水溶性近紅外染料泊洛沙姆-IR780的制備與表征

郭立強(qiáng)，朱志杰，陳思銘，張宇翾

（江蘇工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南通 226007）

近紅外染料已逐漸由傳統(tǒng)的印染行業(yè)向光記錄系統(tǒng)、熱寫顯示系統(tǒng)、激光過濾、激光印刷和紅外攝影、腫瘤成像和靶向治療等領(lǐng)域延伸[1-3]，因其穿透能力強(qiáng)，激發(fā)波長(zhǎng)一般在700～1000 nm之間，在深部組織很容易被檢測(cè)到熒光強(qiáng)度，因此在腫瘤成像和靶向治療領(lǐng)域具有特殊優(yōu)勢(shì)。作為近紅外染料中的一種，IR780碘化物具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度、光穩(wěn)定性和生物安全性，又可選擇性地被靶向輸送至腫瘤的線粒體中，在近紅外激光的照射下，產(chǎn)生大量的活性氧類和高熱，從而殺傷腫瘤細(xì)胞[4]，因此在醫(yī)學(xué)腫瘤成像和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。IR 780碘化物是美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局( FDA) 已批準(zhǔn)可用于臨床的重要的近紅外熒光染料，但因存在疏水性較強(qiáng)、耐受性差、體內(nèi)毒性大等缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用受到了明顯限制。

聚氧乙烯-氧丙烯嵌段共聚物（泊洛沙姆）是獲得美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)認(rèn)證的、可以在人體使用的聚合物。該聚合物含有雙親性結(jié)構(gòu)，在水中有較好的溶解能力，調(diào)節(jié)該聚合物的濃度，可以改變其在水溶液中的存在方式。當(dāng)濃度＜臨界膠束濃度(CMC)時(shí)，會(huì)以單個(gè)大分子的形式分散；當(dāng)濃度≥臨界膠束濃度(CMC)、溫度低于凝膠溫度時(shí)，以膠束形式存在；溫度升高至凝膠溫度，則以半固體的凝膠狀態(tài)存在；繼續(xù)升高至溶膠溫度，又會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∫篬5]。另外，隨著泊洛沙姆的種類、濃度發(fā)生變化，其凝膠溫度、儲(chǔ)能模量也會(huì)發(fā)生變化，這為今后可選用化療藥與高分子近紅外染料聯(lián)合給藥體系的開發(fā)提供了一種選擇，同時(shí)也為原位凝膠劑型的開發(fā)提供了一種新的思路。

1 泊洛沙姆-IR-780的合成

1.1 主要原料

泊洛沙姆(Poloxamer F127，藥用級(jí))、N,N’-羰基二咪唑(CDI)、IR780碘化物、乙二胺、三乙胺(化學(xué)純)、乙腈、氮氮二甲基甲酰胺等。

1.2 合成工藝

1.2.1 泊洛沙姆（Poloxamer F127）的純化

在4℃下，將一定質(zhì)量的Poloxamer F127加入丙酮中，經(jīng)約2h的充分溶脹、溶解，得到質(zhì)量濃度為4g·mL-1的溶液，將其緩慢加入過冷己烷中沉淀，離心分離，純化后的Poloxamer F127產(chǎn)品在25～37℃下真空干燥。

1.2.2 泊洛沙姆-羰基二咪唑（Poloxamer-CDI）的合成[6]

將純化后的0.1mmol的Poloxamer F127溶于干燥的40mL乙腈中配制成溶液，用氮?dú)庵脫Q3次。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在4h內(nèi)逐滴加入含5mmol 的N,N-羰基二咪唑的乙腈溶液40mL，常溫下繼續(xù)攪拌4h。充分反應(yīng)后，反應(yīng)液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10～15mL，加入4倍的乙醚純化，以去除未反應(yīng)的N,N-羰基二咪唑，重復(fù)3次。25～37℃下真空干燥，收集Poloxamer-CDI白色粉末，送樣分析檢測(cè)。

1.2.3 泊洛沙姆的氨基化(F127-NH2)[7]

以1.2.2的產(chǎn)物為起始原料，乙二胺為氨基化試劑，進(jìn)行氨基化反應(yīng)。將0.1mmol的Poloxamer-CDI溶解在50mL無水乙腈中，在室溫、磁力攪拌下，3～5h內(nèi)滴加10～35mL二元胺。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)12～24h，旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾，除去未反應(yīng)的二元胺。在濃縮液中加入4～10倍的乙醚純化，重復(fù)3次，25～37℃下真空干燥，收集Fm-NH2白色粉末，送樣分析。

