一種用玉米擬輪枝鐮孢穗腐病病粒制備接種體的簡易方法

孫靜 謝淑娜 李保葉 錢蕾 茹艷艷 劉桂珍 郝俊杰

關(guān)鍵詞：玉米穗腐病；擬輪枝鐮孢；接種體

由擬輪枝鐮孢侵染引起的玉米穗腐病是玉米生產(chǎn)上普遍發(fā)生的一種真菌病害，該病害不但造成玉米的產(chǎn)量損失，還會產(chǎn)生多種真菌毒素，嚴重危害糧飼安全及人畜健康。玉米鐮孢穗腐病屬于氣傳病害，雖可通過種子、土壤傳播，但其病原菌主要是借助空氣傳播，通過花絲通道或蟲鳥等造成的創(chuàng)傷口侵染玉米籽粒。

玉米為高大密植作物，穗腐病發(fā)病籽粒通常被苞葉包裹，一般在玉米生長中后期才能被發(fā)現(xiàn)，故穗腐病具有隱蔽性和防治難的特點，目前尚無對該病害防治效果較好的化學藥劑或生物制劑，選育和推廣抗病品種依然是防控該病害最經(jīng)濟有效的措施。抗病品種的選育成效取決于抗源的挖掘、抗病種質(zhì)的創(chuàng)制等多個方面，這些均需進行抗病性的表型鑒定和評價，而抗性表型鑒定的一個重要環(huán)節(jié)就是病害的人工接種。

我國現(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標準推薦的玉米鐮孢穗腐病人工接種方法有2種，一種是花絲通道接種法，即經(jīng)玉米花絲通道注射鐮孢菌分生孢子懸浮液進行接種，另一種是籽粒傷口接種法，即用粗大金屬針刺穿玉米苞葉注入分生孢子懸浮液接種，或用帶菌牙簽穿透苞葉插入穗部接種，上述兩種方法的接種體為鐮孢菌分生孢子懸浮液或長有菌絲的牙簽，其培養(yǎng)制備均需超凈工作臺、培養(yǎng)箱等專業(yè)儀器設(shè)備以及經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員，且制備過程繁瑣，耗時較長。目前，育種工作者具有對自交系或雜交組合等進行穗腐病人工接種鑒定的需求，但大批量育種材料的鑒定需要制備大量接種體，占用大量時間及人力物力，加之我國部分玉米種業(yè)企業(yè)或育種團隊并不完全具備相應儀器設(shè)備和技術(shù)條件，接種體的制備往往限制了穗腐病人工接種鑒定，僅能依靠自然發(fā)病進行篩選鑒定。

針對玉米穗腐病優(yōu)勢病原菌——擬輪枝鐮孢，利用其在病穗上可產(chǎn)生大量分生孢子的特性，本團隊研發(fā)了一種制備擬輪枝鐮孢分生孢子懸浮液接種體（下文簡稱“接種體”）的簡易方法。為驗證該簡易方法制備的接種體接種效果能否達到常規(guī)制備接種體的水平，本研究將簡易制備的不同濃度接種體、-18℃不同凍存時長接種體分別與常規(guī)制備接種體進行田間穗腐病接種效果的比較，篩選簡易制備接種體的合適接種濃度，觀察凍存時長對簡易制備接種體接種效果的影響，并將簡易制備接種體試用于玉米品種的田間穗腐病抗性鑒定，以明確簡易制備接種體在田間穗腐病抗性鑒定工作中的實際應用價值。

1材料與方法

1.1接種體的制備

1.1.1病穗或病粒的收集保存

在玉米收獲季，從田間收集由擬輪枝鐮孢侵染引起穗腐病典型癥狀的病穗，挑選籽粒表面僅有白色至粉白色絨狀霉層、未見其他污染菌的病穗或病粒，晾干至籽粒含水量不高于14%，于室內(nèi)通風干燥處常溫貯存供第二年使用。

