超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物在辣椒上的殘留

李詩 程有普 潘興魯 董豐收 吳小虎 徐軍 鄭永權(quán)

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥殘留；溴蟲氟苯雙酰胺；辣椒；代謝物；消解動態(tài)

辣椒原產(chǎn)于中南美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，具有種植范圍廣、消費量大、加工方式多、消費功能多、種植風(fēng)險小的特點。據(jù)統(tǒng)計，近年來我國辣椒種植面積穩(wěn)定在3億hm2以上。2015年辣椒的種植面積超過大白菜、番茄、普通白菜，位居全國蔬菜種植面積的第一位；2021年我國辣椒的種植面積突破3.4億hm2，占全球辣椒種植面積的40%。薊馬、粉虱、蚜蟲、螨類是辣椒生產(chǎn)上的主要害蟲，嚴(yán)重影響了辣椒的品質(zhì)和產(chǎn)量，導(dǎo)致種植戶的經(jīng)濟收入降低。溴蟲氟苯雙酰胺（broflanilide）是由巴斯夫和三井化學(xué)聯(lián)合開發(fā)的一類高效、廣譜、作用機制新穎的新型雙酰胺類殺蟲劑，在昆蟲中能夠產(chǎn)生兩種結(jié)構(gòu)相似的代謝物，即DM-8007和S（PFP-OH）-8007（圖1）。溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物的結(jié)構(gòu)相似，都具有較高的lgP（某物質(zhì)在正辛醇和水中的分配系數(shù)比值的對數(shù)值），因此容易在植物或動物的脂質(zhì)中累積，其中DM-8007的殺蟲活性高于母體。Casida等的研究表明，溴蟲氟苯雙酰胺是一種GABA門控氯離子通道變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，其通過作用于氯離子通道的一個獨特位點，抑制氯離子向細(xì)胞內(nèi)傳遞，導(dǎo)致昆蟲痙攣，從而表現(xiàn)出快速殺蟲活性。溴蟲氟苯雙酰胺對薊馬、粉虱、蚜蟲和螨類都具有良好的殺蟲活性，對于防治辣椒蟲害具有很大的潛能。

目前，關(guān)于溴蟲氟苯雙酰胺的研究主要集中在殺蟲活性和作用機理方面。溴蟲氟苯雙酰胺對斑馬魚Danio rerzo的急性毒性較低，但可能誘發(fā)慢性毒性；其對斑馬魚的胚胎和心臟發(fā)育、大腦、神經(jīng)遞質(zhì)、相關(guān)的魚類行為都有影響。關(guān)于溴蟲氟苯雙酰胺及其代謝物在農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留檢測的報道較少，An等首次報道了溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物在5種土壤中的殘留檢測方法；Xie等報道了溴蟲氟苯雙酰胺在水稻及其相關(guān)環(huán)境中的殘留分析及消解動態(tài)；賀敏等報道了溴蟲氟苯雙酰胺在番茄和甘藍(lán)中的殘留檢測方法。但溴蟲氟苯雙酰胺及其代謝物在辣椒上的殘留檢測方法及消解動態(tài)的研究尚屬空白，制約了溴蟲氟苯雙酰胺在辣椒種植體系的科學(xué)應(yīng)用和相關(guān)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的制定。

本研究運用改良的QuEChERS法結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，建立了一種快速、簡便、靈敏、高效、安全的方法，用于辣椒中溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物殘留的定量和定性分析，同時利用該方法研究了5%溴蟲氟苯雙酰胺懸浮劑在湖南、河南、浙江3個地點辣椒中的殘留消解動態(tài)。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（Exion-LC UHPLC， SCIEX TRIPLE QUAD 4500），美國AB SCIEX公司；KQ500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；F2102微型組織粉碎機，天津泰斯特公司；CK-1000組織振蕩混合儀，北京托摩根生物有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；XW-80A型漩渦混合器，美國Scientific Industries公司；Filter Unit型0.22um有機濾膜，Agela Technologies公司。

溴蟲氟苯雙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（99.67%）、S（PFP-OH）-8007標(biāo)準(zhǔn)品（99.02%）、DM-8007 （99.86%）標(biāo)準(zhǔn)品，北京勤誠亦信科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純），北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA，40um）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40um）和石墨化炭黑（GCB，40um），天津博納艾杰爾科技有限公司；AgilentZORBAX EclipsePlus C18色譜柱（50mm×2.1mm．1.7um），天津博納艾杰爾科技有限公司；乙腈、無水MgS04、NaCI（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2田間試驗設(shè)計

