從多倍體鯽遺傳育種實(shí)踐談現(xiàn)代水產(chǎn)育種與水產(chǎn)種業(yè)發(fā)展＊

桂建芳

(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，中國(guó)科學(xué)院水產(chǎn)品種創(chuàng)制與高效養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，種子創(chuàng)新研究院，湖北 武漢 430072)

作為1977 年恢復(fù)高考后的第一批大學(xué)生，伴著科學(xué)的春天和改革開(kāi)放的腳步，我于1978 年3月進(jìn)入武漢大學(xué)生物系；1982 年考取研究生，師從武漢大學(xué)遺傳學(xué)導(dǎo)師余先覺(jué)教授和周暾教授專(zhuān)攻魚(yú)類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)。在分析了30 多種淡水魚(yú)的染色體組型后，發(fā)現(xiàn)一般魚(yú)類(lèi)為50 或48 條染色體，而銀鯽有150 多條染色體，是奇特的多倍體，我極感興趣，頓萌探索之心；畢業(yè)論文答辯時(shí)承蒙導(dǎo)師有意安排已在銀鯽育種取得突破性成就的中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所蔣一珪先生作為答辯委員，因而得到蔣一珪先生的贊許，力邀加入水生生物研究所，從此結(jié)緣銀鯽，結(jié)緣水產(chǎn)遺傳育種。

銀鯽是一種尋常的淡水魚(yú)類(lèi)，但有三個(gè)奇特的生物學(xué)特性。第一是能進(jìn)行單性雌核生殖，可產(chǎn)生全雌后代[1]；第二是其天然種群中不僅存在少量雄性，且從北向南雄魚(yú)比例還有增加趨勢(shì)[2-3]；第三是高倍性的多倍體，經(jīng)歷了額外的兩次基因組加倍[4-6]。諸多奇特之處隱藏的科學(xué)問(wèn)題也多，激發(fā)了我們迎難而上，執(zhí)著拓新的科研之心。

自20 世紀(jì)70 年代以來(lái)的近50 年中，水生生物研究所經(jīng)三代人的不斷努力，解析了鯽(Carassius auratus)復(fù)合種特殊的生殖、性別、生態(tài)適應(yīng)性等基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題，利用銀鯽單性雌核生殖等多重生殖方式的潛能，培育出了異育銀鯽(C.gibelio)[1]、高體型異育銀鯽[7]、異育銀鯽“中科3 號(hào)”[8]、長(zhǎng)豐鯽[9]和異育銀鯽“中科5 號(hào)”[10-11]系列新品種，形成了水產(chǎn)種業(yè)的創(chuàng)新鏈和價(jià)值鏈，特別是異育銀鯽“中科3 號(hào)”和“中科5 號(hào)”已成為近10 多年來(lái)的主養(yǎng)品種，帶動(dòng)了鯽產(chǎn)量的快速提升，在產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮了重大作用，為中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖做出了貢獻(xiàn)[8,12-14]?？梢哉f(shuō)，水生生物研究所三代人近50 年聚焦銀鯽遺傳與發(fā)育基礎(chǔ)和異育銀鯽新品種培育及其種業(yè)發(fā)展，架起了從基礎(chǔ)研究到產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的橋梁。

1 基因組時(shí)代對(duì)水產(chǎn)育種生物技術(shù)發(fā)展的再思考

2018 年，在唐啟升院士、李鐘杰研究員、劉家壽研究員和Sena S.De Silva 先生的共同努力下，我們出版了《中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖-成功的故事和現(xiàn)代趨勢(shì)》(Aquaculture in China: Success Stories and Modern Trends)[15]。該書(shū)綜合了水產(chǎn)遺傳育種學(xué)、種質(zhì)資源學(xué)和養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)等多學(xué)科優(yōu)勢(shì)，系統(tǒng)梳理了中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖成功的典型故事，被國(guó)內(nèi)外同行譽(yù)為新時(shí)代的水產(chǎn)養(yǎng)殖專(zhuān)著，向世界展示了中國(guó)這個(gè)卓越水產(chǎn)養(yǎng)殖超級(jí)大國(guó)的主要活力[16-18]。

