西藏昌都市卡若區(qū)蔬菜主要病毒檢測(cè)及番茄斑萎病毒鑒定

鄭寬瑜 熊智琦 魏治鐳 吳闊 王茂森 蘇曉霞 巴宗 次仁措姆 王田田 張仲凱

關(guān)鍵詞：高原；番茄；辣椒；萵苣；番茄斑萎病毒

為解決農(nóng)民增收和蔬菜供應(yīng)的問(wèn)題，西藏自治區(qū)將蔬菜產(chǎn)業(yè)作為重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)進(jìn)行扶持發(fā)展。2021年昌都市蔬菜種植面積已達(dá)4335.5hm2，其中露地蔬菜面積4057.36hm2，設(shè)施蔬菜面積達(dá)278.14hm2。種植的蔬菜種類(lèi)主要有：萵苣、青椒、番茄、小白菜、大白菜、結(jié)球甘藍(lán)、黃瓜、蔥、蒜苗、香菜、蘿卜、菠菜和花菜等。昌都市卡若區(qū)主要蔬菜為溫室和大棚種植的番茄、辣椒和生菜，露地種植的主要有萵苣、白菜和辣椒。西藏大部分蔬菜種植地區(qū)處于3000m以上的高海拔地區(qū)，露地種植的蔬菜病害發(fā)生較少，溫室和大棚蔬菜近年來(lái)發(fā)展較快，病毒病和白粉病發(fā)生普遍。其中，昌都市卡若區(qū)溫室和大棚蔬菜及露地栽培的番茄、辣椒和萵苣病毒病發(fā)生普遍，引起嚴(yán)重減產(chǎn)，蔬菜質(zhì)量下降。本項(xiàng)目開(kāi)展之前，該區(qū)域尚無(wú)對(duì)蔬菜病害開(kāi)展系統(tǒng)調(diào)查和研究的工作。近年來(lái)全球番茄、辣椒和萵苣主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生普遍，其中，番茄和辣椒上主要有薊馬傳播的正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒引起的斑萎病和菜豆金色花葉病毒屬Begornoozrus病毒引起的曲葉病，侵染番茄的病毒類(lèi)致病因子（包括病毒、衛(wèi)星病毒、病毒衛(wèi)星分子和類(lèi)病毒）多達(dá)312種，侵染辣椒的病毒多達(dá)62種，侵染萵苣的病毒10余種。

為明確昌都市卡若區(qū)的蔬菜主要病毒種類(lèi)，本研究對(duì)昌都市卡若區(qū)溫室和大棚及露地栽培的蔬菜主要病毒病害進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，對(duì)侵染蔬菜的主要病毒進(jìn)行檢測(cè)鑒定。通過(guò)ELISA檢測(cè)明確昌都市卡若區(qū)蔬菜主要病毒種類(lèi)，進(jìn)一步以電子顯微鏡制樣觀察、RT-PCR擴(kuò)增及序列分析鑒定主要病毒，為西藏高原蔬菜生產(chǎn)中病毒病綠色防控提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

于2020年6月-10月在西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)對(duì)溫室、大棚和露地栽培蔬菜進(jìn)行病毒病調(diào)查。采集感染病毒病的番茄、辣椒和萵苣葉片和果實(shí)樣品共計(jì)42份。

1.1.2主要試劑

負(fù)染色制樣試劑為戊二醛固定液，鉬酸銨染色劑；超薄切片制樣試劑按照參考文獻(xiàn)中的方法配制；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Quick RT Master Mix（康為，中國(guó)）。

1.1.3抗體

番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt vtrus，TSWV）、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、煙草花葉病毒（tobacco mosalc virus，TMV）、番茄花葉病毒（tomato mosaic virus．ToMV）、鳳果花葉病毒（pepino mosaic virus，PepMV）、番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、煙草環(huán)斑病毒（tobacco ringspot virus，TRSV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）單克隆抗體由浙江大學(xué)吳建祥教授提供，羊抗鼠二抗購(gòu)自Abcom（英國(guó)）。

