中國(guó)南方稻田及其周邊環(huán)境根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定

徐幸 卓富彥 楊芳 袁斌 彭云良 郭榮 姬紅麗

關(guān)鍵詞：稻田；擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)；混合侵染；生物測(cè)定；特異性引物

根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne spp．廣泛分布于世界各地，是對(duì)全球農(nóng)業(yè)危害最嚴(yán)重的植物病原線蟲(chóng)。根結(jié)線蟲(chóng)侵染植物根部后，根部外觀畸形形成根結(jié)，導(dǎo)致根系的吸收能力降低，被害株地上部則長(zhǎng)勢(shì)衰弱、葉色異常，甚至提早死亡。此外，根結(jié)線蟲(chóng)的侵染還容易導(dǎo)致土壤中植物寄生性病原真菌侵入而造成復(fù)合侵染。目前，世界上已報(bào)道98種根結(jié)線蟲(chóng)，其中有40余種在我國(guó)已有發(fā)生記載。根結(jié)線蟲(chóng)可以隨苗木、土壤、灌溉水和農(nóng)用器械等傳播擴(kuò)大危害范圍。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，根結(jié)線蟲(chóng)病在我國(guó)發(fā)生和危害日益加重，一般病區(qū)導(dǎo)致作物減產(chǎn)15%～25%，部分田塊損失更高達(dá)70%以上甚至絕收。

我國(guó)于1959年在海南省水稻上發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲(chóng)病。進(jìn)入21世紀(jì)后，稻田及其周邊溝渠、菜地、苗圃等環(huán)境中不斷發(fā)現(xiàn)擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)Meloido-gyne grarninicola，分布范圍已包括海南、廣東、廣西、福建、湖南、浙江、湖北、江蘇、江西、四川等多省。徐幸等發(fā)現(xiàn)成都平原40%的稻田及周邊旱地受到數(shù)種根結(jié)線蟲(chóng)侵染，其中優(yōu)勢(shì)種為擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)。長(zhǎng)期以來(lái)，水旱輪作被認(rèn)為是控制根結(jié)線蟲(chóng)病的有效手段，但擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)危害性強(qiáng)，寄主范圍廣泛，并適應(yīng)水旱輪作環(huán)境，其發(fā)生和傳播將給各地水稻和其他作物生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重問(wèn)題，因此有必要全面了解根結(jié)線蟲(chóng)在我國(guó)水稻主產(chǎn)區(qū)的分布現(xiàn)狀和種類(lèi)，為制定相應(yīng)的傳播阻斷策略和防控措施奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

2019年11月-2020年2月．由全國(guó)農(nóng)技推廣服務(wù)中心組織南方水稻產(chǎn)區(qū)所在?。ㄖ陛犑校灾螀^(qū)）農(nóng)業(yè)廳植物保護(hù)部門(mén)，委托轄下2～3個(gè)縣（市／區(qū)）植保植檢站在3～5個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）采集土樣，各鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）選擇一個(gè)點(diǎn)，采集連片稻田及周?chē)档毓?0塊田樣品。田塊不論大小均沿“Z"字形路線設(shè)10個(gè)取樣點(diǎn)，挖取0～20cm耕作層土壤樣品裝袋，同一塊田10個(gè)點(diǎn)共取土壤樣品0.5～1.0kg，樣品袋內(nèi)裝入記載樣點(diǎn)地理位置和田塊栽種作物類(lèi)型信息的標(biāo)簽，連同樣品清單寄往四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室。共采集了15個(gè)?。ㄖ陛犑校灾螀^(qū)）的48個(gè)縣（市／區(qū)）的1181份土樣（表1）。其中海南72份，廣東60份，廣西60份，福建130份，上海82份，江蘇90份，安徽60份，江西100份，湖南110份，湖北64份，四川90份，重慶60份，云南83份，浙江60份，貴州60份。

