郁金香和百合主要病害、病原及鑒定方法

廖天藍 羅金燕 陳磊 朱潔 李斌 安千里

關鍵詞：郁金香；百合；球根花卉；病害；病原鑒定

球根花卉（bulb flowers）因其花色豐富、花形碩大、成品花價格高等特點，成為花卉產業(yè)中重要的生產種類，在國內花卉市場上所占份額也日漸增多。常見栽培的球根花卉涉及20余科，上千個品種，其中百合科Liliaceae多年生草本鱗莖類植物郁金香和百合最為常見。郁金香花色豐富，植株剛勁挺拔，葉色素雅秀麗，有相當高的觀賞價值，在世界各地廣泛應用于鮮切花生產、庭院栽培以及盆栽。在全球范圍內，郁金香種植總面積達1.3萬hm2，荷蘭是世界上最大的郁金香栽培國，占全球種植面積的88%，種球產量超過43億顆。百合花除了具有觀賞性，又因含有芳香油，可從中提取香精煉制香料，而百合鱗莖可供食用或藥用，藥食兼優(yōu)。在我國，食用百合主要產地有甘肅蘭州、湖南隆回、江蘇宜興等，種植面積超2萬hm2；觀賞百合主要產地有云南昆明、遼寧凌源、廣東佛山等，種植面積約8000hm2。

郁金香和百合是較易感病的花卉，在實際生產過程中，經常發(fā)生由真菌、細菌和病毒等引起的病害，不僅影響郁金香和百合的正常生長，導致產量和觀賞性下降，病害嚴重時甚至對郁金香和百合產業(yè)產生毀滅性打擊，造成巨大經濟損失。因此，在普查國內郁金香和百合主要病害和病原的基礎上，總結有效的病害病原檢測檢疫方法，可為建立郁金香和百合主要病害防治體系奠定基礎，為郁金香和百合產業(yè)的規(guī)?；l(fā)展提供支撐。

1郁金香主要病害、病原及檢測方法

1.1郁金香主要真菌病害和病原真菌

郁金香的真菌病害主要有郁金香種球腐爛病、郁金香枯萎病、郁金香青霉病和郁金香灰霉?。ū?）。

1.1.1郁金香種球腐爛病

郁金香種球腐爛病引起的種球腐爛多從鱗莖開始，由外向內逐漸擴大，病健交界處呈褐色水漬狀病斑，鱗莖中央部分壞死，病斑干燥后，呈黃褐色于腐。早在1965年就有報道，尖孢鐮刀菌郁金香?；蛯е掠艚鹣惴N球腐爛病，國內已發(fā)現尖孢鐮刀菌郁金香?；秃痛殓牭毒鶩．rnoniLiforrn.e引起郁金香種球腐爛病。

1.1.2郁金香枯萎病

郁金香枯萎病一般發(fā)生在郁金香種球的貯藏期，發(fā)病初期郁金香鱗莖鱗片上出現紫紅色的小斑點，之后擴展成不規(guī)則黃色至淺褐色病斑，發(fā)病后期郁金香種球呈現褐色干枯狀。鱗莖未被感染的郁金香植株染病后，葉片和花梗上的病斑淺灰色，邊緣褐色，病斑逐漸擴大集結，最后莖葉完全枯萎。病原菌為層出鐮刀菌F．proliferatum。

1.1.3郁金香青霉病

郁金香青霉病主要危害鱗莖。受害鱗莖表面形成暗褐色凹陷病斑，鱗莖內部鱗片逐漸腐爛，最后整個鱗莖干朽萎縮，且表面出現藍綠色霉層，病株的地上部也可表現出癥狀。病原菌是圓弧青霉和叢花青霉。

1.1.4郁金香灰霉病

郁金香灰霉病危害葉片、花朵和鱗莖。葉片受害后多向一側卷皺，病斑覆蓋灰色霉層；花朵受害后產生褐色病斑，病斑覆蓋灰色霉層，后期花朵干枯；鱗莖受害后，外皮褐色碎裂，上面有許多黑色小菌核，由受害鱗莖長出的植株矮化。病原菌為郁金香葡萄孢Botrytis tulipae。

