解淀粉芽胞桿菌YB14對黃瓜棒孢葉斑病的生防效果及發(fā)酵條件優(yōu)化

王書翰 謝學文 李磊 孫炳學 朱廣雪 柴阿麗 范騰飛 李寶聚 石延霞

關鍵詞：解淀粉芽胞桿菌；黃瓜棒孢葉斑病；生防作用

黃瓜棒孢葉斑病是由山扁豆生棒孢Corynespo-ra cassiicola侵染引起的真菌病害，病原菌寄主范圍廣泛，可危害葫蘆科Cucurbitaceae、茄科Solanaceae、豆科Leguminosae蔬菜。在黃瓜田一般引起的發(fā)病率為10%-25%，嚴重時可達60%～70%，甚至100%。目前化學防治依然是防治該病害的主要手段，常用的殺菌劑包括啶酰菌胺（boscalid）、嘧菌酯（azoxystrobin）、百菌清（chlorothalonil），吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）等。然而近幾年發(fā)現(xiàn)C．cassiicola對這些殺菌劑的抗性越來越嚴重，僅山東地區(qū)截止到2017年對啶酰菌胺的抗藥性頻率就高達60%。制定合理的防治方案對于有效防控棒孢葉斑病至關重要。生物防治因其安全有效、對環(huán)境友好且不產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點，在防治蔬菜病害方面越來越受到重視。目前主要用到的生防菌有芽胞桿菌屬Bacillus，假單孢桿菌屬Pseudo-monas及木霉屬Trichoderma真菌。許多生防菌除了對病害具有防治作用外，還具有～定的促生長效果。王瑞霞等從馬鈴薯塊莖中分離到1株對馬鈴薯環(huán)腐病菌Claoibacter rn.ichiganense sub-sp．sepedonzcurn具有拮抗作用的巨大芽胞桿菌BacilLus rnegaterzurn，經(jīng)溫室試驗表明，該菌株可以顯著提高馬鈴薯植株的莖長，莖粗及種薯產(chǎn)量。Esitken等發(fā)現(xiàn)施用芽胞桿菌osu-142可以顯著提高櫻桃葉片N、P、K含量，對櫻桃有很好的促生效果。

在諸多生防菌中，解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens是一種重要的生防細菌，對草莓炭疽病菌Colletotrichurn gloeosporioides、大豆疫霉Phytophthora sojae、番茄葉霉病菌Clados-porium fulourn、黃瓜白粉病菌Podosphaera fu-liginea等引起的植物病害均具有一定的防治效果，部分菌株還具有促生作用。本研究團隊前期篩選到的解淀粉芽胞桿菌YB114在盆栽及田間試驗中均表現(xiàn)出對黃瓜棒孢葉斑病良好的防治效果。為了加快YB114的商業(yè)化進程，本文對該菌株不同發(fā)酵組分進行了防治效果的評價，并以防治效果為指標優(yōu)化了發(fā)酵條件，同時對該菌的促生作用進行了研究，期望對YB114的應用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

致病菌為山扁豆生棒孢（菌株編號SDI），保存于中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所；生防菌株為解淀粉芽胞桿菌（菌株編號YB114），保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為：24581。

黃瓜品種為‘中農(nóng)6號’，市售。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L。固體培養(yǎng)基需添加瓊脂20g/L。種子液培養(yǎng)基：山梨醇10g/L、棉籽餅粉17g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L、磷酸氫二鈉0.4g/L，pH7.0。基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇10g/L、棉籽餅粉17g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L、磷酸氫二鈉0.4g/L，pH7.0。

對照殺菌劑：75%百菌清可濕性粉劑，允發(fā)化工（上海）有限公司；41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑，拜耳股份公司。