1.2方法

1.2.1ELISA檢測(cè)

對(duì)采集的42份樣本進(jìn)行病毒種類(lèi)檢測(cè)，待檢測(cè)病毒有8種，包括TSWV、PVY、TMV、ToMV、PeP-MV、TYLCV、TRSV、CMV。將待測(cè)樣品、實(shí)驗(yàn)室保存的上述8種病毒陽(yáng)性對(duì)照樣品、健康無(wú)病毒的番茄陰性對(duì)照樣品及空白對(duì)照加入酶標(biāo)板，100uL/孔，37℃，3h，PBST洗板。加入含5%脫脂奶粉的PBST封閉板，200uL/孔，37℃，30min，待其干燥后加入多抗，100uL/孔，37℃，3h，PBST洗板。加入酶標(biāo)二抗（羊抗兔），100uL/孔，37℃，3h，PBST洗板。加入底物顯色劑，100uL/孔，室溫，顯色。

1.2.2負(fù)染色制樣透射電子顯微鏡觀察

將采集樣品按照參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行負(fù)染色制樣，制備樣品置于FEI（TaicnaiG2 Spirit）透射電子顯微鏡觀察、拍照。根據(jù)負(fù)染色電子顯微鏡觀察結(jié)果，初步推測(cè)引起主要病害的病毒種類(lèi)。

1.2.3超薄切片制樣透射電子顯微鏡觀察

按照參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行超薄切片制樣，制備樣品置于FEI（TaicnaiG2 Spirit）透射電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4TSWV N基因擴(kuò)增克隆和序列分析

根據(jù)負(fù)染色及超薄切片觀察結(jié)果，推測(cè)采集樣品受到番茄斑萎病毒感染，根據(jù)已報(bào)道的TSWVN基因序列設(shè)計(jì)特異引物TSWV N-F： 5'-AT-GTCTAAGGTTAAGCTCACTAAGG-3 7，

TSWVN-R： 5r_TTAAGCAAGTTCTGCAAGTTTTGTC_3；，擴(kuò)增目的片段大小為777bp。采用TRIzoI（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）提取各樣品總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Quick RT Master Mix（康為，中國(guó)）制備cDNA。PCR反應(yīng)體系（25uL）：TaqDNA mix 12.5uL，TSWV N-R（10umol/L）1uL，TSWVN-F（10umol/L）1uL，cDNA模板5uL，ddH20 5.5uL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4min；94℃30s，55℃30 s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行純化回收，并連接到pMD18-T克隆載體（TaKaRa）上，之后熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a（TaKaRa）中。在含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選后，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測(cè)序。測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行在線(xiàn)比對(duì)，并將得到的序列與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的TSWVN基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。使用軟件MEGA 6．0的鄰接法（neighbor-join-ing，N）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap重復(fù)1000次。

2結(jié)果與分析

2.1西藏昌都市卡若區(qū)的蔬菜主要病毒病

溫室和大棚蔬菜中，番茄、辣椒和生菜病毒病發(fā)生較為嚴(yán)重。番茄植株表現(xiàn)為葉部褪綠、萎蔫，果實(shí)白化、黃化、僵硬、環(huán)斑（圖1a，b）。辣椒葉部出現(xiàn)褪綠斑或環(huán)斑，頂葉萎蔫，果實(shí)表現(xiàn)為黃化斑或褪綠斑（圖1c，d）。生菜葉部有褐色壞死斑點(diǎn)或壞死斑，植株矮化（圖1e）。上述癥狀特點(diǎn)與正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒引起的斑萎病相似，到后期番茄和辣椒發(fā)病率超過(guò)70%以上，生菜發(fā)病率達(dá)到50%，嚴(yán)重影響蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量。溫室和大棚栽培的其他蔬菜如瓜果類(lèi)南瓜和黃瓜等未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒病癥狀。

