灰葡萄孢對氟啶胺的敏感性檢測及敏感性降低菌株生物學(xué)性狀研究

王曉輝 向禮波 劉美玲 楊立軍 龔雙軍

關(guān)鍵詞：灰葡萄孢；氟啶胺；敏感性；抗性菌株；生物學(xué)特性

灰霉?。╣rey mold）波及范圍廣，是世界性重要病害之一，該病會導(dǎo)致多種蔬菜果實(shí)腐爛變質(zhì)，是保護(hù)地蔬菜生產(chǎn)的一種威脅。其病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea具有寄主范圍廣泛、產(chǎn)孢量大、易隨氣流傳播、極易對殺菌劑產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)。目前，防治灰霉病的主要方法為施用殺菌劑。但是，由于灰葡萄孢基因變異頻率較高，生長速度快和產(chǎn)孢量大，其對殺菌劑具有較高抗性風(fēng)險。已有抗性監(jiān)測表明，灰葡萄孢對琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）、二甲酰亞胺類（DCFs）、呼吸抑制劑（QOls）和苯并咪唑類（MBCs）殺菌劑等均已產(chǎn)生了抗性。另外，還存在對幾種殺菌劑同時表現(xiàn)出多藥抗性的菌株。由于灰霉病菌的抗藥性導(dǎo)致殺菌劑的防效降低，甚至某些藥劑（DCFs和MBCs）在有些地區(qū)完全不能使用。

氟啶胺（fluazinam）是吡啶胺類殺菌劑（phe-nylpyrroles）中用于灰霉病防治的重要品種，由日本石原產(chǎn)業(yè)公司開發(fā)，它的作用機(jī)理獨(dú)特，能夠解偶聯(lián)氧化磷酸化，具有高效和廣譜特性。對鏈格孢屬Alternaria、葡萄孢屬Botrytis、疫霉屬Phytophthora，核盤菌屬Sclerotium的病原菌具有很好的防治效果。目前，氟啶胺制劑已經(jīng)登記防治多種作物病害，尤其在灰霉病防治上應(yīng)用廣泛。

已有的研究表明，植物病原菌對氟啶胺產(chǎn)生抗性風(fēng)險低，氟啶胺屬于低抗性風(fēng)險殺菌劑；且與其他類型的殺菌劑不存在交互抗性。自從1990年開始應(yīng)用防治作物病害以來，只有Tamura報(bào)道在菜豆田發(fā)現(xiàn)了抗氟啶胺的灰葡萄孢菌株。本研究從吉林、江西、湖北、山東、北京、湖南等地區(qū)的草莓、辣椒、四季豆、茄子和番茄上采集并分離了灰霉病菌菌株，測定其對氟啶胺的敏感性，比較敏感性下降菌株與敏感菌株之間的生物學(xué)性狀的差異，研究抗氟啶胺灰葡萄孢菌株的適合度，旨在為灰葡萄孢對氟啶胺的抗性治理及氟啶胺的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試藥劑

95%氟啶胺、98%咯菌腈和97%腐霉利原藥分別由湖北正興源精細(xì)化工有限公司、湖北貓爾沃生物醫(yī)藥有限公司和沈陽化工研究院有限公司提供。

1.2菌株的采集與分離

2020年-2021年分別在北京、吉林、湖南、山東、湖北和江西等地各種蔬菜大棚采集灰霉病病葉或病果，將采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室。18～20℃濕潤培養(yǎng)2d后，將具有灰霉病特征的病組織放置于解剖鏡下，采用龔國淑等的單孢分離法在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，再利用形態(tài)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，分離到的菌株置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3灰霉病菌對氟啶胺敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定：以二甲基亞砜為溶劑，將氟啶胺原藥配制成濃度為10mg/mL的溶液作為母液，置于4℃冰箱備用。在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上參照Shao等的方法設(shè)計(jì)帶藥平板濃度，對敏感性菌株濃度設(shè)為：0.001 562 5、0.003 125、0.006 25、0. 012 5、0.025、0.05u/g/mL和0.1ug/mL;對敏感性下降菌株濃度設(shè)為：0.0125、0.025、0.05、0.1、0.125、0.25、0.5、1、2ug/mL和4ug/mL，其中4u/g/ml。為最小抑制濃度（MIC）。將藥劑母液用二甲基亞砜稀釋成系列濃度，等量加入PDA培養(yǎng)基中，倒人滅菌培養(yǎng)皿中（d=9cm），制成帶毒平板，以添加等量二甲基亞砜作為空白對照。在預(yù)培養(yǎng)好的供試菌株菌落邊緣的同一圓周上用打孔器（d=3mm）打取菌餅，菌絲面朝下接種于培養(yǎng)皿中央，3次重復(fù)，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。待對照菌落大小接近培養(yǎng)皿邊緣時測定各處理菌落直徑（mm），與對照處理相比計(jì)算出菌落擴(kuò)展生長抑制率：生長抑制率=（對照菌落直徑一處理菌落直徑）／（對照菌落直徑一菌餅直徑）×100%。