1.1.2接種體的簡易制備

從上述保存的病穗上剝下病粒，稱取10g，加入無菌水500～800mL（條件受限時可用市售純凈水、礦泉水或涼白開），戴無菌手套（條件受限時可用干凈的乳膠手套，或洗凈雙手裸手操作）反復搓洗玉米病粒約10～15min，將病粒表面著生的分生孢子洗脫，洗脫液用干凈的雙層紗布過濾除去雜質(zhì)，濾液加入無菌水至10L，獲得的分生孢子懸浮液中孢子含量約為1×105～5×105個/mL（此為多次試配所得的經(jīng)驗值，如條件允許建議檢測孢子含量），即為簡易制備接種體。

1.1.3常規(guī)方法制備接種體

供試菌株擬輪枝鐮孢單孢菌株MR1195，為2019年從田間采集的穗腐病病粒上分離純化所得，在PDA平板上26℃培養(yǎng)3～4d，挑取菌落邊緣的新鮮菌絲塊（約2～3mm見方）5～10塊，放入200mL CMC液體培養(yǎng)基中，180r/min、24℃振蕩培養(yǎng)3～4d，雙層無菌紗布過濾除去雜質(zhì)，獲得的分生孢子懸浮液于光學顯微鏡下用血球計數(shù)板測定濃度，再用適量無菌水將分生孢子懸浮液中的孢子含量調(diào)至1×106個/mL，即為常規(guī)制備接種體。

1.1.4不同濃度接種體的簡易制備

稱取一定重量的擬輪枝鐮孢病粒（表1），按1.1.2方法加水、洗脫、過濾后再加水至相應的體積（表1），制備成4種不同濃度的接種體，孢子含量分別為1×10s～5×105個/mL（TAI）、1×106～5×106個/mL（TA2）、1×107～5×107個/mL（TA3）和1×108～5×108個/mL（TA4）。以常規(guī)方法制備的接種體（1×106個/mL）（TCK）和無菌水（TO）分別作為對照，共設(shè)置6個處理比較篩選田間接種的合適濃度（表1）。

1.1.5不同凍存時長接種體的簡易制備

按1.1.2方法簡易制備接種體（孢子含量1×10s～5×105個/mL），分別在距離接種日期0d（接種當日現(xiàn)配現(xiàn)用，未凍存）及前7、15、30、50d設(shè)置不同凍存時長處理和對照（表2），比較凍存時長對接種效果的影響。凍存的接種體在使用前約16h取出，室溫自然化凍。

1.2田間試驗

1.2.1田間試驗設(shè)計

田間試驗于2020年至2022年在河南省新鄉(xiāng)市平原示范區(qū)河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地（116°24＇E，39°54＇N）進行。不同濃度接種體比較試驗（試驗A）于2020年進行，在玉米吐絲散粉期，使用簡易制備的不同濃度接種體接種玉米品種‘鄭單958’（中抗鐮孢穗腐?。┖汀T育173’（感鐮孢穗腐病），以常規(guī)制備接種體和無菌水接種作為對照，共6個處理（表1）。不同冷凍時長接種體比較試驗（試驗B）于2021年進行，供試品種及對照同試驗A，共7個處理（表2）。玉米品種的擬輪枝鐮孢穗腐病田間抗性鑒定試驗（試驗C）于2022年進行，供試品種為2022年從市場上或育種工作者處收集的33個玉米品種，抗病對照為自交系‘X178’，感病對照為自交系‘掖478’（表3）。

試驗A、B于試驗當年6月10日前后播種，試驗C于2022年6月17日播種。所有試驗均為行長6m，行距0.6m，每行留苗約25株，單行區(qū)，各處理或品種隨機排列，3次重復，常規(guī)田間管理。

1.2.2接種方法

玉米穗腐病的田間接種參考現(xiàn)行的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準，采用花絲通道注射法接種：在玉米吐絲散粉后3～5d，使用連續(xù)可調(diào)注射器，將接種體從雌穗頂端斜上方處沿花絲通道注入苞葉和穗軸之間，讓接種體沿花絲向內(nèi)滲流。每株玉米只在上部第一個雌穗定量注入2mL接種體。由于各品種生育期不一致，接種通常分批次進行。