植物赤霉素（貨號：F5680-A）、生長素（貨號：F6269-A）、玉米素核苷試劑盒（貨號：F4571-B），均購自北京華博德億生物技術有限公司。

1.2YB114發(fā)酵液組分對黃瓜棒孢葉斑病的防效評價

1.2.1YB114發(fā)酵液制備

將保存在-80℃凍存管中的解淀粉芽胞桿菌YB114菌株用接種環(huán)以劃線的方式接入LB平板，在28℃培養(yǎng)箱中避光活化48h，挑取活化的菌株單菌落接人種子液培養(yǎng)基中，28℃，180r/min，振蕩培養(yǎng)20h，按2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24h，之后將發(fā)酵液用無菌水稀釋100倍和300倍，備用。

1.2.2發(fā)酵上清液的制備

用移液槍吸取1mL發(fā)酵液于1.5mL離心管中，4℃，12000r/min離心20min，上清液用0.22um的無菌過濾器過濾，進一步去除菌體后4℃冰箱保存，使用前用無菌水稀釋100倍和300倍。

1.2.3YB114菌懸浮液的制備

用移液槍吸取1mL發(fā)酵液于1.5mL離心管中，4℃，12000r/min離心20min，棄上清，加入等量的無菌水，振蕩30s，得到菌懸液，將菌懸液用無菌水稀釋100倍和300倍，備用。

1.2.4黃瓜棒孢葉斑病菌孢子懸浮液的制備

取4℃保存的山扁豆生棒孢SD1菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5d，在菌落邊緣打取5mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)15d，使用含有0.1%吐溫-20的蒸餾水沖洗平板上的孢子，雙層紗布過濾后配制成濃度為105個/mL的孢子懸浮液。

1.2.5YB114不同發(fā)酵組分對黃瓜棒孢葉斑病的防效評價

2021年4月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所日光溫室進行盆栽防治效果試驗，將黃瓜種子播于育苗穴盤中，待黃瓜長出兩葉一心后進行試驗，YB114預防效果評價方法：將稀釋100倍及300倍的發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液分別噴施于黃瓜葉片上，以噴施0.125mL/L 41. 7%氟吡菌酰胺懸浮劑和清水為對照，均勻噴霧，12h后取1.2.4制備的濃度為105個/mL的黃瓜棒孢葉斑病菌孢子懸浮液進行噴霧接種。評估治療效果則先噴施濃度為105個/mL的黃瓜棒孢葉斑病孢子懸浮液，12h后分別噴施稀釋100倍及300倍的發(fā)酵液、發(fā)酵上清液及菌懸液，以0.125mL/L 41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑和清水為對照。每處理3次重復，每重復20株黃瓜苗。接種后將黃瓜苗放入日光溫室自然環(huán)境中保濕培養(yǎng)。

接種后7～10d，待清水對照充分發(fā)病后調查各處理病情指數(shù)，計算防效。分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個葉面積的5%以下；3級，病斑面積占整個葉面積的5%-25%;5級，病斑面積占整個葉面積的26%～50%;7級，病斑面積占整個葉面積的51%-75%;9級，病斑面積占整個葉面積的75%以上。根據(jù)公式計算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=[∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）／（調查總葉數(shù)×9）]×100；

防治效果=（對照病情指數(shù)一處理病情指數(shù)）／對照病情指數(shù)×100%。

1.3YB114發(fā)酵液對黃瓜的促生長作用評價

1.3.1YB114發(fā)酵培養(yǎng)

從LB平板上挑取YB114單菌落至基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，180r/min振蕩培養(yǎng)36h。

1.3.2YB114對黃瓜植株生物量及形態(tài)學指標的影響

試驗于2021年5月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所溫室中進行，將黃瓜種子播種于50孔穴盤中，待黃瓜長出兩葉一心后選取長勢一致的黃瓜幼苗移栽至直徑16cm育苗缽中，將其分為兩組，每組10個重復。分別噴施YB114發(fā)酵液及清水，15d后對黃瓜長勢進行調查，測定株高、根長、地下根重，地上鮮重，葉片重量，螺旋測微器測量黃瓜同一生長位置的葉片厚度，掃描儀（Laserjet Pro MFPM126nw，HP公司）掃描同一位置的黃瓜葉片，然后利用PS軟件計算葉片面積：葉面積=（葉片像素／照片像素）×照片面積。