1.2根結(jié)線蟲(chóng)生物測(cè)定

2020年3月初將采集的各田塊土樣粉碎，每份土樣加入一定體積的滅菌河沙（土樣和河沙體積比為3：1）后充分混勻，平均分成3份放入帶托盤(pán)（直徑15cm）的盆（下底直徑14cm）中，共計(jì)3543盆。澆透水后，每盆土壤表面一半播種20粒左右市購(gòu)番茄種子（‘美國(guó)紅冠’，四川省良明農(nóng)業(yè)科技有限公司），另半邊播種20粒左右水稻品種‘日本晴’種子。種子表面覆蓋一層滅菌細(xì)土后，用75%百菌清可濕性粉劑600倍稀釋液噴霧至稍有積水以預(yù)防立枯病。花盆擺放在塑料大棚內(nèi)，20d后溫度穩(wěn)定上升后移至網(wǎng)室內(nèi)水泥池中。晴天時(shí)每天用噴霧器噴細(xì)霧以保持土壤濕潤(rùn)，陰雨天用塑料薄膜覆蓋防止雨水沖淋。托盤(pán)之間始終保持2cm以上距離，以避免花盆間線蟲(chóng)交叉污染。培養(yǎng)50d后，拔取水稻和番茄根系洗去泥沙，調(diào)查每盆中2種植物根系有無(wú)根結(jié)形成，同一塊田3次重復(fù)有1次及1次以上水稻或番茄根系有根結(jié)產(chǎn)生，此土樣計(jì)為陽(yáng)性，3次重復(fù)2種植物根系均未產(chǎn)生根結(jié)則記為陰性。檢出率一陽(yáng)性土樣數(shù)／總土樣數(shù)×100%。

1.3根結(jié)線蟲(chóng)分子鑒定

收集生物測(cè)定檢出根結(jié)的水稻和番茄根系，小心洗凈泥沙后用消毒剪刀剪碎根系，剪破根結(jié)，用淺盤(pán)分離法分離獲得線蟲(chóng)懸浮液。線蟲(chóng)懸浮液于4℃冰箱靜置過(guò)夜，收集底部線蟲(chóng)于2mL離心管中，再將離心管液氮速凍30s后放在振動(dòng)磨樣機(jī)中磨樣30s，按照徐幸等的方法提取線蟲(chóng)DNA備用。用我國(guó)常發(fā)生的6種根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物（表2）進(jìn)行種類(lèi)鑒定。PCR擴(kuò)增體系為25uL：2×RapidTap Master mix（諾唯贊）12.5uL，10umol/L上、下游引物各1uL，模板DNA 1uL，超純水補(bǔ)足至25uL。PCR擴(kuò)增程序：95℃3 min;95u15s，退火溫度下退火15s（退火溫度見(jiàn)表2），72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72u5min．12u保存。以滅菌ddH20作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)室收集的6種根結(jié)線蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠110V電泳25min進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像儀上觀察并照相。能夠擴(kuò)增出某線蟲(chóng)特異性條帶的樣品計(jì)為該樣品對(duì)該線蟲(chóng)為陽(yáng)性。種類(lèi)檢出率一檢出某種根結(jié)線蟲(chóng)的土樣數(shù)／分子鑒定總土樣數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1各地土樣根結(jié)線蟲(chóng)檢出率

15個(gè)?。ㄖ陛犑校灾螀^(qū)）采集的土樣中均有部分土樣導(dǎo)致水稻或番茄根系產(chǎn)生根結(jié)，生物檢測(cè)結(jié)果表明，陽(yáng)性土樣為312份，總檢出率為26.42%（表3）。其中來(lái)自廣西的土樣檢出率最高，達(dá)到56.67%，其次為福建土樣，檢出率為53.08%。廣東、湖南和浙江土樣檢出率分別為41.67%、42.73%和45.00%；海南、安徽、江西、湖北、重慶、貴州和云南的土樣檢出率在11.67%～23.33%;上海、江蘇和四川的土樣檢出率則均在10%以下。

在15省（直轄市／自治區(qū)）的48縣（市／區(qū)）中檢測(cè)出陽(yáng)性土樣的有45個(gè)區(qū)（縣）。其中最高檢出率為73.33%，來(lái)自湖南省長(zhǎng)沙市寧鄉(xiāng)市；其次福建省仙游縣和廣西陸川縣檢出率均為66.67%；福建省漳州市漳浦縣檢出率為63.33%；福建省南平市順昌縣檢出率為60.00%。來(lái)自四川、重慶、貴州、江蘇和上海等省（市）各縣（市／區(qū)）的土樣樣品檢出率均較低，最高不超過(guò)20%。樣品未檢測(cè)出根結(jié)的有上海市的嘉定、浦東和松江3個(gè)區(qū)（表4）。