近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖在保障全球食品安全中的作用再次引發(fā)了世界的高度關(guān)注。最新研究表明，生產(chǎn)單位水產(chǎn)品所排出的溫室氣體和所占用的土地，遠(yuǎn)少于家畜和家禽生產(chǎn)，是一種低碳排放、環(huán)境友好的動(dòng)物蛋白生產(chǎn)方式[19-20]。且水產(chǎn)品作為“藍(lán)色食品”可以提供人類(lèi)賴(lài)以生存而自身難以合成的營(yíng)養(yǎng)元素，可提升國(guó)民營(yíng)養(yǎng)健康水平[21]。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖已被普遍認(rèn)為有保障全球糧食安全、減少營(yíng)養(yǎng)不良的作用，是綠色可持續(xù)發(fā)展的生產(chǎn)方式[13]，到2050 年，人類(lèi)對(duì)于魚(yú)類(lèi)等水產(chǎn)品的需求可能會(huì)再翻一番[22]。

伴隨著基因組時(shí)代和后基因組時(shí)代的到來(lái)，國(guó)際上已孕育出一批新生代的遺傳育種專(zhuān)家，如何駕馭基因組學(xué)進(jìn)入水產(chǎn)養(yǎng)殖遺傳改良的快車(chē)道已成熱點(diǎn)[23-27]?；谶@一發(fā)展趨勢(shì)，2022 年我們發(fā)表了《在基因組資源快速增長(zhǎng)和糧食安全日益強(qiáng)化的挑戰(zhàn)時(shí)代魚(yú)類(lèi)生物學(xué)和生物技術(shù)再思考》，文中以1/3 的篇幅描述了魚(yú)類(lèi)及其他水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種及其種業(yè)的發(fā)展藍(lán)圖[28]。實(shí)際上，我國(guó)水產(chǎn)遺傳育種及其種業(yè)的發(fā)展主要經(jīng)歷了3 個(gè)階段，第一個(gè)階段是傳統(tǒng)育種階段，對(duì)應(yīng)作物育種的1.0 時(shí)代選擇育種和2.0 時(shí)代雜交育種。在這一時(shí)期，育種學(xué)家們主要是收集和發(fā)掘足夠的和優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源，通過(guò)群體或家系選育，或者進(jìn)行種內(nèi)或種間雜交，從而得到優(yōu)良品種。第二個(gè)階段是表型與基因型因果關(guān)系鑒定的遺傳改良育種階段，對(duì)應(yīng)作物育種中的3.0 時(shí)代。其主要是通過(guò)表型(如顏色、性別大小和生長(zhǎng)) 和基因型(如微衛(wèi)星、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、QTL 和全基因組)來(lái)鑒定與目標(biāo)性狀相對(duì)應(yīng)的遺傳標(biāo)記或優(yōu)勢(shì)基因(或等位基因)，由此發(fā)展出分子標(biāo)記輔助的選擇育種和基于全基因組分型的選擇育種。第三個(gè)階段是精準(zhǔn)育種階段，對(duì)應(yīng)作物育種中的4.0時(shí)代。近5 年來(lái)，遺傳和發(fā)育的基礎(chǔ)研究已取得了大量的重要突破，由此發(fā)展起來(lái)一批有重大潛力的精準(zhǔn)育種技術(shù)路徑?；谶@些突破進(jìn)展，我們總結(jié)出了魚(yú)類(lèi)精準(zhǔn)育種的5 條生物技術(shù)路徑，如基于基因編輯技術(shù)路徑導(dǎo)入有益基因或移除不利基因、基于性別特異標(biāo)記技術(shù)路徑培育單性群體、基于可控原始生殖細(xì)胞開(kāi)關(guān)技術(shù)路徑生產(chǎn)不育子代、基于借腹懷胎技術(shù)路徑提升育種效率、基于基因組整合及有性生殖重獲路徑創(chuàng)制基因組重構(gòu)的合成多倍體[28]。

2 育種生物技術(shù)新突破為水產(chǎn)新品種的精準(zhǔn)定制提供可能

充分解析物種的遺傳背景和生物學(xué)特性是培育重大突破品種的前提[13,28-29]。為了進(jìn)行精準(zhǔn)育種，我們團(tuán)隊(duì)前后耗費(fèi)10 多年時(shí)間比較解析了100 條染色體的鯽和150 多條染色體的銀鯽的基因組[5]，不僅揭示了鯽和銀鯽的演化機(jī)制，而且發(fā)現(xiàn)鯽是雙二倍體，銀鯽是雙三倍體，為其精準(zhǔn)育種提供了理論和技術(shù)支撐。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)拓出針對(duì)性強(qiáng)的育種生物技術(shù)，取得了5 個(gè)精準(zhǔn)育種的新突破。

