(yán)重（圖2c～d）。

炭疽病較黑斑病和紅斑病危害輕，稗子鄉(xiāng)和梁王山的炭疽病發(fā)病率和病情指數(shù)緩慢上升，其中稗子鄉(xiāng)的發(fā)病率和病情指數(shù)相對(duì)較高，8月分別為52.00%和26.68，而香格里拉的滇牡丹炭疽病僅少量發(fā)生，10月發(fā)病率為8.40%，與黑斑病發(fā)生情況類似，該病的危害程度有隨海拔升高逐漸減弱的趨勢(shì)（圖2e～f）。

2.3滇牡丹3種葉部病害在云南省同一海拔區(qū)域的發(fā)生動(dòng)態(tài)

如圖3a～b所示，對(duì)于同一種植基地，稗子鄉(xiāng)3種滇牡丹病害的發(fā)病率和病情指數(shù)均隨時(shí)間推移逐漸升高，其中黑斑病發(fā)病率和病情指數(shù)急劇上升，為該地最嚴(yán)重的病害，其次是炭疽病，紅斑病發(fā)病率和病情指數(shù)增幅較為緩慢，8月僅為43.07%和21.18，發(fā)病較輕。

梁王山3種滇牡丹病害中紅斑病和黑斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)隨時(shí)間推移快速上升，其中紅斑病在4月-7月發(fā)病率高于黑斑病，8月黑斑病發(fā)病率（86.80%）高于紅斑?。?6.40%），但二者8月的病情指數(shù)較為接近，分別為42.44和45.07。炭疽病發(fā)病率和病情指數(shù)呈緩慢上升的趨勢(shì)，發(fā)病相對(duì)較輕，8月僅為22.80%和19.60（圖3c～d）。

香格里拉的滇牡丹黑斑病和紅斑病發(fā)生嚴(yán)重，二者的發(fā)病率和病情指數(shù)隨時(shí)間推移上升幅度較快，10月發(fā)病率分別達(dá)75.20%和81.60%，而黑斑病的病情指數(shù)在8月后快速上升，10月達(dá)到40.50，后期高于紅斑病（31.40）。炭疽病的發(fā)病率和病情指數(shù)在滇牡丹整個(gè)生長(zhǎng)期增幅較緩，僅少量發(fā)生（圖3e～f）。

2.4滇牡丹3個(gè)海拔區(qū)域月均溫度、降雨量與葉部病害發(fā)病程度的相關(guān)性

根據(jù)氣象資料顯示，稗子鄉(xiāng)和梁王山滇牡丹種植基地月平均溫度和降雨量4月開始急劇上升，6月-8月為持續(xù)高峰期，與兩地滇牡丹病害的發(fā)生動(dòng)態(tài)相吻合。同時(shí)，稗子鄉(xiāng)每月的平均溫度和降雨量較高，6月-8月高峰期月均溫度在21～22℃，月均降雨量在180～220mm的范圍，其次是梁王山和香格里拉，三地的月平均溫度和降雨量隨海拔升高而降低，與滇牡丹黑斑病和炭疽病隨海拔升高病害嚴(yán)重度逐漸減弱的趨勢(shì)基本一致。

滇牡丹不同海拔區(qū)域3種葉部病害與溫度、降雨量的相關(guān)性如表2所示。其中稗子鄉(xiāng)的滇牡丹紅斑病、炭疽病發(fā)病率與月平均溫度顯著相關(guān)（P<0.05），該地的黑斑病病情指數(shù)與月平均溫度顯著相關(guān)（P<0.05），紅斑病和炭疽病病情指數(shù)與月平均溫度相關(guān)性極顯著（P<0.01）。而梁王山和香格里拉的滇牡丹病害發(fā)病率、病情指數(shù)與月平均溫度無顯著相關(guān)性（P>0.05）。

稗子鄉(xiāng)滇牡丹3種病害的發(fā)病率、病情指數(shù)與月平均降雨量呈顯著或極顯著正相關(guān)。梁王山黑斑病的發(fā)病率、病情指數(shù)與月平均降雨量顯著相關(guān)（P<0.05），而香格里拉種植的滇牡丹病害發(fā)病率、病情指數(shù)與月降雨量無顯著相關(guān)性（P>0.05）。

2.5滇牡丹主要葉部病害病原菌的初步鑒定及數(shù)量統(tǒng)計(jì)

滇牡丹主要葉部病害病原菌的形態(tài)如圖5所示。黑斑病病原菌菌落初期為白色，隨后顏色加深為淺灰色，背面中央深褐至黑色，邊緣顏色較淺（圖5a），分生孢子為深褐色，單生或鏈狀，卵形或長(zhǎng)橢圓形，有橫隔和縱隔（圖5d）。紅斑病病原菌菌落正面深綠色，背面墨綠色（圖5b），分生孢子橢圓形或不規(guī)則形（圖5e）。炭疽病病原菌菌落正面由初期白色變?yōu)闇\灰色，菌絲短絨毛狀，背面中央為深灰色，邊緣較淺（圖5b），分生孢子單胞，透明，橢圓形，內(nèi)含物顆粒狀，均勻分布（圖5f）。根據(jù)菌落及分生孢子形態(tài)，初步確定黑斑病、紅斑病和炭疽病的病原菌分別為鏈格孢屬Alternaria、枝孢屬Cladosporiurn和刺盤孢屬Colletotrichum真菌。

