分散固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)大豆植株及土壤中煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物殘留

王寬 魏龍兵 任業(yè)雙 潘興魯 吳小虎 徐軍 董豐收 鄭永權(quán)

關(guān)鍵詞：煙嘧磺隆；莠去津；代謝物；農(nóng)藥殘留；大豆植株；土壤

煙嘧磺?。╪icosulfuron）（圖1）是一種磺酰脲類除草劑，其可抑制乙酰乳酸合成酶活性，影響植物分生組織的分化，使植株生長(zhǎng)停滯，莖葉褪綠并逐漸死亡。煙嘧磺隆主要用于防治玉米田一年生和多年生禾本科雜草和部分闊葉雜草。莠去津（atrazine）（圖1）是一種三嗪類除草劑，其可抑制光合作用中的希爾反應(yīng)，降低植物中CO2的固定速率，導(dǎo)致植物失綠干枯死亡，在玉米生產(chǎn)中廣泛用于出苗前后雜草的防控。煙嘧磺隆和莠去津難降解，在土壤中的半衰期較長(zhǎng)，并且莠去津在土壤中可轉(zhuǎn)化為羥基莠去津、脫乙基莠去津、脫異丙基莠去津、脫乙基羥基莠去津、脫乙基脫異丙基莠去津和脫異丙基羥基莠去津等6種主要代謝物（圖1）。其中，脫乙基莠去津和脫異丙基莠去津是土壤中最常見(jiàn)的降解產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的水溶性、極性和穩(wěn)定性，其活性與母體活性水平相當(dāng)。羥基莠去津吸附性強(qiáng)，易滯留于土壤中。并且脫乙基莠去津、脫異丙基莠去津、羥基莠去津和母體莠去津具有相同的毒性模式，這3個(gè)代謝物對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康會(huì)存在威脅，因此常被同時(shí)監(jiān)測(cè)。在我國(guó)煙嘧磺隆和莠去津在玉米田中使用量大，并且兩種農(nóng)藥會(huì)被同時(shí)使用防除雜草，截至目前，中國(guó)已有365個(gè)煙嘧磺隆和莠去津復(fù)配制劑產(chǎn)品（包含其他除草劑）登記。已有研究表明，由于玉米田過(guò)量施用煙嘧磺隆和莠去津，導(dǎo)致土壤中除草劑殘留高，影響后茬作物大豆的生長(zhǎng)。因此，煙嘧磺隆和莠去津產(chǎn)生的殘留藥害問(wèn)題及科學(xué)規(guī)范使用應(yīng)得到重視。

2022年中央一號(hào)文件明確指出要大力實(shí)施大豆和油料產(chǎn)能提升工程，在黃淮海、西北、西南地區(qū)推廣玉米大豆帶狀復(fù)合種植。隨著復(fù)合種植面積逐步擴(kuò)大，大豆產(chǎn)地土壤中煙嘧磺隆和莠去津的殘留水平直接影響了大豆的安全生產(chǎn)。然而，目前有關(guān)煙嘧磺隆和莠去津的分析方法多是只針對(duì)母體化合物的檢測(cè)，忽略了莠去津代謝物在土壤和后茬作物中的殘留?；诖耍狙芯拷⒘艘环N固相分散萃取一超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法，可同時(shí)測(cè)定土壤和大豆植株中煙嘧磺隆和莠去津及其代謝物殘留量，以期為煙嘧磺隆和莠去津的科學(xué)使用及后茬作物的安全種植提供有效監(jiān)測(cè)方法。

1材料與方法

1.1農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：煙嘧磺?。兌?9.0%），沈陽(yáng)化工研究院；莠去津（純度99.2%）、脫異丙基莠去津（純度98.9%）、脫乙基莠去津（純度98.0%）和羥基莠去津（純度96.8%），德國(guó)Dr．Ehrenstorfer Gm-bH公司。超純水由Genie E（上海樂(lè)楓生物科技有限公司，中國(guó)）制得；乙二胺一N一丙基硅烷化硅膠（PSA，40um）和石墨化炭黑（GCB，40um），天津博納艾杰爾科技有限公司；色譜級(jí)甲酸和乙腈，Sigma-Aldrich公司；分析級(jí)乙腈、氯化鈉和無(wú)水MgS04，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器設(shè)備