1.2.3田間調(diào)查及抗性評價

接種后50d左右，在玉米收獲前調(diào)查。去除接種穗苞葉后，按照1、3、5、7、9級的分級標準逐穗調(diào)查，具體分級調(diào)查和抗性評價方法參考玉米鐮孢穗腐病抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范。計算每個接種處理單次重復中所有被調(diào)查穗的平均病情級別，并依據(jù)平均病級進行抗性評價。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在SAS9.2軟件中進行，方差分析使用ANOVA程序，多重比較采用最小顯著差異法（Least Significant Difference， LSD法）。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度接種體的接種效果比較

對2020年試驗A的調(diào)查結(jié)果表明，所有接種處理的穗腐平均病級（4.3～7.8）均顯著高于無菌水接種的空白對照TO（抗、感品種上分別為2.4、2.5）（P<0.05，圖1），說明自然發(fā)病不影響本年度穗腐病的接種鑒定，本批次接種有效。在中抗品種‘鄭單958’上，處理TA4（1×108～5×108個/mL）的平均病級為5.9，TA3（1×107～5×107個/mL）的平均病級為5.8，均顯著高于常規(guī)制備接種體接種對照TCK（1×106個/mL）的平均病級4.3（P<0. 05）；處理TA2（1×106～5×106個/mL）、TAI（1×105～5×105個/mL）的平均病級分別為5.3、5.1，與TCK的平均病級4.3之間差異不顯著（P>0.05）（圖1）。在感病品種‘碩育173’上，處理TA4的平均病級為7.8，顯著高于TCK的平均病級6.4（P<0. 05），處理TA3、TA2、TAI的平均病級分別為7.4、7.4、7．0，與TCK的平均病級6.4之間差異不顯著（P>0.05）（圖1）。4種不同濃度的簡易制備接種體接種后的平均病級在抗、感品種上雖表現(xiàn)出了隨接種體孢子液濃度升高而升高的趨勢，但同一品種上各濃度處理間的差異均不顯著（P>0.05，圖1）。

以上結(jié)果說明，簡易制備接種體在孢子液濃度為1×105～5×105個/mL時，接種后的效果即可達到常規(guī)制備接種體（1×106個/mL）的水平。

2.2不同凍存時長接種體的接種效果比較

對2021年試驗B的調(diào)查結(jié)果表明，抗、感品種上均為處理TBI（簡易制備接種體凍存Od后接種）的平均病級（6.0、8.1）最高，處理TB5（簡易制備接種體凍存50d后接種）的平均病級（4.1、4.2）最低，整體表現(xiàn)出接種體凍存時間越久、接種后的平均病級就越低的趨勢（圖2）。在中抗品種‘鄭單958’上，處理TB1、TB2、TB3（簡易制備接種體凍存0、7、15d后接種）的平均病級分別為6.0、5.5、4.5，處理間差異均不顯著（P>0.05），與對照TCK（常規(guī)制備接種體現(xiàn)配現(xiàn)用接種）的平均病級4.5之間差異也不顯著（P>0.05）；處理TB4、TB5（簡易制備接種體凍存30、50 d后接種）的平均病級分別為4.3、4.1，顯著低于處理TB1的平均病級6．0（P<0.05），與對照TCK（4.5）之間差異不顯著（P>0.05），但顯著高于無菌水接種的空白對照T0 （2.3）（P<0.05）（圖2）。在感病品種‘碩育173’上，處理TB1、TB2的平均病級分別為8.1、7.3，處理間差異不顯著（P>0.05）；處理TB2、TB3的平均病級7.3、6.5，均與對照TCK的平均病級6.5之間差異不顯著（P>0.05），但三者均顯著高于處理TB4（5.2）和TB5（4.2）（P<0.05）；處理TB4（5.2）與TB5 （4.2）之間差異不顯著（P>0.05），二者均顯著高于空白對照T0（2.3）（P<0.05）（圖2）。

以上結(jié)果說明，簡易制備接種體在-18℃凍存后再用于接種，接種后的平均病級會隨凍存時間的延長而下降，但凍存時長在7d時的接種效果仍與簡易制備接種體現(xiàn)配現(xiàn)用相當；凍存時長在15d時，接種效果與常規(guī)制備接種體現(xiàn)配現(xiàn)用相當。簡易制備接種體凍存時長超過30d時，接種后的平均病級在感病品種上顯著降低。