1.2郁金香主要細菌病害和病原細菌

郁金香的細菌病害主要有郁金香潰瘍病和郁金香軟腐病。

1.2.1郁金香潰瘍病

郁金香潰瘍病最早于1964年在荷蘭發(fā)現，病原菌為萎蔫短小桿菌奧氏致病變種CurtobacteriurnfZaccumfaciens pv. oortii，又稱郁金香黃色皰斑病菌。感病郁金香花朵萎蔫變形，葉片失水褪綠，10～15d內全株發(fā)病，整株干枯死亡。1983年我國首次報道在臺灣省發(fā)生郁金香潰瘍病，1986年從日本引種郁金香到浙江省時傳人中國大陸。邵秀玲等針對郁金香黃色皰斑病菌的16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列，設計了一對特異性引物和TaqMan探針，建立了實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chainreaction，qPCR）方法特異性檢測，用于郁金香潰瘍病疑似或初期癥狀的快速診斷。

1.2.2郁金香軟腐病

郁金香軟腐病危害郁金香鱗莖，使其變褐、變軟、腐爛并發(fā)出臭味。任國蘭等首次對郁金香軟腐病的病原菌進行了分離鑒定，發(fā)現該病原菌與引起大白菜軟腐病的病原細菌的特性完全相同，能侵染大白菜、馬鈴薯、辣椒和洋蔥，因此，鑒定該病原菌為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種，該病菌后來被確定為胡蘿卜果膠桿菌。菊迪基氏菌（舊稱菊歐文氏菌）和洋蔥腐爛病菌（唐菖蒲伯克霍爾德氏菌蔥生致病變種BurkhoLderia gladioli pv.allicola）也能引起郁金香軟腐病。

1.3郁金香病毒病和主要病毒

郁金香病毒病使郁金香種球產量與品質嚴重下降，制約著郁金香栽培及鮮切花生產的發(fā)展，主要病原是郁金香碎色病毒（tulip breaking virus，TBV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV），均是RNA病毒。張西英等針對TBV和CMV的外殼蛋白編碼序列設計特異引物，將逆轉錄酶與DNA聚合酶混合，實現在同一反應體系中連續(xù)進行逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse-transcription polymerasechain reaction，RT-PCR）和PCR，檢測病毒感染情況。

郁金香碎色病毒病是現代郁金香栽培中最重要的病毒病，感病花朵上出現不規(guī)則的火焰和羽毛狀圖案。Agoston等采集了32個具有典型郁金香碎色病毒病的郁金香病株的葉片，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme

linked

immunosorbent

assay，ELISA）和RT-PCR檢測鑒定出了3種馬鈴薯Y病毒屬病毒：TBV、百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV）和倫勃朗郁金香碎色病毒（Rembrandt tu-lip-breaking virus，ReTBV）。葉蓉春等基于TBV的核酸序列設計特異引物組合，篩選出10對引物，用RT-PCR能夠從感郁金香碎色病毒病植株中擴增出特異性條帶，而正常植株為陰性，可用于檢測TBV。結合生物接種試驗和特征癥狀也可以鑒定TBV。Polder等使用機器學習算法開發(fā)了一個基于機器視覺的自動系統(tǒng)，通過使用感染TBV的郁金香圖像訓練卷積神經網絡（convolutional

neu-ral networks），自動化檢測田間感染TBV的郁金香植株。

TRV主要通過毛刺屬Trichodorus和擬毛刺屬Paratrichodorus的線蟲進行傳播，寄主廣泛，能感染多種球根花卉，如郁金香、百合和水仙等，感病植株葉片呈現斑駁癥狀。針對TRV的免疫學方法和核酸擴增方法，如ELISA、RT-PCR、環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）已廣泛用于TRV的檢測中。