本研究在湖南、河南、浙江3個地點開展5%溴蟲氟苯雙酰胺懸浮劑在辣椒上的殘留消解試驗，設(shè)置對照小區(qū)和處理小區(qū)，每個小區(qū)面積50m2。采用兌水噴霧的方式進(jìn)行施藥，5%溴蟲氟苯雙酰胺懸浮劑制劑用量為30mL/667m2（有效成分用量22.5g/hm2），用水量為50L/667m2，施藥2次，施藥間隔7d，對照小區(qū)施等量清水。于最后1次施藥后的2h、1、3、5、7d采集辣椒樣品。將采集的辣椒樣本去除其果梗及萼片后切成1cm左右小塊混勻，袋裝保存，每份200g，儲存于-18℃冷庫。

1.3樣品提取與凈化

稱取10.0g（精確到0.01g）均質(zhì)辣椒樣品于含50mL聚四氟乙烯的離心管中，加入10mL乙腈，振蕩提取10min，再加入1gNaCI和4g無水MgS04，振蕩5min，4000r/min離心5min，然后將1.5mL上清液轉(zhuǎn)移至裝有150mg無水MgS04、50mg PSA和10mg GCB的2mL離心管中，2500r/min渦旋3min，8000r/min離心5min，上清液過0.22um有機濾膜，儲存于-20℃。

1.4超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1液相色譜條件

色譜條件：Agilent ZORBAX EclipsePlus C18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7gm）。柱溫為40℃，進(jìn)樣體積為3uL，流動相A為0.2%（V/V）甲酸水，流動相B為甲醇，流速為0.3mL/min。梯度洗脫程序見表1所示。

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）正離子掃描模式；碰撞氣：氮氣；氣簾氣（curtain gas，CUR）：10psi;噴撞氣（collision gas，CAD）：9psi；離子化電壓：5000V;離子源溫度：500℃；噴霧氣（nebulizer gas，GSI）：60psi；輔助加熱氣（heating gas，GS2）：60psi；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MMR），碰撞室入口電壓（entrance potential，EP）：10V；碰撞室出口電壓（collision cell exit potential，CXP）：6V，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、基質(zhì)效應(yīng)評價及添加回收試驗

準(zhǔn)確稱取一定量的溴蟲氟苯雙酰胺（純度99. 67%），DM-8007（純度99.02%）和S（PFP-OH）-8007（純度99.86%）標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙腈溶劑配制成10mL1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃保存。而后將3種標(biāo)準(zhǔn)儲備液等比例混合后用乙腈或空白基質(zhì)提取液連續(xù)梯度稀釋，配制成0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4節(jié)中的檢測條件進(jìn)行測定，繪制一個橫坐標(biāo)為溴蟲氟苯雙酰胺及其代謝物的質(zhì)量濃度（mg/L），縱坐標(biāo)為定量離子對的峰面積的工作曲線。

本試驗采用辣椒空白基質(zhì)中添加待測物的方法評價基質(zhì)效應(yīng)（matrix effects，Me），通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值進(jìn)行判斷。當(dāng)-20%+50%時，基質(zhì)效應(yīng)高，對定量影響干擾較大。

在本研究中，以溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物在辣椒樣品中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評價該方法的準(zhǔn)確度和精密度，以符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最小添加濃度為定量限（LOQ）。由于溴蟲氟苯雙酰胺、DM-8007和S（PFP-OH）-8007尚未制定相關(guān)最大殘留量（MRL），因此設(shè)置辣椒中溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物3個添加水平分別為0. 01mg/kg（LOQ）、0.10mg/kg （10×LOQ）、0.50mg/kg（50×LOQ），按照1.3節(jié)中的方法提取、凈化，按照1.4節(jié)中的儀器條件檢測，根據(jù)進(jìn)樣結(jié)果計算添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。根據(jù)農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則要求，當(dāng)添加水平為0.01～0.1mg/kg時，回收率需為70%～120%，RSD需小于或等于20%;當(dāng)添加水平為0.1～1mg/kg時，回收率需為70%～110%，RSD需小于或等于10%。