1.2.4 泊洛沙姆-IR780 (Fm-NH-IR780)的合成

以1.2.3的產(chǎn)物Fm-NH2和IR 780為起始原料，三乙胺為催化劑，無水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑，進(jìn)行取代反應(yīng)。在磁力攪拌下，將0.05mmol的Fm-NH2分散于一定體積的DMF中，充分溶脹、分散后，得到50～200mg·mL-1的溶液。滴入適量的三乙胺，混合20min后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入0.1～0.2mmol的IR780，20～60℃下避光反應(yīng)，用硅膠板檢測(cè)，確定反應(yīng)終點(diǎn)。真空旋蒸蒸出絕大部分溶劑后，加入20～60mL的二氯甲烷溶解，在磁力攪拌下，緩慢加入4～10倍的無水乙醚，離心沉淀，重復(fù)洗滌3次，25～37℃下真空干燥，收集Fm-NH-IR780藍(lán)黑色粉末。

2 結(jié)果與討論

2.1 沉淀劑己烷用量對(duì)泊洛沙姆純化收率的影響

在泊洛沙姆的純化過程中，將4g·mL-1泊洛沙姆的丙酮溶液緩慢加入過冷己烷中，探究沉淀劑己烷的用量對(duì)純化收率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 己烷用量對(duì)泊洛沙姆收率的影響

當(dāng)己烷用量與丙酮的體積比較小時(shí)，泊洛沙姆在己烷中不易分散，形成結(jié)塊，從而影響泊洛沙姆的雜質(zhì)含量和收率。隨著己烷與丙酮的體積比增加，純化收率不斷提高，體積比為4時(shí)，收率達(dá)到95%左右；體積比繼續(xù)增加，泊洛沙姆的損失率增加，收率降低。因此確定己烷與丙酮的體積比為3～4較合適。

2.2 泊洛沙姆-羰基二咪唑中間體的表征

圖2是泊洛沙姆-羰基二咪唑中間體的紅外光譜圖，圖3是泊洛沙姆-羰基二咪唑中間體的氫譜圖。由圖2可知，1764.6 cm-1處有中等吸收峰，1112.8cm-1處有強(qiáng)吸收峰，可以初步判斷產(chǎn)生上述吸收峰的泊洛沙姆與羰基二咪唑反應(yīng)后形成了羰基吸收峰。在圖3的氫譜中，δ在7×10-6～8×10-6范圍內(nèi)出現(xiàn)2個(gè)氫原子吸收峰，在8×10-6～9×10-6范圍內(nèi)出現(xiàn)了1個(gè)氫原子吸收峰，說明該樣品的分子結(jié)構(gòu)中含有咪唑的雜環(huán)結(jié)構(gòu)；δ在1×10-6～2×10-6范圍內(nèi)出現(xiàn)了氫原子吸收峰，說明樣品分子結(jié)構(gòu)中有大量的亞甲基存在，表明樣品結(jié)構(gòu)中存在泊洛沙姆結(jié)構(gòu)，由此可知泊洛沙姆的結(jié)構(gòu)中，羥基與羰基二咪唑中的羰基發(fā)生了耦合反應(yīng)。

圖2 泊洛沙姆-羰基二咪唑中間體的紅外光譜圖

圖3 泊洛沙姆-羰基二咪唑中間體的氫譜圖

2.3 氨基化泊洛沙姆的中間體的表征

圖4是氨基化泊洛沙姆的中間體的紅外光譜圖，圖5是氨基化泊洛沙姆的中間體的氫譜圖。由圖4可知，1764.6cm-1處有中等吸收峰，1110.1cm-1處有強(qiáng)吸收峰，可以初步判斷在樣品的分子結(jié)構(gòu)中存在羰基。圖3的氫譜中，δ在7×10-6～ 8×10-6、8×10-6～9×10-6范圍出現(xiàn)的氫原子吸收峰，在圖5中消失了，說明該樣品的分子結(jié)構(gòu)中存在咪唑的雜環(huán)結(jié)構(gòu)；在δ=3×10-6附近出現(xiàn)了2個(gè)新的氫原子吸收峰，說明樣品分子結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)了乙二胺結(jié)構(gòu)，由此可知泊洛沙姆-羰基二咪唑中間體與乙二胺通過酰胺化反應(yīng)，形成了氨基化泊洛沙姆中間體。