1.4郁金香線蟲病和主要病原線蟲

1999年珠海市海濱公園種植的荷蘭進口郁金香發(fā)生線蟲病。鱗莖外鱗片出現大小不等的褐色病斑，線蟲集中在鱗莖長根處，使鱗莖少根甚至無根；植株矮小，葉片低垂或卷曲，葉片變黃甚至枯死。感病品種‘白夢’近70%植株枯死不抽花；有花的，花小且暗淡，觀賞價值大減。病原有滑刃屬Aphelen-choides和莖屬Ditylenchus線蟲。發(fā)病原因很可能是荷蘭進口的郁金香種球攜帶線蟲。由荷蘭進口郁金香種球在錦州世博園種植，有些郁金香植株有明顯的萎蔫、矮化和黃化癥狀，從球莖中分離鑒定到滑刃線蟲。全國各地口岸多次從進境郁金香種球中截獲滑刃線蟲、莖線蟲和短體線蟲Pratylen-chus。莖線蟲主要分布于溫帶地區(qū)，寄主范圍廣，為害多種作物蔬菜和郁金香、風信子、水仙等球根類觀賞植物，其取食植物地下和地上部，隨寄主植物的種子、鱗球莖、匍匐莖、植物殘體和土壤傳播。短體線蟲也稱根腐線蟲，是遷徙性內寄生線蟲，全球分布，寄主植物廣泛，是危害僅次于根結線蟲和孢囊線蟲的重要植物寄生線蟲。短體線蟲能造成嚴重的根部損傷，傷口引發(fā)真菌和細菌的二次侵染，導致整個根系腐爛。

毛刺屬和擬毛刺屬線蟲是外寄生線蟲，寄主廣泛，包括作物、果樹、觀賞植物等，通過種子、塊莖、帶根苗木和土壤傳播，不僅直接取食為害寄主植物，造成球根花卉根系腐爛、植株死亡，還能作為介體將TRV傳播給郁金香和百合等多種植物。

2百合主要病害、病原及檢測方法

2.1百合主要真菌病害和病原真菌

百合的真菌病害主要有百合枯萎病、百合灰霉病和百合炭疽?。ū?）。

2.1.1百合枯萎病

百合枯萎病可引起百合葉片、根和莖的腐爛，也被稱為百合鱗莖腐爛病或百合根腐病，主要由鐮刀菌屬Fusarzurn真菌引起。作為一種由真菌引起的土傳病害，百合枯萎病因發(fā)病頻繁、危害嚴重受到學界關注，對于百合枯萎病的病原菌、發(fā)病機制、發(fā)病規(guī)律、防治措施等方面的研究不斷深入。早在1960年就有從百合枯萎病株上分離到尖孢鐮刀菌F．or-ysporum的報道。1992年，我國首次報道百合枯萎病。

近年來，從我國不同地區(qū)、不同品種百合的枯萎病病株上分離到多種鐮刀菌，包括尖孢鐮刀菌百合?；虵．orysporurn.f.sp.

lilii、串珠鐮刀菌、層出鐮刀菌、共享鐮刀菌F．cornrnune、腐皮鐮刀菌F．solani、三線鐮刀菌F．tricinctum、煙草鐮刀菌F．tabacinum、禾谷鐮刀菌F．grarninearum。

2.1.2百合灰霉?。ò俸先~枯?。?/p>

百合灰霉病又稱百合葉枯病，感病百合葉片上產生淚滴病斑，最終會導致百合病株完全落葉。早在1969年就有橢圓葡萄孢B．elliptica引起百合灰霉病的報道。在國內發(fā)現引起百合灰霉病的病原菌是橢圓葡萄孢和灰葡萄孢B．cinerea。

2.1.3百合炭疽病

百合炭疽病由刺盤孢屬Colletotrichurn真菌引起，危害百合葉片、花和鱗莖等。葉片感病，產生黑褐色的病斑，后期葉片干枯至脫落；花感病，花瓣產生圓形或不規(guī)則的淺褐色病斑，后期組織潰爛變?。击[莖感病，外側鱗片產生淡紅色不規(guī)則的病斑，病健交界明顯，后期病斑變成暗褐色并硬化，病斑合并使鱗片干縮呈黑褐色。引起百合炭疽病的病原菌有C．liliacearum、百合炭疽菌C．lilii和白蠟樹炭疽菌C．spaethianum。