2結(jié)果與分析

2.1樣品提取劑與凈化劑的選擇和優(yōu)化

本研究對比了乙腈與1%甲酸乙腈作為提取劑時的回收率，同時考慮到辣椒中辣椒素、辣椒紅素以及色素的含量較高，對50mg PSA、50mg C18、50mgPSA+10mg GCB、50mg C18+10mg GCB、50mgPSA+50mg C18、50mg PSA+50mg C18+10mgGCB（以上均加入150mg無水MgS04）6種凈化劑的凈化效果進(jìn)行了對比。結(jié)果（圖2）顯示，以乙腈或1%甲酸乙腈作為提取劑時溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物的回收率均在70%～120%，滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》（NY/T788-2018）。同時，由于大量、連續(xù)地使用有機酸可能會腐蝕儀器、造成損害，因此在保證回收率的前提下，從儀器保護(hù)的角度選擇乙腈作為溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物的提取劑；在使用乙腈作為提取劑，50mg PSA+10mg GCB作為凈化劑時，溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物的回收率及色素去除效果最佳。這主要是由于PSA具有極性和弱陰離子交換功能，可以有效去除一些有機酚類、脂肪酸等極性或弱酸性物質(zhì)，而GCB主要吸附色素和一些具有平面環(huán)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。因此最終選擇150mg無水MgS04+50mg PSA+10mgGCB作為凈化劑對提取液進(jìn)行凈化。

2.2方法驗證

2.2.1線性關(guān)系

用乙腈和辣椒空白基質(zhì)提取液配制溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4節(jié)中的檢測條件，對0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測分析，根據(jù)溴蟲氟苯雙酰胺及其代謝物的質(zhì)量濃度（mg/L）和定量離子對的峰面積擬合線性方程。如表3所示，在0.01～1mg/L范圍內(nèi)，溴蟲氟苯雙酰胺、DM-8007和S（PFP-OH）-8007在乙腈和辣椒空白基質(zhì)溶液中質(zhì)量濃度與相應(yīng)定量離子對的峰面積間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9947。

2.2.2基質(zhì)效應(yīng)

如表3所示，溴蟲氟苯雙酰胺、DM-8007和S（PFP-OH）-8007在辣椒中的基質(zhì)效應(yīng)分別為12.3%、16.4%和53.7%，說明S（PFP-OH）-8007在辣椒中存在較強的基質(zhì)效應(yīng)，不能忽略。因此，為了彌補基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的影響，本研究采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對實際樣品進(jìn)行定量分析，以提高方法的準(zhǔn)確性和通用性。

2.2.3方法的準(zhǔn)確性、精密度和靈敏度

本研究在空白辣椒樣品提取液中添加0.01、0.1、0.5mg/kg 3個不同水平的3種混合目標(biāo)化合物，每個加標(biāo)水平設(shè)置5個重復(fù)。結(jié)果（表4）表明，溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物在3個加標(biāo)水平下的回收率范圍為90.8%～97.4%，RSD為1.3%～5.7%，LOQ均為0.01mg/kg，均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.3實際樣品測定

用建立的方法對采集的辣椒樣品進(jìn)行了檢測，溴蟲氟苯雙酰胺在辣椒樣品中的殘留消解動態(tài)符合一級動力學(xué)方程，溴蟲氟苯雙酰胺在湖南、河南和浙江的消解曲線（圖3）分別為y=0.042 3e-0.097（R2=0.9124）、y=0.128 le-0.146（R2=0.9085）和y=0.266 le-0.248（R2=0.9772），消解半衰期分別為7.7、4.7d和2.8d：DM-8007和S（PFP-OH）-8007在湖南、河南和浙江3個采樣地點中均未檢出。溴蟲氟苯雙酰胺及其代謝物色譜圖見圖4。

3結(jié)論與討論

本研究建立并優(yōu)化了基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）同時測定辣椒中溴蟲氟苯雙酰胺及其代謝物DM-8007、和S（PFP-OH）-8007的殘留分析方法，并對湖南、河南、浙江3個地點施用5%溴蟲氟苯雙酰胺懸浮劑后的辣椒樣品進(jìn)行殘留檢測。樣品經(jīng)過乙腈提取，以150mg MgS04、50mg PSA及10mg GCB凈化；結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確性、精密度和靈敏度均滿足殘留分析方法的要求；檢測了5%溴蟲氟苯雙酰胺懸浮劑在湖南、河南、浙江3個地點的消解動態(tài)，溴蟲氟苯雙酰胺在辣椒樣品中消解動態(tài)規(guī)律符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，在3個地點的半衰期分別為7.7、4.7d和2.8d；本研究為溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物在辣椒樣品中的殘留分析提供了一種快速、準(zhǔn)確的方法，為溴蟲氟苯雙酰胺及其兩種代謝物在其他樣品中的殘留分析提供了參考。