1.3.3YB114對開花期黃瓜光合速率和葉綠素含量的影響

利用LI-6400便捷式光合儀（美國LI-COR公司）測定黃瓜葉片的光合速率和水分蒸騰速率。處理后15d選擇植株的第3片真葉進行測量。測量時間為上午10：30-12：00。葉片插入儀器中先穩(wěn)定5s再進行測量。每處理選取10盆黃瓜同一位置的葉片，每片葉重復測量10次后取平均值。儀器工作條件：C02的流速為500umol/s，光照強度為1000umol/（m2．s）。計算瞬時水分利用效率（instantaneous water-useefficiency，WUEin），WUE=A/E，其中A為光合速率，E為水分蒸騰速率。

葉綠素含量與光合指標的測定在上午同一時間進行。利用SPAD-502手持葉綠素測定儀（柯尼卡美能達，中國）測定葉片中葉綠素相對含量。每盆植株選取相同部位葉片進行測定，測定時每片葉片選取5個部位，測定后計算得出葉片5個不同部位的平均值，得到葉片葉綠素相對含量。

1.3.4YB114對黃瓜內源激素水平的影響

采用北京華博德億生物技術有限公司植物激素試劑盒分別測定黃瓜內源性植物激素赤霉素（GA3），生長素（IAA）及玉米素核苷（ZR）含量。具體步驟參照試劑盒使用說明書。

1.4YB114發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1培養(yǎng)基組分單因素優(yōu)化

采用單因子變量法，以10g/L的乳糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、糖蜜、玉米粉和糊精代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的山梨醇進行最佳碳源的篩選；以17g/L的氯化銨、花生餅粉、酵母浸粉、蛋白胨代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的棉籽餅粉進行最佳氮源的篩選；以1g/l．的氯化鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉進行最佳無機鹽的篩選。為使優(yōu)化后抑菌物質濃度達到最高，以便于后續(xù)抑菌物質的分離提取，碳源、氮源及無機鹽最佳種類的確定均以發(fā)酵上清液稀釋100倍對黃瓜棒孢葉斑病的防治效果為依據(jù)，所有指標的篩選均在前一步篩選的最佳條件基礎上進行，所有的效果評價均為治療效果。

1.4.2發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

在確立最佳培養(yǎng)基組分的基礎上，仍以稀釋100倍的YB114發(fā)酵上清液對黃瓜棒孢葉斑病防治效果為優(yōu)化指標進行發(fā)酵條件的優(yōu)化。采用單因子變量，在規(guī)格為250 mL的三角瓶中分別加入20、40、60、80、100、120 mL發(fā)酵液，進行最佳裝液量的篩選，以1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量進行最佳接種量的篩選，以pH 5．0、6.0、7．0、8．0、9.0進行最佳pH值的篩選，以溫度24、28、32、36℃進行最佳發(fā)酵溫度的篩選，以轉速140、160、180、200r/min進行最佳搖瓶轉速的篩選，以發(fā)酵時間20、24、28、32、36h進行最佳發(fā)酵時間的篩選，所有指標的篩選均在前一項篩選的基礎上進行。

1.5數(shù)據(jù)分析與處理

用SPSS 20．0對測得的所有指標進行方差分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD法）進行多重比較，顯著水平為a=0.05。

2結果與分析

2.1 YB114不同發(fā)酵組分對黃瓜棒孢葉斑病的防治效果

YB114發(fā)酵液、發(fā)酵上清液及菌懸液對黃瓜棒孢葉斑病均具有較好的治療和預防效果，其中發(fā)酵液100倍稀釋液的治療及預防效果可達85.72%和42.29%，發(fā)酵上清液100倍稀釋液的治療及預防效果可達74.14%和33.25%。各組分治療效果基本上是預防效果的2倍。不同組分中發(fā)酵液防效最好，其次為上清液，最后為菌懸液。各組分100倍稀釋液防治效果均好于300倍稀釋液（表1）。