2.2百合卵菌病害和病原卵菌

由卵菌引起的百合疫病多發(fā)生在潮濕的雨季，發(fā)病初期百合病株的莖基部出現淡黃色水漬狀腐爛，地上部表現為葉片變黃和植株萎蔫，后期百合病株的莖基部組織變黑變褐，維管組織變軟腐爛，葉片由下至上變黃脫落，最后整株死亡。1992年，我國首次報道百合疫病的發(fā)生，從臺灣省百合病株分離到的病原菌為寄生疫霉Phytophthora

para.sitica，后來從甘肅省和云南省百合病株分離到的病原菌為煙草疫霉P．nicotianae。

2.3百合病毒病和主要病毒

LMoV、CMV和百合無癥病毒（lily symptom-less virus．LSV）是世界范圍內侵染百合最普遍且危害最嚴重的3種病毒，均是RNA病毒。LMoV由蚜蟲非持續(xù)性傳播，能系統(tǒng)侵染郁金香屬和百合屬植物，侵染百合的癥狀主要表現為葉片出現斑駁條紋甚至壞死斑，發(fā)展為開碎色花，花朵和葉片分叉卷曲，常伴隨植株矮小，花與球莖減產等，造成花卉產量和質量的嚴重下降。CMV單獨侵染百合時癥狀表現為葉片萎縮、黃化、變皺，莖部變形等。LSV由蚜蟲傳播，侵染百合后沒有明顯癥狀，但經常與CMV復合侵染百合，癥狀表現為植株矮小，葉片畸形，葉片產生褪綠斑或壞死斑點，花期縮短甚至不能開花等。因此，可根據復合侵染癥狀判斷是否有LSV侵染。LSV也能侵染郁金香。

早期主要采用病株汁液摩擦接種、嫁接和介體傳播等方法侵染指示植物，通過寄主反應鑒定病毒，或通過間接ELISA（I-ELISA）和雙抗體夾心EIISA（DAS-EIISA）等免疫學方法特異性檢測病毒，并結合電子顯微鏡觀察病毒粒子的形態(tài)特征、內含體的有無和存在形態(tài)以及百合細胞和組織的病變情況進行鑒定。近期診斷鑒定植物病毒最常用的方法是RT-PCR和等溫擴增。

目前，國際病毒分類委員會確認的大多數植物病毒的基因組全序列或部分序列已被測定，針對LMoV、LSV和CMV已知的RNA序列，設計特異性引物，利用RT-PCR技術能快速鑒定這3種病毒。近年來，RT-PCR技術在不斷創(chuàng)新和發(fā)展之中，應用于檢測鑒定LMoV、LSV和CMV的有多重RT-PCR技術、免疫捕獲RT-PCR （IC-RT-PCR）技術、將多重RT-PCR技術和IC-RT-PCR技術結合的免疫捕獲多重（三重）RT-PCR技術、實時熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）技術等。

LAMP技術是一種在恒溫下依靠具有鏈置換活性的DNA聚合酶進行核酸擴增的技術，是檢測植物檢疫性病毒中應用最早、涉及類群最多的等溫擴增技術。范小瑞將RT-PCR技術和LAMP技術結合，研制了LMoV、LSV和CMV的LAMP現場可視化快速檢測試劑盒。而IC-RT-LAMP技術則將LAMP技術和IC-RT-PCR技術結合，用于檢測LSV和CMV。

另外，王進忠等根據LMoV、LSV和CMV的核酸序列設計引物和探針，制備了基因芯片同時檢測這3種病毒。袁志豪等從百合病株葉片提取RNA，進行高通量轉錄組測序，經序列分析發(fā)現了LMoV、LSV和CMV等8種病毒的序列，之后設計每種病毒的特異性引物，用RT-PCR檢測驗證轉錄組測序檢測病毒的結果。