Agilent 1290-6470A超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜，Agilent公司（美國(guó)）；XW-80A渦旋混合器、高速振蕩儀，Scientific industries（美國(guó)）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；醫(yī)用無(wú)菌注射器，上海治宇醫(yī)療器械有限公司。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線

用電子分析天平準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于100mL棕色容量瓶中，加入色譜級(jí)乙腈溶解并定容，得到100mg/L的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)混合溶液母液。將母液逐級(jí)梯度稀釋，制備得到系列濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液用空白大豆植株和土壤基質(zhì)的提取液逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)品母液得到。分別以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4樣品前處理方法

稱取5.0g均質(zhì)大豆植株（幼苗期至鼓粒期）和土壤樣品分別置于50mL聚四氟乙烯離心管中（土壤樣品加入5mL超純水），加入10mL乙腈（含2%甲酸），振蕩10min，加入1gNaCI和4g無(wú)水MgS04繼續(xù)振蕩5min，4000r/min離心5min，用移液管吸取1.5mL上清液至內(nèi)含吸附劑（土壤樣品使用50mg PSA+150mg無(wú)水MgS04，大豆植株樣品使用50mg PSA 50mg GCB 150mg無(wú)水MgS04）的2mL離心管中，渦旋2min，5000r/min離心5min，使用2.5 mL無(wú)菌注射器抽取上清液，過(guò)0.22um有機(jī)濾膜至進(jìn)樣小瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.5UPLC-MS/MS分析條件

色譜條件：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1mm×50mm，1.9um）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A：0.2%甲酸水；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：5uL;梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式（ESI+），干燥氣溫度325℃，干燥氣流速10L/min。霧化氣壓力50psi，鞘氣溫度400℃，鞘氣流速12L/min，毛細(xì)管電壓4000V，噴嘴電壓500V；數(shù)據(jù)采集采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

1.6方法驗(yàn)證

根據(jù)NY/T 788-2018農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則要求，通過(guò)添加回收試驗(yàn)對(duì)方法的準(zhǔn)確性、精密度、線性、定量限和基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）進(jìn)行驗(yàn)證。分別將煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白大豆植株和土壤均質(zhì)樣品中，設(shè)置3個(gè)添加水平，分別為0.01、0.10、1.00mg/kg。按1.4條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。按照NY/T 788-2018要求，方法范圍內(nèi)所有分析物的平均回收率應(yīng)在70%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）≤20%。基質(zhì)效應(yīng)（ME）=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率／溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）×100%，一般基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%之間可忽略基質(zhì)效應(yīng)。

通過(guò)比較乙腈和含2%甲酸的乙腈作為土壤和大豆植株樣品提取劑時(shí)目標(biāo)化合物的回收率，來(lái)確定樣品的提取溶劑。PSA和GCB是農(nóng)藥殘留分析中常用的凈化吸附劑，PSA可吸附有機(jī)酸，某些糖等極性化合物，GCB可吸附色素。通過(guò)比較不使用吸附劑、使用PSA以及使用PSA與不同量GCB組合對(duì)土壤和大豆植株樣品提取液的凈化效果和目標(biāo)化合物的回收率，來(lái)確定樣品的凈化吸附劑。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑選擇

比較乙腈和含2%甲酸的乙腈作為土壤和大豆植株樣品提取劑時(shí)目標(biāo)化合物的回收率，結(jié)果（圖2）表明，當(dāng)使用乙腈作為提取劑時(shí)，土壤和大豆植株中5種目標(biāo)化合物的回收率分別在20%～108%和27%～145%范圍內(nèi)。使用含2%甲酸的乙腈時(shí)，土壤和大豆植株中5種目標(biāo)化合物的回收率分別在60%～103%和75%～97%范圍內(nèi)，提取效果比乙腈好。在提取溶劑中加入適量酸有助于提高目標(biāo)化合物的回收率。因此本研究中土壤和大豆植株樣品均使用含2%甲酸的乙腈提取。