露地栽培的蔬菜中，萵苣病毒病發(fā)生嚴(yán)重，根據(jù)不同發(fā)病時(shí)期葉部表現(xiàn)為褪綠（早期）、黃化（中期）和壞死斑（后期），植株嚴(yán)重矮化（圖1f），與已報(bào)道的番茄斑萎病毒侵染引起的萵苣斑萎病相似。其次為辣椒斑萎病，葉部和果實(shí)癥狀與溫室和大棚栽培的相似，發(fā)病率約30%以上。露地栽培的其他蔬菜如白菜等未見(jiàn)明顯的病毒病。

2.2西藏昌都市卡若區(qū)主要蔬菜病毒種類(lèi)的ELISA檢測(cè)

對(duì)采集的42份樣本進(jìn)行8種病毒種類(lèi)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示，在42份樣本中，共檢出TSWV、PVY以及PepMV 3種病毒。TSWV檢出率為40.48%，PVY檢出率為28.57%，PepMV檢出率為21.43%。辣椒中的檢出病毒以單一侵染為主，番茄中的檢出病毒以混合侵染為主。PVY及PePMV在番茄中具有較高的檢出率，分別為45.00%和35.00%，高于在辣椒中的檢出率（PVY14. 29%，PePMV 9.52%）。混合侵染的組合類(lèi)型包括TSWV+PVY+PepMV、TSWV+PVY、TSWV+PepMV、PVY+PepMV。

2.3侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣樣品的番茄斑萎病毒屬病毒形態(tài)特征

對(duì)表現(xiàn)番茄斑萎病毒病癥狀的番茄、辣椒及萵苣樣品20YV257、20YV181、20YV176進(jìn)行負(fù)染色和超薄切片制樣，透射電子顯微鏡觀察。負(fù)染色樣品中均觀察到直徑約80～120nm的球形病毒粒體，與orthotospoviruses的粒體形態(tài)相似。超薄切片制樣中，番茄果實(shí)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分布較多直徑約85nm的球形病毒粒體，聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中，部分病毒粒體聚集于液泡內(nèi)的囊泡中，細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整（圖2a）；辣椒果實(shí)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布較多直徑約85nm的球形病毒粒體，聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)，與較多線(xiàn)粒體相連，病毒粒體多分布于靠近細(xì)胞壁的細(xì)胞質(zhì)中，葉綠體結(jié)構(gòu)不完整（圖2b）。萵苣葉部細(xì)胞中，分布有直徑約85nm的球形病毒粒體，早期受侵染的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布少量單個(gè)病毒粒體，葉綠體中嗜鋨顆粒增加，后期受侵染的細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多個(gè)病毒粒體聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池，葉綠體和線(xiàn)粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失（圖2c）。根據(jù)病毒粒體形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)病毒粒體聚集特征分析，番茄、辣椒和萵苣樣品受orthotospoviruses感染，與代表種TSWV在寄主植物細(xì)胞內(nèi)的分布特征類(lèi)似。

2.4侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣的TSWV N基因擴(kuò)增

用TSWV N基因引物對(duì)番茄（20YV257、20YV258）、辣椒（20YV181、20YV268、20YV270）和萵苣樣品（20YV176）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，從番茄、辣椒和萵苣樣品中擴(kuò)增出目的條帶，大小約770bp（圖3）。經(jīng)測(cè)序后得到的序列在NCBI中進(jìn)行提交，得到的NCBI序列號(hào)分別：OP893535（20YVr76）;

OP893534（20YV181）、OP893536（20YV257）、OP893537（20YV258）、OP893538（20YV268）、OP893539（20YV270）。上述6條序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，均與NCBI上注冊(cè)的TSWV一致性最高，達(dá)99%以上。