2.1 基因編輯技術(shù)創(chuàng)制無(wú)肌間刺銀鯽突變體

在銀鯽基因組解析和成熟基因編輯技術(shù)建立的基礎(chǔ)上，我們開(kāi)始關(guān)注鯽給食用者帶來(lái)不少麻煩的肌間刺。在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)高澤霞教授團(tuán)隊(duì)從斑馬魚(yú)(Danio rerio)中鑒定出調(diào)控肌間刺發(fā)育的關(guān)鍵基因runx2b[30]的基礎(chǔ)上，我們與高澤霞教授合作，在銀鯽中發(fā)現(xiàn)有runx2b2 個(gè)部分同源基因runx2b-A或runx2b-B及其6 個(gè)等位基因。研究發(fā)現(xiàn)，在銀鯽中單獨(dú)敲除runx2b-A或runx2b-B不影響肌間刺發(fā)育和形成，只有同時(shí)敲除runx2b-A和runx2b-B這2 個(gè)部分同源基因及其6 個(gè)等位基因，才能創(chuàng)制出無(wú)肌間刺的銀鯽突變體[31-32]。該研究為在雙三倍體銀鯽中培育無(wú)肌間刺異育銀鯽新品種奠定了基礎(chǔ)，是基因編輯技術(shù)剔除不利基因的功能創(chuàng)制更優(yōu)水產(chǎn)新品種的范例，其應(yīng)用潛力很大。

2.2 基因組重構(gòu)技術(shù)合成銀鯽新多倍體

回顧1980 年代，我們發(fā)現(xiàn)整入含有鯉(Cyprinus carpio)基因組少數(shù)高倍性個(gè)體[33]的基礎(chǔ)上，將鯽精子替代鯉精子，獲得了批量的整入有鯽雙單倍體基因組的雙四倍體，發(fā)現(xiàn)雙四倍體形成時(shí)重新獲得了性染色體系統(tǒng)與有性生殖能力[34]。我們將恢復(fù)了有性生殖的雙四倍體雄魚(yú)與雙二倍體鯽雌魚(yú)回交獲得了新雙三倍體群體(NA3n)，新雙三倍體具有高度的遺傳多樣性，進(jìn)而通過(guò)基因組重測(cè)序和染色體分型來(lái)辨別新雙三倍體的染色體來(lái)源?；蚪M重測(cè)序和染色體分型揭示新雙三倍體群體中存在著大量基因組變化，包括銀鯽和鯽同源染色體間的重組，以及非同源染色體間的自由組合，這些變化導(dǎo)致新雙三倍體群體具有高度的基因組多樣性。之后通過(guò)探究新雙三倍體的育性、性別決定系統(tǒng)、卵母細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞學(xué)過(guò)程以及卵子的受精行為，發(fā)現(xiàn)新雙三倍體群體中約80%的雌魚(yú)恢復(fù)了單性雌核生殖能力。有趣的是，新三倍體產(chǎn)生了兩類(lèi)不同發(fā)育命運(yùn)的卵母細(xì)胞。Ⅰ型卵母細(xì)胞先產(chǎn)生，但由于其3 條同源染色體無(wú)法同時(shí)聯(lián)會(huì)以及未聯(lián)會(huì)染色體上的DNA 雙鏈斷裂無(wú)法修復(fù)，從而發(fā)生凋亡；而后產(chǎn)生的Ⅱ型卵母細(xì)胞與銀鯽的一樣，意味著新雙三倍體采用與銀鯽相同的無(wú)減數(shù)分裂途徑形成未減數(shù)的卵子。為從表型上觀察到差異，選擇一尾透明彩鯽與雙四倍體交配，產(chǎn)生的雙三倍體在體色、鱗式、體型和大小上顯示出明顯差異。隨機(jī)選一尾進(jìn)行連續(xù)兩代雌核生殖，產(chǎn)生了形態(tài)和遺傳一致的雌核生殖雙三倍體和克隆雙三倍體。以上結(jié)果表明，倍性變化，包括從雙三倍體到雙四倍體，然后從雙四倍體到新雙三倍體，驅(qū)動(dòng)了從單性到有性和從有性到單性的生殖轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致了多倍體鯽復(fù)合種的遺傳和克隆多樣性[35]。這些發(fā)現(xiàn)揭示出單性動(dòng)物產(chǎn)生大量克隆系的有效策略，由此可避免基因組衰退、增加進(jìn)化潛力，回答了其如何獲得遺傳多樣性這一長(zhǎng)期困擾進(jìn)化遺傳學(xué)家的難題，拓寬了我們對(duì)單性物種遺傳多樣性起源和保持的理解?；谶@些發(fā)現(xiàn)，開(kāi)拓出由倍性改變及生殖方式轉(zhuǎn)換創(chuàng)制基因組重構(gòu)的合成多倍體新技術(shù)。