2.3田間應用

對2022年試驗C的調(diào)查結(jié)果表明，對照品種‘XI178’的平均病級為2.3，鑒定結(jié)果為抗?。≧），‘掖478’的平均病級為7.6，鑒定結(jié)果為高感（HS），表明本批次抗性鑒定結(jié)果有效。參試的已知抗性品種中，‘鄭單958’的平均病級為4.9，‘碩育173’的平均病級為6.7，分別鑒定為中抗（MR）和感病（S），均符合品種自身抗性水平。33個受試玉米品種中，對擬輪枝鐮孢穗腐病表現(xiàn)為高感（HS）的有1個，占全部品種的3.0%；表現(xiàn)為感?。⊿）的有20個，占60.6%；表現(xiàn)為中抗（MR）的有11個，占33.3%；表現(xiàn)為抗?。≧）的有1個，占3.0%；沒有表現(xiàn)為高抗（HR）的品種（表3）?？剐澡b定結(jié)果表明，33個受試品種中對擬輪枝鐮孢穗腐病表現(xiàn)為中抗及以上的品種較少（12個，36.4%>，多數(shù)品種表現(xiàn)為感病或高感（21個，63.6%）。

3結(jié)論與討論

近年來，玉米穗腐病抗病品種的選育備受重視，國家農(nóng)作物品種審定委員會在國家級玉米品種審定標準（2021年修訂）中，也將玉米穗腐病新增為一票否決病害：高感即淘汰。這就要求育種工作者在選育玉米品種時更加注意品種對穗腐病的抗性表現(xiàn)，而通過人工接種來鑒定玉米種質(zhì)材料對穗腐病的抗性是培育抗病品種中不可或缺的重要環(huán)節(jié)。玉米穗腐病的人工接種通常采用花絲通道接種法和籽粒傷口接種法，這2種方法都可以使用病原菌分生孢子懸浮液作為接種體。本文介紹了1種制備擬輪枝鐮孢分生孢子懸浮液接種體的簡易方法，該方法不受儀器設(shè)備及操作技術(shù)限制，簡單易操作、成本低、效率高。

將接種體的常規(guī)制備法與簡易制備法進行了比較（表4），常規(guī)制備法在制備過程中需要超凈工作臺、培養(yǎng)箱、恒溫搖床、顯微鏡等多種儀器設(shè)備及精細的無菌操作，經(jīng)菌株培養(yǎng)、搖培擴繁、過濾、鏡檢、調(diào)濃度等一系列流程，通常6～8d才能完成一批接種體的制備，步驟多、時間長，期間若操作不當易導致接種體污染，且一次制備體積受搖床容量限制。簡易制備法則只需稱取一定量的病粒，經(jīng)兌水洗脫、過濾加水即完成接種體制備，步驟少、操作容易、效率高，10g病粒一次即可制備出10L接種體（表1），能夠在短時間內(nèi)簡單、快速、大量制備擬輪枝鐮孢穗腐病接種體，滿足大批量材料抗性鑒定的需求，方便實用，具有較好的經(jīng)濟效益和推廣價值。

應用本研究簡易制備法的重要前提是收集到較純的擬輪枝鐮孢病粒作為制備原料，避免使用帶有雜菌的病粒。玉米穗腐病的病原種類繁多，被擬輪枝鐮孢侵染的玉米籽粒表面多出現(xiàn)白色至粉白色的絨狀霉層，區(qū)別于禾谷鐮孢、木霉、曲霉、青霉等其他病原菌侵染形成以紫紅色、綠色、黃綠色、灰褐色、炭黑色、灰綠色等為主的霉層。田間環(huán)境復雜，有些自然發(fā)病的擬輪枝鐮孢病穗也會被其他真菌侵染，若將其作為制備原料可能會造成接種后的病穗被雜菌污染。為了更方便地獲取本方法所需的原料病粒，基于我們的實踐經(jīng)驗，一是推薦使用常規(guī)制備接種體人工接種擬輪枝鐮孢所得的典型病穗，二是推薦從感病品種如‘豫單606’‘碩育173’上收集擬輪枝鐮孢病穗，這些品種通常自然發(fā)病較重，雜菌污染較少；從上述兩類病穗中挑選使用被擬輪枝鐮孢白色或粉白色霉層覆蓋且未見其他雜菌的病粒，即使病粒上仍帶有少量難以發(fā)現(xiàn)的雜菌，制備出的接種體接種后發(fā)病也會以擬輪枝鐮孢穗腐為主，少量雜菌污染不影響穗腐病鑒定結(jié)果（圖3）。