2.5侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣的TSWV N基因序列分析

將本研究得到的6條TSWVN基因序列與NCBI上國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)TSWV-N基因序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖4所示，從西藏昌都番茄、辣椒和萵苣分離得到的6條TSWV-N基因序列與云南TSWV煙草分離物（MF193425）、云南TSWV鬼針草分離物（MF805764）、云南TSWV豌豆分離物（KY495609）、云南TSWV煙草分離物（MF193426）及云南番茄分離物（JF960235）聚在同一分支，表明TSWV西藏昌都分離物與云南TSWV分離物親緣關(guān)系最近。

3結(jié)論與討論

TSWV是目前已報(bào)道的病毒中發(fā)生分布范圍最廣和寄主植物最多的植物病毒，在全球熱帶、亞熱帶和溫帶均有發(fā)生，侵染的植物多達(dá)84科1090多種。由于溫室、大棚等設(shè)施蔬菜的普及，近10年來(lái)TSWV進(jìn)一步快速蔓延。自2010年應(yīng)用N基因克隆、測(cè)序，氨基酸序列推導(dǎo)和病毒粒體在細(xì)胞內(nèi)的分布特征發(fā)現(xiàn)TSWV在我國(guó)云南番茄和煙草上發(fā)生以來(lái)，至2020年，已在我國(guó)18個(gè)省（區(qū)、市）發(fā)現(xiàn)TSWV侵染番茄和辣椒等作物，TSWV是近年來(lái)引起云南番茄、辣椒和萵苣類(lèi)蔬菜（萵苣、生菜和油麥菜）病毒病的優(yōu)勢(shì)種。TSWV侵染后引起褪綠、花葉、黃化和壞死等癥狀，導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)品質(zhì)量下降和產(chǎn)量損失。在自然條件下，TSWV主要通過(guò)西花薊馬Frankliniella occidentalis傳播，2022年又報(bào)道可通過(guò)辣椒種子傳播。西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)的蔬菜生產(chǎn)區(qū)域（包括溫室、大棚和露地）平均海拔3000m以上，在2020年之前未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒病，隨著智能化溫室的推廣普及，為病毒病發(fā)生提供了適宜的條件，而種子攜帶病毒促進(jìn)了病毒的遠(yuǎn)距離傳播。本研究發(fā)現(xiàn)卡若區(qū)溫室內(nèi)番茄、辣椒和生菜上由TSWV引起的斑萎病發(fā)病率較其他病毒高，而且在露地栽培的萵苣和辣椒上發(fā)病率也很高，說(shuō)明TSWV已適應(yīng)高原缺氧和紫外線(xiàn)強(qiáng)的環(huán)境。在發(fā)病區(qū)域，未發(fā)現(xiàn)傳毒介體西花薊馬，也未發(fā)現(xiàn)其他雜草或作物有TSWV引起的癥狀，推測(cè)由種子攜帶病毒傳播的可能性較大。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)蔬菜種子攜帶TSWV的檢測(cè)，在育苗期應(yīng)及時(shí)抽樣檢測(cè)，從源頭和早期開(kāi)展蔬菜病毒病的預(yù)防，減少斑萎病引起的蔬菜產(chǎn)量損失和質(zhì)量下降。

本研究明確了西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)溫室和大棚栽培番茄、辣椒和生菜及露地栽培辣椒和萵苣上發(fā)生的主要病毒為T(mén)SVVV、PVY及PepMV，且以TSWV的檢出率最高。進(jìn)一步對(duì)檢出TSWV的樣品進(jìn)行電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)為典型的正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒粒體；通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增克隆和序列分析，明確西藏昌都市卡若區(qū)蔬菜感染的TSWV與TSWV云南分離物親緣關(guān)系最近。本研究首次報(bào)道了西藏自治區(qū)TSWV的發(fā)生，為該區(qū)域蔬菜斑萎病及TSWV侵染引起的其他作物病害的監(jiān)測(cè)預(yù)警與綠色防控提供了依據(jù)。