2.3 無(wú)減數(shù)融合生殖方式的發(fā)現(xiàn)與不育異源多倍體的高效合成

在上述研究的基礎(chǔ)上，我們還發(fā)現(xiàn)少數(shù)新雙三倍體雌性獲得了一種定義為“無(wú)減數(shù)融合生殖”的獨(dú)特生殖方式，這種方式不僅從雌核生殖銀鯽遺傳了無(wú)減數(shù)分裂產(chǎn)生不減數(shù)卵子的能力，還從有性生殖鯽遺傳了卵核與精核融合形成受精卵的能力。將這種新雙三倍體與二倍體團(tuán)頭魴進(jìn)行交配，直接創(chuàng)制了一個(gè)合成的異源七倍體群體，它們含有來(lái)自其母本新雙三倍體鯽的全套染色體組和來(lái)自父本二倍體團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)的一套染色體組。之后追蹤了異源七倍體生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中的染色體行為，揭示了它們的不育機(jī)制：在減數(shù)分裂前期Ⅰ，染色體聯(lián)會(huì)異常以及DNA 雙鏈斷裂無(wú)法被完全修復(fù)，導(dǎo)致初級(jí)卵母細(xì)胞嚴(yán)重凋亡。有意思的是，當(dāng)用UV 輻射的鯉精子來(lái)激活上述新雙三倍體的卵子，其產(chǎn)生的后代沒(méi)有整入精子的基因組，由此建立了一個(gè)可持續(xù)的具有無(wú)減數(shù)融合生殖能力的新雙三倍體克隆系。將這個(gè)可持續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)無(wú)減數(shù)融合生殖能力的新雙三倍體克隆系與不同鯉科(Cyprinidae)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行交配，可快速創(chuàng)制合成出多種不育的異源多倍體群體[36]。這一研究的重要意義不僅是發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的無(wú)減數(shù)融合生殖方式，而且創(chuàng)建了一條合成不育異源多倍體的高效路徑[36]。

2.4 育性可控的合成異源多倍體

基于高效合成不育異源多倍體的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合基因編輯，我們還創(chuàng)建了一條育性可控的合成異源多倍體的路徑。通過(guò)基因編輯技術(shù)在“無(wú)減數(shù)融合”生殖能力的新雙三倍體克隆系(A+/+/+B+/+/+)中敲除銀鯽部分同源基因及其等位基因，獲得帶有理想性狀的目標(biāo)基因突變體(A-/-/-B-/-/-)，突變體繼續(xù)通過(guò)滅活精子刺激進(jìn)行雌核生殖擴(kuò)群；同時(shí)，在另一鯉科魚(yú)類(lèi)中構(gòu)建目標(biāo)基因編輯的突變體(X-X-)；二者交配可大批量產(chǎn)生目標(biāo)基因敲除的不育七倍體突變體(A-/-B-/X-)。這種育性可控的合成路徑產(chǎn)生的不育異源多倍體不僅可避免其養(yǎng)殖過(guò)程中逃逸的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，而且有利于種業(yè)經(jīng)營(yíng)者的品種權(quán)益保護(hù)。

2.5 金魚(yú)表型因果基因鑒定再造更優(yōu)更美金魚(yú)

金魚(yú)是我國(guó)發(fā)現(xiàn)、馴養(yǎng)、選育、世界知名的第一類(lèi)觀賞魚(yú)，擁有眼睛、頭瘤、鱗片、體型、鰭條等多種表型突變的300 多個(gè)品種，實(shí)質(zhì)上是基因突變經(jīng)人工選育的結(jié)果。導(dǎo)致這些眾多觀賞性狀的因果基因可否鑒定、其性狀可否再造一直是魚(yú)類(lèi)遺傳學(xué)家關(guān)注的重要科學(xué)問(wèn)題[14,28,37]。