以抑制率的幾率值y作為縱坐標(biāo)，藥劑濃度對數(shù)值z作為橫坐標(biāo)，求出毒力回歸方程y=bx+a和相關(guān)系數(shù)r，計(jì)算藥劑對病菌的抑制中濃度EC50。

1.4抗藥穩(wěn)定性

將敏感菌株JL106及敏感性下降菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47在無藥PDA平板上培養(yǎng)，當(dāng)菌絲形成菌落，打取菌餅繼代培養(yǎng)。分別測量各菌株的第1代、5代、10代對氟啶胺的敏感性。每代培養(yǎng)3d。

1.5對其他殺菌劑的敏感性

選取4株敏感性下降菌株和11株敏感菌株，分別測定其對二甲酰亞胺類的腐霉利和苯基吡咯類的咯菌腈敏感性，然后分別以對氟啶胺和其他藥劑的EC50的對數(shù)值為橫、縱坐標(biāo)作圖，求出回歸直線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.6對氟啶胺敏感性下降的灰葡萄孢菌株的生物學(xué)特性測定

1.6.1菌株生長速率測定

田間自然敏感性下降菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47，敏感菌株HN31，JX83，BJ17和JL106，接種于PDA培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)3d后，在菌落邊緣同一圓周上打取直徑為5mm菌餅，采用菌絲朝下的方式接種到含有15mL PDA培養(yǎng)基的正中間，用封口膜封緊培養(yǎng)皿，每菌株3次重復(fù)，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，測量菌落的生長直徑并記錄結(jié)果，每處理3個重復(fù)。

1.6.2菌絲生物量測定

參照Tian等的方法。在20℃條件下培養(yǎng)3d的敏感菌株HN31、JX83、BJ17和JL106及田間自然敏感性下降菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47的平板上，用直徑為3mm的打孔器于菌落邊緣同一圓周上打取5枚菌餅，接種于盛有200mL PDB培養(yǎng)液的塑料瓶中，每處理設(shè)置3次重復(fù)，振蕩培養(yǎng)96h去掉培養(yǎng)液，于60℃烘12h。稱量各瓶中菌絲干重，取3次重復(fù)的平均值為各處理的菌絲生物量。

1.6.3平板上產(chǎn)孢能力及孢子萌發(fā)能力

參照Markoglou等的方法，略加改動，方法如下：將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的敏感菌株HN31、JX83、BJ17和JL106及敏感性下降菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47的菌落于20℃，光照周期L∥D=14h∥10h條件下培養(yǎng)7～10d，每皿加20mL濃度為0.1%的葡萄糖液（有利于孢子萌發(fā)），用涂布器將所有的菌絲（包括分生孢子）刮下，用4層紗布過濾至50mL塑料離心管中，離心收集孢子，棄上清，用1%葡萄糖溶液重懸，振蕩器振蕩1min，使孢子充分地分散均勻。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)各菌株孢子懸浮液的濃度，并稀釋成80個/mL，取40uL于凹玻片中，于20℃黑暗培養(yǎng)6h，鏡檢每個菌株共200個孢子中萌發(fā)的孢子數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率，每菌株設(shè)置3次重復(fù)。