2.4百合線蟲病和主要病原線蟲

全國各地口岸截獲線蟲最多的植物是百合種球。截獲的植物線蟲主要隸屬于滑刃屬、真滑刃屬Aphelenchus和短體屬。

短體線蟲為害嚴重，主要侵染百合根和鱗莖，侵染點處產生深褐色枯斑，鱗莖病部會成水漬狀、腐爛，植株地上部發(fā)病初期局部葉片過早黃化，被害植株嚴重矮化，開花少且小。線蟲產生的傷口易使植物遭受病原真菌和細菌侵染，加速植物組織腐爛。

草莓滑刃線蟲Aphelenchoides fragariae是一種專性內外寄生線蟲，寄主植物多樣，分布范圍廣，主要靠種球、帶芽苗木、接穗等無性繁殖材料傳播，主要危害植物地上部分的腋芽、嫩葉和花序，病株矮化，枝弱葉稀，葉片畸形皺褶，頂芽凋枯，花少且畸形。草莓滑刃線蟲為害百合引起百合黑死病，其取食地上部生長點，使新梢皺縮扭曲，不能開花，導致葉片從莖基部自下而上枯死。

3郁金香和百合病害病原檢測鑒定方法的問題和展望

郁金香和百合病害病原中有些是中國進境植物檢疫性有害生物，植物病原細菌中有郁金香黃色皰斑病菌、菊迪基氏菌、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌蔥生致病變種；植物病毒中有南芥菜花葉病毒（arabismosaic virus）、草莓潛隱環(huán)斑病毒（strawberrylatent ringspot virus）和番茄環(huán)斑病毒（tomatoringspot virus）；植物病原線蟲中有毛刺屬線蟲、擬毛刺屬線蟲、草莓滑刃線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲Dit：ylenchus destructor和鱗球莖莖線蟲D．dipsaci。這些檢疫性植物病毒和病原線蟲主要從進境的郁金香和百合種球中截獲。另外，郁金香和百合的主要病原真菌鐮刀菌、灰霉、炭疽菌危害大、擴散性強，在國內各產區(qū)間流行的風險高，有必要針對這些真菌加強對產區(qū)間調運種球的檢疫。

建立方便、快速、準確和靈敏的病原檢測鑒定方法，通過檢疫從源頭上防止病原隨進口種球種苗傳人國內和在國內各產區(qū)擴散，是防控郁金香和百合病害的最有效手段。本文所述的郁金香和百合病害的細菌、真菌和卵菌病原鑒定都用了傳統(tǒng)的形態(tài)學、生物學和致病性測定，其中，多數研究僅用了傳統(tǒng)鑒定方法，少數病原真菌的鑒定結合了核糖體RNA基因內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列的分析。僅用傳統(tǒng)方法將病原鑒定到種的結論可靠性低。如，果膠桿菌屬的多種細菌寄主廣泛，不同種的菌株能侵染同種植物，產生相似的軟腐病癥，僅靠形態(tài)、生理生化和致病性狀，不足以確定郁金香軟腐病的病原是胡蘿卜果膠桿菌。同樣，對于真菌形態(tài)和癥狀相似的真菌病害和一些形態(tài)、生理生化特征隨環(huán)境條件變化而變化的植物病原真菌，傳統(tǒng)的鑒定方法難以鑒定到種。ITS序列呈現的真菌種間變異性和種內穩(wěn)定性，為病原真菌的分子診斷提供了靶序列。針對ITS的PCR擴增、測序和序列分析能區(qū)別鑒定引起郁金香青霉病和灰霉病、百合灰霉病和炭疽病及百合疫病等病害的同屬不同種的病原真菌和卵菌。但是，ITS序列用于鐮刀菌的系統(tǒng)發(fā)育和物種鑒定的分辨率不高，只能將鐮刀菌鑒定到復合種（species com-plex），如尖孢鐮刀菌復合種Fusariurn oxysporurncomplex和藤倉鐮刀菌復合種。翻譯延伸因子基因序列用于鐮刀菌的系統(tǒng)發(fā)育和物種鑒定的分辨率比ITS序列高很多。因此，包括TEF-1a的多基因序列分析能準確鑒定鐮刀菌等病原真菌。在ITS、TEF-1a、RPB1和RPB2（編碼DNA指導的RNA聚合酶亞基1和2）等序列分析的基礎上，發(fā)展利用標準DNA片段對物種進行自動化鑒定的DNA條形碼技術，能彌補傳統(tǒng)分類鑒定方法在鑒定真菌病害病原中的不足。