2.2根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定

利用6種線蟲(chóng)特異性引物，在171份陽(yáng)性土樣DNA中成功檢測(cè)并鑒定出6種已知根結(jié)線蟲(chóng)：擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)M．hapla、花生根結(jié)線蟲(chóng)M．a(chǎn)renarza、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)M．jauoanzca、象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)M．enterolobii和南方根結(jié)線蟲(chóng)M．in-cognita，平均檢出率分別為88. 89%、41. 52%、29.82%、10.53%、4.09%和3.51%（表5）。6種根結(jié)線蟲(chóng)導(dǎo)致水稻或番茄出現(xiàn)的根結(jié)癥狀（圖1）。其中擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)在調(diào)查的15?。ㄖ陛犑校灾螀^(qū)）均有分布，北方根結(jié)線蟲(chóng)在貴州、重慶、安徽和江西以外的調(diào)查省（直轄市／自治區(qū)）均有分布，花生根結(jié)線蟲(chóng)在四川和湖北外的調(diào)查省份的稻田或周邊環(huán)境中均有分布，爪哇根結(jié)線蟲(chóng)分布在安徽、云南、海南、浙江、廣西和福建稻田或周邊環(huán)境土壤中，南方根結(jié)線蟲(chóng)分布在云南、浙江、湖南和福建稻田或周邊環(huán)境土壤中，象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)分布在重慶、云南、湖南和福建的稻田或周邊環(huán)境土壤中。

所有調(diào)查省份均有2種及以上根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生。其中湖北、江西、貴州和四川檢測(cè)到2種，廣東、安徽、重慶、江蘇和上海檢測(cè)到3種，廣西和海南檢測(cè)到4種，浙江和湖南檢測(cè)到5種，福建和云南檢測(cè)到6種，各省檢測(cè)出具體種類(lèi)見(jiàn)表5。從采樣區(qū)縣看（表4），云南省西雙版納檢測(cè)出6種根結(jié)線蟲(chóng)，福建省仙游縣、福建省南平市順昌縣和浙江省金華市婺城區(qū)檢測(cè)出5種根結(jié)線蟲(chóng)，4種根結(jié)線蟲(chóng)混合發(fā)生的區(qū)（縣）有廣西陸川縣、浙江省衢州市龍游縣、湖南省長(zhǎng)沙寧鄉(xiāng)、湖南省益陽(yáng)市赫山區(qū)、湖南省常德市漢壽縣、福建省漳州市漳浦縣和海南省海口市龍華區(qū)等7個(gè)區(qū)（縣）。

在完成分子檢測(cè)的171塊田中，受1、2、3、4、5種和6種根結(jié)線蟲(chóng)侵染的土樣比例分別為：42.11%、41.52%、12.87%、2.92%、0.58%和0，其中最常見(jiàn)的為擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)單獨(dú)侵染（34.50%）、擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)與北方根結(jié)線蟲(chóng)（22.81%）和擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)與花生根結(jié)線蟲(chóng)（13.45%）2種混合侵染，這3種根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染的田塊占比為5.26%，擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)3種線蟲(chóng)混合發(fā)生的田塊比例為3.51%，其他根結(jié)線蟲(chóng)單獨(dú)和混合發(fā)生田塊數(shù)均不超過(guò)2塊田，其中來(lái)自云南西雙版納勐海鎮(zhèn)的一塊田同時(shí)檢出了擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)，但無(wú)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（表6）。