1.6.4致病力測定

將BJ14、BJ45、BJ46、BJ47和JL106等5個菌株在PDA平板上培養(yǎng)3d備用。選用生長狀態(tài)和大小相同且表面無明顯損傷的番茄果實(shí)進(jìn)行致病力測定。用蒸餾水輕輕清洗果實(shí)3次，將盤子（長25cm，寬19.5cm）用75%乙醇清洗消毒，然后用蒸餾水清洗干凈，鋪3層吸水紙，用蒸餾水濕潤。在各菌株的菌落邊緣同一圓周上打取5mm菌餅，菌絲面朝下接種到番茄果實(shí)中間部位，每菌株3次重復(fù)，置于20℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8d，統(tǒng)計(jì)對番茄的致病力并比較各菌株致病力的差異。試驗(yàn)重復(fù)3次。以對氟啶胺敏感的菌株JL106和PDA培養(yǎng)基為陰性對照和空白對照。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS軟件（Version 9.13；SAS Institute，Cary，NC）對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。5%水平下LSD多重比較檢驗(yàn)各處理平均值之間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1供試灰葡萄孢對氟啶胺的敏感性

采用菌絲生長速率法測定分離獲得的117株灰葡萄孢對氟啶胺的敏感性。菌株BJ14、BJ45、BJ46和BJ47的EC50分別是0.179 8、0.152 4、0.113 7 ug/mL和0. 394 6 ug/mL，顯著高于其他113個菌株，并且僅有這4個菌株能夠在MIC濃度（4ug/mL）下生長（圖1）。剩下113個菌株對氟啶胺的EC50平均值為0.025 1ug/mL，作為本研究的敏感基線。因此，這4個菌株為氟啶胺的敏感性下降菌株，其他菌株為氟啶胺敏感菌株。來自6省市的117株灰霉病菌的EC50的變化見表1，來自湖北的菌株敏感性最高，對氟啶胺的平均EC50最低，為0.002 6ug/mL;來自北京的菌株敏感性最低，對氟啶胺的平均EC50最高，為0.038 9ug/mL。

2.2抗性的穩(wěn)定性

將敏感性降低菌株在不含藥劑PDA平板上連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)后，測定其對氟啶胺抗性水平變化。結(jié)果（表2）表明，敏感性降低菌株在無藥劑條件下連續(xù)培養(yǎng)10代后，抗性水平無顯著差異，這說明對藥劑的不敏感性可以通過無性繁殖穩(wěn)定表現(xiàn)。

2.3交互抗性特征

氟啶胺敏感菌株和敏感性降低菌株對咯菌腈和腐霉利的敏感性不存在顯著差異，因此氟啶胺與咯菌腈、腐霉利之間不存在交互抗性（圖2）。

2.4對氟啶胺敏感性下降的灰葡萄孢菌株的生物學(xué)特性

2.4.1敏感性下降菌株生長速率、菌絲干重、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)

田間敏感性下降菌株生長速率顯著低于敏感菌株，但菌絲生物量與敏感菌株無顯著差異。田間敏感性下降菌株的產(chǎn)孢能力和孢子萌發(fā)率與敏感菌株也無顯著差異（表3）。

2.4.2敏感性下降菌株的致病力

在番茄果實(shí)上進(jìn)行致病力的試驗(yàn)結(jié)果表明，敏感菌株JL106的致病力顯著高于4株敏感性下降菌株（圖3）。4株敏感性下降的菌株致病力之間無顯著差異（表4）。

3結(jié)論與討論

建立敏感基線是病原菌對藥劑抗性風(fēng)險評估中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，尤其是對B．cznerea等有高抗藥風(fēng)險的病原菌。有關(guān)氟啶胺的敏感基線的研究已有很多報(bào)道，Shao等報(bào)道江蘇、浙江、遼寧、湖北和重慶等地區(qū)的100株灰霉病菌的EC50平均為0.022 7ug/mL，敏感菌株最低抑制濃度（MIC）<4 ug/mL，石妞妞等報(bào)道氟啶胺對福建省106株番茄灰霉病菌的EC50平均值為0.022 1ug/mL。本研究測定了采自吉林、北京、江西、山東、湖南和湖北等6省市共計(jì)117株灰霉病菌B．cinerea對氟啶胺的敏感性，樣本量足夠大；除了4株菌敏感性顯著降低之外，藥劑對其他113株病原群體EC50平均值為0.025 1ug/mL，與前人研究的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)的4個菌株都是從北京草莓種植園中分離，這可能與當(dāng)?shù)赜盟庮l率和用藥習(xí)慣有關(guān)，草莓的經(jīng)濟(jì)價值高，因此農(nóng)戶用藥頻次較高，藥劑的選擇壓力大，菌株對藥劑的敏感性降低。此外，發(fā)現(xiàn)的4株敏感性下降的菌株致病力顯著下降。所以，氟啶胺大面積推廣應(yīng)用期間，需要定期監(jiān)測灰葡萄孢對氟啶胺的抗性發(fā)展?fàn)顩r。