在擬輪枝鐮孢穗腐病田間接種研究中，通常使用的接種體孢子液濃度多為1×106～5×106個／mL。本研究中使用簡易制備法制備的接種體在孢子液濃度為1×10s～5×105個/mL時，接種效果即可達到常規(guī)制備接種體（1×106個/mL）接種后的水平（圖3），且繼續(xù)提高簡易制備接種體的濃度并不能使平均病級顯著提高（圖1），故推薦在使用簡易制備法制備接種體時，采用孢子液濃度1×105～5×105個/mL即可。

玉米鐮孢穗腐病的人工接種時期一般為玉米吐絲授粉后7d內(nèi)，但不同玉米材料的生育期并不完全一致，故接種常需分批次進行。采用簡易制備法一次制備大量接種體能夠保證分批次接種中孢子液濃度的一致性，暫時不用的接種體則可冷凍保存?zhèn)溆?。低溫冷凍通過降低細胞的代謝活性來保持真菌的穩(wěn)定，可以較好地保持病原真菌的活力和致病性，但-18℃下凍存時間的長短對擬輪枝鐮孢分生孢子活性、致病力等有何影響尚未見報道。本研究比較了簡易制備接種體在家用冰箱可達到的-18℃下凍存不同時長后的接種效果，結(jié)果表明接種體凍存15d時接種效果仍可達到常規(guī)制備接種體現(xiàn)用現(xiàn)配的水平，而凍存30d以上的接種體接種后在感病品種上的平均病級顯著降低（圖2），可能導致難以用接種結(jié)果區(qū)分抗、感品種，故不推薦使用凍存30d以上的簡易制備接種體進行接種鑒定。

2022年在使用簡易制備接種體接種鑒定33個玉米品種對擬輪枝鐮孢穗腐病抗性的田間試驗中，抗病對照自交系‘X178’、感病對照自交系‘掖478’和已知抗性的品種如‘鄭單958’‘碩育173’等的抗性表現(xiàn)均較穩(wěn)定且符合預期，鑒定結(jié)果可信，說明用簡易制備法制備的接種體在田間接種中表現(xiàn)良好，可用于玉米品種或育種材料的抗性鑒定及篩選。在本研究測試的參試品種中，表現(xiàn)為中抗以上的品種僅占36.4%，可見目前常用的多數(shù)品種仍缺乏對鐮孢穗腐病的抗性，加強玉米抗性種質(zhì)資源的收集和鑒定、篩選高抗材料對于穗腐病抗性育種及玉米穗腐病的防控、增產(chǎn)提質(zhì)非常重要。本文提出的接種體簡易制備法通過降低技術(shù)及設(shè)備限制、簡化制備流程拓寬了接種體制備技術(shù)的應用范疇，可以讓育種工作者和育種企業(yè)更加簡便快捷地完成大批量穗腐病抗性種質(zhì)資源的人工接種鑒定和篩選。簡易制備法的不足在于制備原料所用病粒中的擬輪枝鐮孢通常難以達到實驗室純培養(yǎng)菌株的純度，接種后常會存在少量雜菌污染的現(xiàn)象（圖3a），在對少量材料進行穗腐病抗性精準鑒定時，建議仍選用常規(guī)制備法制備高純度接種體。根據(jù)需鑒定材料數(shù)量及鑒定目的合理選用兩種接種體制備方法，將會使穗腐病的人工接種鑒定更加高效而準確。