為此，我們團(tuán)隊(duì)建立了基于高效繁育+基因編輯+人工雌核生殖+溫控性反轉(zhuǎn)的金魚(yú)精準(zhǔn)育種技術(shù)，極大地縮短了金魚(yú)繁育時(shí)間，其中產(chǎn)卵次數(shù)最多的金魚(yú)獲得了福布斯世界紀(jì)錄。首先，我們揭示金魚(yú)龍睛性狀與脂質(zhì)代謝異常有關(guān)[38]，先后鑒定出龍睛和白化兩個(gè)性狀的因果基因[39]；通過(guò)編輯龍睛和白化性狀的因果基因lrp2aB和oca2，快速再造出適合側(cè)視觀賞的龍睛百褶裙獅子頭金魚(yú)“龍獅”、金色紅眼百褶裙獅子頭金魚(yú)“金兔”、碧玉紅眼百褶裙獅子頭金魚(yú)“玉兔”、以及“金獅”和“虎紋”等10 多個(gè)金魚(yú)新品系[39]。

3 現(xiàn)代水產(chǎn)育種與水產(chǎn)種業(yè)發(fā)展展望

以上5 個(gè)突破僅僅是近年來(lái)水產(chǎn)精準(zhǔn)育種的滄海一粟，實(shí)際上中國(guó)和世界的很多實(shí)驗(yàn)室都取得了重大進(jìn)步，期待未來(lái)幾年水產(chǎn)育種能象主糧作物一樣，產(chǎn)出更精準(zhǔn)的技術(shù)和更優(yōu)的品種。

從1991—2022 年，中國(guó)已通過(guò)國(guó)家審定的水產(chǎn)新品種共283 個(gè)，其中自主選育品種253 個(gè)。未來(lái)水產(chǎn)遺傳育種一是要針對(duì)消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)不飽和脂肪酸含量高、生長(zhǎng)速率快、宜加工的重大需求，培育具有高不飽和脂肪酸、無(wú)肌間刺、生長(zhǎng)快、耐低氧等性狀的水產(chǎn)養(yǎng)殖新品種，滿(mǎn)足人們對(duì)優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品的需求；二是針對(duì)集約化、設(shè)施化養(yǎng)殖等新型技術(shù)模式和高質(zhì)量發(fā)展的迫切需求，發(fā)掘出適合高密度和育性可控的優(yōu)異種質(zhì)和基因資源，創(chuàng)建并集成全基因組選擇、基因編輯、基因組重構(gòu)、性別與育性可控、生殖干細(xì)胞移植等種質(zhì)創(chuàng)制與新品種培育的精準(zhǔn)生物技術(shù)，解析主養(yǎng)魚(yú)類(lèi)適應(yīng)高密度養(yǎng)殖、雌雄生長(zhǎng)差異的分子機(jī)制，培育適應(yīng)集約化養(yǎng)殖的高產(chǎn)新品種，為工廠(chǎng)化等現(xiàn)代養(yǎng)殖模式提供優(yōu)異新品種，推動(dòng)水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖高質(zhì)量發(fā)展；三是針對(duì)主要大宗魚(yú)類(lèi)如草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)和鯽等出血病等重大疫病頻發(fā)、亟需高抗新品種的迫切需求，建立抗病等性能評(píng)價(jià)技術(shù)體系，集成傳統(tǒng)育種和現(xiàn)代精準(zhǔn)育種技術(shù)，培育抗病、抗逆、成活率高的新品種，進(jìn)一步提高大宗養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的良種覆蓋率。

2021 年，我與周莉、殷戰(zhàn)、胡煒、童金茍、孫永華、肖武漢共7 位研究員共同編著的《水產(chǎn)遺傳育種學(xué)》，不僅是我個(gè)人從多倍體鯽育種實(shí)踐中的深切感悟，更是綜合了魚(yú)、蝦、貝、蟹、參、藻等水產(chǎn)新品種培育過(guò)程中眾多專(zhuān)家的智慧[40]。當(dāng)前世界范圍內(nèi)已進(jìn)入“生物技術(shù)+人工智能+大數(shù)據(jù)”為特征的分子設(shè)計(jì)或精準(zhǔn)育種時(shí)代，可進(jìn)一步加快水產(chǎn)生物的遺傳改良[23-25,27-28]。因此，在魚(yú)類(lèi)和其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中進(jìn)行多組學(xué)研究和開(kāi)發(fā)更為精準(zhǔn)的遺傳方法，并能夠設(shè)計(jì)創(chuàng)建更精準(zhǔn)的育種技術(shù)體系將是未來(lái)重要的發(fā)展方向[13,28]。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）