2.2吸附劑選擇

比較了不使用吸附劑、使用PSA以及使用PSA與不同量GCB組合對(duì)土壤和大豆植株樣品提取液凈化吸附的效果（圖3）和目標(biāo)化合物的回收率（圖4）。隨著GCB用量增加，土壤和大豆植株提取液被凈化得更好。但是對(duì)于土壤樣品，目標(biāo)化合物的回收率隨著GCB用量增加而逐漸降低。不使用吸附劑、使用50mg PSA.50mg PSA+10mg GCB.50mgPSA+30mg GCB.50mg PSA+50mg GCB時(shí)，土壤提取液中5種目標(biāo)化合物的回收率分別在71%-110%.71%～105%.60%-103%.36%-93%.26%～88%范圍內(nèi)。而當(dāng)不使用吸附劑、使用50mgPSA.50mg PSA+10mg GCB.50mg PSA+30mgGCB.50 mg PSA+50 mg GCB.50 mg PSA+70 mgGCB時(shí)，大豆植株樣品提取液中5種目標(biāo)化合物的回收率分別在90%～100%、72% -97%、76%～113%、75%-97%、70%-113%、64%-107%范圍內(nèi)。綜合考慮凈化后的回收率和樣品澄清度，選擇50mg PSA作為土壤樣品的凈化吸附劑，50mg PSA+50mg GCB作為大豆植株樣品的凈化吸附劑。

2.3方法正確度、精密度、線性、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

平均回收率和RSD結(jié)果（表3）表明：在0.01～1.00mg/kg添加水平下，煙嘧磺隆、莠去津及其3個(gè)代謝物在土壤和大豆植株中的平均回收率分別在71%～105%和70%～113%之間，RSD分別在0.3%～10.3%和2.1%～11.8%之間（n=5）。由表4可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)5種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2≥0.984 1，5種目標(biāo)化合物的LOQ為0.01mg/kg。該方法正確度、精密度、線性和LOQ良好，符合農(nóng)藥殘留分析要求。

在土壤和大豆植株中5種目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)分別為60%～140%和20%～80%。其中大豆植株對(duì)煙嘧磺隆、莠去津、脫乙基莠去津和脫異丙基莠去津具有基質(zhì)抑制效應(yīng)，對(duì)羥基莠去津基質(zhì)效應(yīng)不明顯。土壤對(duì)脫乙基莠去津和脫異丙基莠去津具有基貢抑制效應(yīng)，對(duì)羥基莠去津具有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而對(duì)煙嘧磺隆和莠去津基質(zhì)效應(yīng)不明顯。因此，為了更好地定量分析，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)以降低基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.4實(shí)際樣品分析

基于上述開(kāi)發(fā)的方法，對(duì)采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)不同農(nóng)田的幼苗期至鼓粒期大豆植株（15份）和土壤樣品（15份）進(jìn)行了農(nóng)殘測(cè)定（表5）。在8份大豆植株樣品中檢測(cè)出脫乙基莠去津，殘留量在0.01～0.051mg/kg范圍內(nèi)，其余樣品中目標(biāo)化合物的殘留量均<0.01mg/kg。

3結(jié)論

本研究建立了一種分散固相萃取一超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)大豆植株及土壤中煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物殘留的方法。結(jié)果表明：在0.01～1.00mg/kg添加水平下，煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物的平均回收率為70%～113%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%～11.8%之間，目標(biāo)化合物濃度在0.001～1mg/kg范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的峰面積之間線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2≥0.9841，方法的定量限為0.01mg/kg。該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于大豆植株（幼苗期至鼓粒期）和土壤中煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物殘留的檢測(cè)，可為煙嘧磺隆和莠去津的科學(xué)使用及后茬作物的安全種植提供有效監(jiān)測(cè)方法。