2.2YB114發(fā)酵液對黃瓜的促生作用

2.2.1YB114對黃瓜形態(tài)學指標的影響

噴施YB114發(fā)酵液后，除黃瓜葉片厚度，葉片重量及黃瓜地下重相較于對照沒有顯著差異外，黃瓜的莖長、地上部鮮重、葉片面積、根長較對照處理均顯著增加（P<0.05）。經(jīng)YB114發(fā)酵液噴施后，黃瓜莖長增加了29.53%，地上部鮮重增加了31.99%，葉片面積增加了19.25%，根長增加了28.99%（表2）。

2.2.2YB114對黃瓜幼苗光合作用的影響

噴施YB114發(fā)酵液后黃瓜的光合速率（A），水分蒸騰速率（E）和瞬時水分利用效率（WUE）較對照均有一定程度的增加，但無顯著差異（表3，P>0.05）。而黃瓜葉片葉綠素相對含量較對照顯著增加16.76%（表3，P<0.001）。

2.2.3YB114對黃瓜幼苗內源激素的影響

噴施YB114發(fā)酵液處理后黃瓜葉片中內源激素水平發(fā)生了不同程度的變化，玉米素核苷和生長素含量分別較對照顯著增加41.15%和29.93%（P<0.001.），但赤霉素含量較對照顯著降低了30.34%（P<0.001）（表4）。

2.3YB114培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

在8類碳源中，以果糖作為碳源時上清液對黃瓜棒孢葉斑病防治效果最高，防效可達68.14%，山梨醇和糊精的效果次之，乳糖作為碳源時防效最差，因此選用果糖作為發(fā)酵最佳碳源（圖1a）。在5類氮源中，以花生餅粉作為氮源時防效最佳，達68.28%，氯化銨的防效次之，以酵母浸粉為氮源時上清液防效最差，所以選用花生餅粉為最佳氮源（圖1b）。在7類不同的無機鹽中，以磷酸二氫鉀作為無機鹽時對黃瓜棒孢葉斑病的防治效果最高，達62.09%．磷酸氫二鉀效果次之，硫酸鈣防治效果最差，因此選用磷酸二氫鉀作為發(fā)酵最佳無機鹽（圖1c）。

2.4YB114發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1裝液量的篩選

YB114發(fā)酵時的溶氧量由轉速及裝液量共同決定，當搖瓶裝液量為40mL培養(yǎng)液（250mL三角瓶）時，發(fā)酵上清液防治黃瓜棒孢葉斑病的效果最好，達82.56%，低于或高于此裝液量時都不能達到最佳防效（圖2a）。

2.4.2YB114接種量的篩選

當接種量為6%時，防效最高，達76.54%;低于此接種量均不能達到最高防效，原因可能是高菌量使相同時間內發(fā)酵液中所產(chǎn)抑菌物質增多，從而更好地抑制黃瓜棒孢葉斑病的發(fā)生（圖2b）。

2.4.3發(fā)酵培養(yǎng)液初始pH值的篩選

當發(fā)酵液pH值為7.0時，防效最高，達65.49%;酸性條件下YB114上清液的防效明顯弱于堿性條件（圖2c）表明該菌株在酸性條件下產(chǎn)抑菌物質能力可能受到抑制。

2.4.4發(fā)酵溫度的篩選

當發(fā)酵溫度為32℃時防效最高，達76.34%。發(fā)酵溫度低于32℃時，防效隨溫度升高而增加；當發(fā)酵溫度為36℃時，防治效果顯著降低（圖2d），原因可能是隨著溫度升高，細菌代謝活動增強從而產(chǎn)生了更多的抑菌物質，但當溫度過高時，細菌的代謝活動會隨之下降，亦不利于抑菌代謝物的產(chǎn)生。

2.4.5轉速的篩選

當發(fā)酵轉速為180r/min時發(fā)酵上清液的防治效果達到最高，達86.65%（圖2e）；當轉速繼續(xù)增加到200r/min時，防治效果明顯降低，這可能是由于轉速過高導致菌體細胞壁破裂，從而影響了抑菌活性物質的產(chǎn)生。