準確地鑒定病原線蟲物種也需要結合傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察測量和現代分子生物學檢測方法。線蟲的ITS序列也呈現了線蟲種間的變異性和種內穩(wěn)定性，用ITS通用引物擴增目標線蟲ITS序列，構建ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定目標線蟲在屬內的系統(tǒng)發(fā)育地位；進一步可設計種特異的ITS引物和探針，建立鑒別目標線蟲的PCR診斷方法，如王猻等設計了鱗球莖莖線蟲特異TaqMan探針，建立了實時熒光PCR檢測鱗球莖莖線蟲的方法；王晨等構建了基于ITS序列的滑刃屬線蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹，并用種特異性引物擴增ITS序列，診斷目標線蟲為草莓滑刃線蟲。

傳統(tǒng)分類鑒定病原的方法檢測項目多、步驟多、周期長，不能滿足快速檢疫和基層現場檢測的需求。qPCR和LAMP等分子檢測技術快速、靈敏、通量高，檢測效率依賴靶基因的分辨率和引物的特異性。測序技術的更新?lián)Q代讓病原微生物的全基因組序列呈幾何級數增長，大規(guī)模比較基因組學分析能評估近緣物種共有序列的分辨率和發(fā)現區(qū)別近緣物種的標志基因。例如，最近的基因組學研究揭示，目前C．flaccu-faciens是包括多個種的復合種，其16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列的分辨率不足以區(qū)分C．flaccumfaciens復合種內的致病變種，此前依此建立的檢測郁金香黃色皰斑病菌的qPCR方法的特異性還需更細致的檢驗。又如，比較基因組學分析發(fā)現FusariumOxysporumcomplex內各種菌的特有效應子基因，進而針對性地設計特異引物，采用PCR鑒別該復合種中的近緣物種。

相對于病原真菌、細菌和線蟲，危害郁金香和百合的主要病毒的檢測方法更為豐富。傳統(tǒng)的生物學方法檢測病毒致病性，電子顯微技術觀測病毒形態(tài)；免疫學方法以ELISA和免疫膠體金試紙條為主，需要特異的高效價抗血清或抗體。ELISA法檢測靈敏度較高但操作復雜；免疫膠體金試紙條操作簡便適合現場檢測，但靈敏度較低，不適合檢測早期無癥狀階段含量較低的病毒。侵染郁金香和百合的主要病毒均為RNA病毒，RT-PCR檢測RNA病毒的難點在于從植物組織提取RNA，提取過程中的RNA降解和逆轉錄體系中的RNA酶污染，都會導致檢測假陰性。LAMP技術操作簡單，快速直觀，特異性強、靈敏度高、成本低，可實現病毒的田間診斷，但對引物要求高，一般用于單病毒檢測。在RT-PCR技術上發(fā)展起來的RT-qPCR、多重RT-PCR和IC-RT-PCR，以及將RT-PCR技術和LAMP技術結合的RT-LAMP技術，相較于傳統(tǒng)的RT-PCR技術，檢測效率都有提升。同時，新的高效檢測技術推陳出新，如重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA），數字PCR（digital PCR）和基于CRISPR/Cas系統(tǒng)（CRISPR： clustered regularly in-terspaced short palindromic repeat，規(guī)律間隔成簇短回文重復序列；Cas： CRISPR-associated protein，CRISPR相關蛋白）的檢測技術。將這些技術應用到郁金香和百合主要病毒的檢測檢疫中，將為防控郁金香和百合病毒病提供可靠高效的技術支持。