國內(nèi)外有關(guān)氟啶胺室內(nèi)和田間抗藥性的報(bào)道較少。Tamura報(bào)道日本北海道發(fā)現(xiàn)了大豆灰霉病菌B．cznerea的田間高抗性菌株，但是關(guān)于抗性倍數(shù)沒有詳細(xì)介紹。Shao等在室內(nèi)采用藥劑馴化獲得抗性突變體菌株，抗性菌株的抗性水平RF（突變體的EC50/親本菌株的EC50）為23～53，抗性菌株的EC50分布于0.23～0.44ug/mL之間。Vitoratos在室內(nèi)利用甲基硝基亞硝基胍誘變玉米瘤黑粉菌Ustilago may-dis獲得氟啶胺抗性菌株，抗性水平（RF）為11.8～80，EC50分布于0.25～0.48ug/mL之間。本研究分離得到4株對氟啶胺敏感性降低的田間菌株，其EC50為0.113 7～0.394 6ug/mL，其MIC值大于4ug/mL，抗性倍數(shù)在4.7和16.3之間，屬于低一中抗水平。

了解抗性菌株的生物學(xué)特性，可以為解析病原菌對藥劑的抗性機(jī)制提供幫助。在抗性菌株生物學(xué)特性研究中發(fā)現(xiàn)，4株敏感性下降菌株生長速率顯著低于敏感菌株，菌絲生物量、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率與敏感菌株無顯著差異；致病力測定結(jié)果顯示敏感性降低的菌株致病力顯著下降。說明這4株菌株田間競爭力沒有優(yōu)勢，從另一方面也說明為什么氟啶胺使用了快30年，但是在國內(nèi)外對其抗藥性的相關(guān)報(bào)道比較少。Vitoratos報(bào)道的甲基硝基亞硝基胍誘變獲得的突變體在生長速率和致病力上與親本菌株沒有差異，Shao等通過藥劑篩選獲得的突變體在菌絲生物量、產(chǎn)孢量和致病力上顯著低于親本菌株。本研究的結(jié)果與以上前人研究結(jié)果有差異，推測可能原因是抗性菌株獲得方法不同而有差異，抑或是菌株的種類不同而有所不同。交互抗藥性研究結(jié)果顯示，氟啶胺與咯菌腈和腐霉利不存在交互抗藥性。目前研究認(rèn)為腐霉利及咯菌腈的靶標(biāo)之一可能是雙組分信號途徑的雙組分組氨酸激酶元件OSl，在動物細(xì)胞中，氟啶胺通過解偶聯(lián)氧化磷酸化抑制細(xì)胞線粒體的能量合成，具體作用機(jī)制尚不清楚。Shao等研究顯示，抗性菌株ATP含量下降，然而ATPase活性卻顯著高于親本菌株，表明灰葡萄孢對氟啶胺的抗性機(jī)制與菌體的能量代謝密切相關(guān)。目前能量合成影響的相關(guān)研究主要是磷酸化抑制劑。磷酸化抑制劑一般有3類，第一類呼吸抑制劑，這類抑制劑抑制呼吸鏈的電子傳遞，也就是抑制氧化，氧化是磷酸化的基礎(chǔ)，抑制了氧化也就抑制了磷酸化；第二類磷酸化抑制劑，這類抑制劑抑制ATP的合成，抑制了磷酸化也一定會抑制氧化；第三類解偶聯(lián)劑，使氧化和磷酸化脫偶聯(lián)，氧化仍可以進(jìn)行，而磷酸化不能進(jìn)行，后兩類都抑制能量ATP合成。Vitoratos報(bào)道[25]室內(nèi)獲得的U．may-dis抗性突變體和敏感菌株對氟啶胺和磷酸化抑制劑寡霉素敏感性測定，表明兩者存在正交互抗藥性，而與解偶聯(lián)劑2，4-二硝基酚不存在交互抗藥性，氟啶胺作為磷酸化抑制劑還是作為解偶聯(lián)劑阻斷能量的產(chǎn)生，還需要進(jìn)一步的研究。在以后的研究中將分析氟啶胺和其他氧化磷酸化抑制劑對灰霉菌線粒體活性的影響，確定氟啶胺的確切作用位點(diǎn)。