2.4.6發(fā)酵時間的篩選

在發(fā)酵時間為20～24h時，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵上清液的防治效果逐漸增強，并在24h達到最高，防效為77.41%，此后隨發(fā)酵時間延長發(fā)酵上清液的防效呈逐漸下降的趨勢（圖2f）。這可能是由于長時間發(fā)酵使得培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分消耗過大，不利于菌株產(chǎn)生次級代謝物。

2.5發(fā)酵條件優(yōu)化后YB114上清液對黃瓜棒孢葉斑病的防治效果

用優(yōu)化前的培養(yǎng)基和優(yōu)化后的培養(yǎng)基分別對YB114進行發(fā)酵，其稀釋100倍的發(fā)酵上清液對黃瓜棒孢葉斑病的防效分別為41.25%和50.51%（表5），培養(yǎng)基優(yōu)化后防效提高22.4%。

3結論與討論

芽胞桿菌可以通過產(chǎn)生抗菌物質來抑制病原微生物的生長或直接殺死病原微生物。解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的抑菌物質包括蛋白類、脂肽類及聚酮類等。菌株發(fā)酵上清液中含有的抑菌物質可直接抑制病原菌生長。另一方面，菌株還可與病原菌爭奪營養(yǎng)物質及生存位點，減少病原微生物對植物的侵染。本研究發(fā)現(xiàn)，YB114的發(fā)酵液、發(fā)酵上清液及菌懸液對黃瓜棒孢葉斑病均表現(xiàn)出一定的防治效果，說明該菌株發(fā)酵液的抑菌活性是菌株所產(chǎn)抑菌物質及菌體本身共同作用的結果。同時還發(fā)現(xiàn)YB114的發(fā)酵上清液對黃瓜棒孢葉斑病的預防與治療效果均大于相同稀釋倍數(shù)的菌懸液，這表明上清液中的抑菌物質是該菌株發(fā)酵液能夠防治黃瓜棒孢葉斑病的主要原因。另外菌株發(fā)酵液、發(fā)酵上清液及菌懸液對黃瓜棒孢葉斑病的治療效果均明顯大于預防效果，許多研究發(fā)現(xiàn)，生防菌產(chǎn)生的抗菌肽可直接作用于病原菌細胞膜，破壞膜完整性并形成離子通道，使得病原菌細胞中物質溢出胞外而死亡，因此我們推測YB114接種后代謝產(chǎn)生的某些成分可能直接作用于山扁豆生棒孢，從而對黃瓜棒孢葉斑病表現(xiàn)出明顯的治療效果。

在利用生防菌進行病害防治的過程中，菌株產(chǎn)生的代謝物質起著十分重要的作用，菌株發(fā)酵是其代謝產(chǎn)物積累的過程，而發(fā)酵受到培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件等因素的影響。本研究采用單因素試驗設計，得到了菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件，使防效提高了22.4%，為該生防菌株后續(xù)投入生產(chǎn)實踐提供了基礎。

許多芽胞桿菌在防治植物病害的同時還具有促生作用，其作用機制包括促進植物對養(yǎng)分的吸收，產(chǎn)生或調節(jié)植物體內激素水平，增加植物葉片葉綠素含量等。如易有金等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌B-001可以顯著提高煙草中生長素、赤霉素及玉米素核苷的含量，對煙草幼苗有很好的促生效果。王心選等研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌EIR-J對白菜具有明顯的促生作用，并且可以使其葉綠素含量增加2倍左右。本研究表明，噴施了YB114發(fā)酵液的黃瓜苗體內生長素及玉米素核苷含量分別升高29.93%和41.15%，黃瓜葉片中葉綠素含量增加16.76%，表明該菌株具有提高黃瓜體內激素水平及葉綠素含量的能力，這可能是該菌株促進黃瓜幼苗株高、根長、葉面積、葉重增長的原因之一。

本研究中YB114兼具防病及促生作用，具有良好的開發(fā)前景，未來將深入探究該菌株的促生機制及代謝所產(chǎn)抑菌物質，為發(fā)揮生防菌作用提供理論基礎。