3結(jié)論與討論

早在20世紀(jì)20年代，海南省即發(fā)生水稻根結(jié)線蟲(chóng)病，至20世紀(jì)70、80年代，該病在海南已經(jīng)擴(kuò)展到多個(gè)縣，并在廣西浦北等地也有發(fā)現(xiàn)，分別鑒定為海南根結(jié)線蟲(chóng)M．hainanenszs、林氏根結(jié)線蟲(chóng)M．lini，目前這2個(gè)命名種已被歸并到擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)。劉國(guó)坤等將福建省水稻及周邊環(huán)境雜草上根結(jié)線蟲(chóng)鑒定為擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)，并為多地所證實(shí)。徐幸等研究發(fā)現(xiàn)稻田及周邊環(huán)境土壤中有擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)等多個(gè)種存在，同一田塊中有不同種根結(jié)線蟲(chóng)混合發(fā)生。本研究表明，擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)已成為我國(guó)南方稻區(qū)的主要優(yōu)勢(shì)種，在同一塊田常常與北方根結(jié)線蟲(chóng)或花生根結(jié)線蟲(chóng)混合發(fā)生。據(jù)報(bào)道，擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境，可以占領(lǐng)稻田、旱地、溝渠、綠化帶、淺灘等多種生境，這可能是擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)成為水稻田優(yōu)勢(shì)種的主要原因。而其他線蟲(chóng)在淹水環(huán)境下不能長(zhǎng)期生存，稻田土樣里分離鑒定到這些種類(lèi)，可能是由于其在周邊旱地中發(fā)生后隨灌溉水流入稻田并在水稻收獲后被采集，當(dāng)然也不能完全排除這些種類(lèi)中產(chǎn)生了能適應(yīng)較長(zhǎng)時(shí)間水淹的新種群，因而值得進(jìn)一步研究，

目前，水稻根結(jié)線蟲(chóng)在南方水稻主產(chǎn)區(qū)已經(jīng)普遍發(fā)生。有證據(jù)表明，中國(guó)擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)來(lái)源比較單一。筆者根據(jù)對(duì)水稻生產(chǎn)地區(qū)的調(diào)查，認(rèn)為隨著20世紀(jì)80年代末水稻“兩系雜交稻”育種大規(guī)模開(kāi)展，我國(guó)水稻南繁育種從海南往內(nèi)陸地區(qū)運(yùn)輸幼苗，可能是擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)迅速擴(kuò)散傳播的一個(gè)重要途徑。由于目前該線蟲(chóng)已廣泛分布，加上線蟲(chóng)寄主范圍廣，生境多樣，我國(guó)南方稻區(qū)已經(jīng)失去了通過(guò)檢疫阻止其擴(kuò)展的機(jī)會(huì)窗口。進(jìn)一步摸清華北、西北和東北稻區(qū)擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)在品種選育、集中育秧基地的發(fā)生現(xiàn)狀，以及該線蟲(chóng)在北方大棚和露地低溫環(huán)境的適應(yīng)能力，制定必要的檢疫管理措施仍具有重要意義。

近年來(lái)，水稻（水、旱）直播、旱育秧、濕潤(rùn)育秧、有氧灌溉等新栽培措施，更有利于水稻根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)生，而集中育秧和工廠化育秧基質(zhì)一旦受到根結(jié)線蟲(chóng)污染，引致的損失更加嚴(yán)重。因此，各地和水稻種植大戶有必要對(duì)本地水稻根結(jié)線蟲(chóng)污染情況進(jìn)行摸底調(diào)查。本研究所采用的生物測(cè)定方法簡(jiǎn)單易行，值得大力推廣。

據(jù)初步測(cè)定，目前生產(chǎn)上缺乏抗水稻根結(jié)線蟲(chóng)病的品種。國(guó)內(nèi)外研究表明，包括化學(xué)藥劑在內(nèi)的防治方法，都難以根除土壤中根結(jié)線蟲(chóng)，因此在水稻根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)生地區(qū)．應(yīng)采取綜合防治措施，在加緊抗性品種選育的同時(shí)，盡量避免在病田、病基質(zhì)直播和育秧，苗期宜采用淡紫擬青霉Purpureocilli-um lilacinun和噻唑膦等殺線蟲(chóng)劑交互使用的方法進(jìn)行防治，以減輕根結(jié)線蟲(chóng)的危害。防治時(shí)，也應(yīng)注意稻田周邊田埂、道路、水渠和旱地等環(huán)境中根結(jié)線蟲(chóng)的防治。本研究中還有一些土樣導(dǎo)致水稻或番茄產(chǎn)生了根結(jié)，但由于DNA提取數(shù)量和質(zhì)量原因，未能成功進(jìn)行分子鑒定；這些土樣，以及已成功檢測(cè)出已知根結(jié)線蟲(chóng)的土樣中，均不能排除還有其他的根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)發(fā)生，仍需進(jìn)一步重復(fù)取樣、分離培養(yǎng)和鑒定。