3結(jié)論與討論

滇牡丹在云南省3個(gè)海拔區(qū)域種植基地的葉部病害主要有黑斑病、紅斑病和炭疽病，這與宣俊好等報(bào)道的洛陽地區(qū)牡丹3種主要葉部病害種類相一致。本研究中，黑斑病發(fā)生普遍且最為嚴(yán)重，8月3個(gè)試驗(yàn)基地的發(fā)病率均在60%以上，其中稗子鄉(xiāng)種植基地的發(fā)病率高達(dá)92.13%，這與湖南省中原牡丹病害高峰期黑斑病的發(fā)病率在50%以上，嚴(yán)重的種植基地發(fā)病率為100%相似。紅斑病在梁王山和香格里拉病害高峰期的發(fā)病率分別為76.40%和81.60%，病情指數(shù)為31.40和45.07，與湖南和山東菏澤牡丹種植基地的調(diào)查結(jié)果基本一致。

病害調(diào)查過程中，通過對(duì)典型病害的發(fā)病葉片進(jìn)行采樣及病原菌的分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，確定了滇牡丹黑斑病、紅斑病和炭疽病的病原真菌分別為鏈格孢屬Alternaria、枝孢屬Cladosporiurn和刺盤孢屬Colletotrichurn.真菌，與段亞冰、繆?？〉?、宣俊好等研究報(bào)道基本相符。結(jié)合多基因片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和形態(tài)學(xué)鑒定，顯示滇牡丹黑斑病、紅斑病和炭疽病病原涉及鏈格孢屬、枝孢屬及刺盤孢屬的數(shù)十個(gè)種，種類多樣性較為豐富，進(jìn)而表明滇牡丹同種葉部病害可能由同屬的多個(gè)真菌種類共同侵染所致（另文發(fā)表）。

土壤pH對(duì)牡丹病害也能產(chǎn)生一定影響。吳玉柱等的研究表明，在堿性土壤環(huán)境中，土壤pH越高，牡丹紅斑病發(fā)病越重，本研究中稗子鄉(xiāng)種植區(qū)的滇牡丹紅斑病發(fā)病相對(duì)較輕，可能與其土壤的弱堿性（pH 7.97）有關(guān)。而梁王山和香格里拉滇牡丹試驗(yàn)基地的紅斑病發(fā)病較重，其土壤均為弱酸性。杜鵬研究表明，土壤pH為7.5、6.5的山核桃苗干腐病病斑直徑及病情指數(shù)較土壤pH為4.5、5.5的山核桃苗低，然而滇牡丹紅斑病的發(fā)生與土壤的pH是否有直接關(guān)系還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

海拔高度和溫濕度是影響滇牡丹病害發(fā)生的重要環(huán)境因素。本研究中，黑斑病和炭疽病的發(fā)病率以及病情指數(shù)呈現(xiàn)隨海拔升高病害逐漸減弱的趨勢(shì)。原因可能是低海拔區(qū)域的溫度適宜病原菌的生長(zhǎng)和定殖，同時(shí)，雨量豐富、田間濕度大利于病原菌孢子的萌發(fā)，并能借助雨水和氣流加劇分生孢子的侵染和傳播。本研究中，稗子鄉(xiāng)和梁王山種植基地的病害發(fā)生動(dòng)態(tài)與月平均溫度、降雨量的變化規(guī)律基本一致，表明高溫高濕利于病害發(fā)生，因而推斷低海拔且溫濕度較大的區(qū)域滇牡丹葉部病害發(fā)生較重。結(jié)合相關(guān)性分析，稗子鄉(xiāng)3種滇牡丹病害的發(fā)病程度與月平均溫度、降雨量顯著或極顯著正相關(guān)，梁王山黑斑病與月平均降雨量顯著相關(guān)，表明兩地的病害發(fā)生動(dòng)態(tài)與溫度、降雨量存在密切的關(guān)聯(lián)。而香格里拉的發(fā)病程度與溫度和降雨量無顯著相關(guān)性，推測(cè)香格里拉的地理位置特殊、氣候條件復(fù)雜多變，病害的形成可能還受其他環(huán)境因素的影響。

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，3個(gè)海拔區(qū)域的滇牡丹葉部病害除黑斑病、紅斑病和炭疽病外，梁王山種植基地7月-8月還有部分白粉病和灰霉病發(fā)生，由于這2種病害在另外2個(gè)基地并未發(fā)現(xiàn)，因此本文沒有對(duì)其發(fā)生規(guī)律進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。3個(gè)海拔區(qū)域的滇牡丹在病害高峰期往往同一葉片存在多種病害復(fù)合侵染的現(xiàn)象，推測(cè)其原因是單一病害的侵染造成植株損傷，導(dǎo)致其系統(tǒng)抗性下降，從而更易遭受其他病害的侵襲。目前針對(duì)滇牡丹多種病害同時(shí)發(fā)生的情況通常采用交替使用廣譜類殺菌劑或是殺菌劑復(fù)配的方法進(jìn)行防治。鑒于不同海拔區(qū)域的滇牡丹病害發(fā)病時(shí)間不同，稗子鄉(xiāng)和梁王山可選擇在4月底5月初開始防治，而香格里拉的防治時(shí)間可延后至6月底7月初。此外，種子的遺傳背景作為決定其抗病性的重要因素，加強(qiáng)主要病害抗病種質(zhì)資源的選育，也可作為將來滇牡丹推廣種植過程中病害防治的有效途徑。