圖4 氨基化泊洛沙姆的中間體的紅外光譜圖

圖5 氨基化泊洛沙姆的中間體的氫譜圖

2.4 泊洛沙姆-IR780 (F127-NH-IR780)的合成

2.4.1 催化劑用量對(duì)泊洛沙姆-IR780的反應(yīng)時(shí)間和IR780利用率的影響

在Fm-NH2用量為0.05mmol，IR780用量為0.150mmol（兩者摩爾比為1∶3），氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)溫度為40℃的條件下，改變催化劑用量，考察其對(duì)泊洛沙姆-IR780反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖6。采用硅膠板測(cè)定反應(yīng)終點(diǎn)，并記錄結(jié)束時(shí)間，經(jīng)純化分離得到紫黑色的泊洛沙姆-IR780產(chǎn)品。產(chǎn)品收率按式(1)進(jìn)行計(jì)算：

圖6 催化劑用量對(duì)泊洛沙姆-IR780反應(yīng)的影響

在實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，沒有其他堿存在的條件下，只使用上述2種偶聯(lián)試劑，該偶聯(lián)反應(yīng)不能發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，三乙胺可以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，催化劑用量為0.50～1.25mL時(shí)，隨著催化劑的用量增加，泊洛沙姆-IR780的反應(yīng)速度越快；催化劑用量超過1.25mL后，反應(yīng)速度的變化不大。催化劑用量為1.0mL時(shí)，IR780的利用率為76%。綜合考慮后確定催化劑用量為1.0mL時(shí)，合成效率較佳。

2.4.2 IR-780的用量及反應(yīng)溫度對(duì)泊洛沙姆-IR780合成的影響

在泊洛沙姆-IR780的合成中，近紅外熒光染料IR780的氯為活性部位，當(dāng)其與0.01 mmol的氨基化泊洛沙姆（F127-NH2）反應(yīng)時(shí)，IR780的用量和反應(yīng)溫度是影響該反應(yīng)的關(guān)鍵。針對(duì)這2個(gè)關(guān)鍵條件進(jìn)行了較為深入的考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 IR780用量和反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)率的影響

IR780用量過大時(shí)，副產(chǎn)物的比例非常大，難以進(jìn)行分離純化；IR780用量少時(shí)則反應(yīng)難以發(fā)生，原因可能是菁染料分子中氯的位阻較大，氨基泊洛沙姆的分子鏈較長(zhǎng)，因此難以進(jìn)行取代反應(yīng)。對(duì)條件進(jìn)行篩選后，最終確定IR780用量為3eq，此用量下可以順利制得目標(biāo)產(chǎn)物。

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度達(dá)到80℃時(shí)，副產(chǎn)物特別多，降溫至60℃，副產(chǎn)物有所減少，在60℃下反應(yīng)時(shí)，TLC 顯示仍有3個(gè)以上產(chǎn)物點(diǎn)生成。在20℃下進(jìn)行反應(yīng)，混合物的副反應(yīng)最少，但收率特別低，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間仍未能提高產(chǎn)率。反應(yīng)在40℃下進(jìn)行時(shí)，則能以76%的分離產(chǎn)率制得目標(biāo)產(chǎn)物。

2.5 泊洛沙姆-IR780 (F127-NH-IR780)的表征

2.5.1 泊洛沙姆-IR780的溶解性能

在溶解性能方面，合成的泊洛沙姆-IR780(Fm-NH-IR780)能夠迅速溶解于25mL純化水中，形成均一的溶液，再在磁力攪拌下加入25mL二氯甲烷，在4℃冰箱中靜置24h，結(jié)果見圖7。

圖7 氨泊洛沙姆-IR780(Fm-NH-IR780)

2.5.2 泊洛沙姆-IR780紫外吸收的表征

將泊洛沙姆-IR780和IR780配成一定濃度的溶液，用紫外分光光度計(jì)掃描最大吸收波長(zhǎng)。IR780的最大吸收波長(zhǎng)為781nm，泊洛沙姆-IR780的最大吸收波長(zhǎng)為624nm，最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移了110nm，與文獻(xiàn)報(bào)道的IR-780氨基化后最大吸收波長(zhǎng)會(huì)藍(lán)移的結(jié)果一致[8-9]。泊洛沙姆-IR780與IR780的最大吸收波長(zhǎng)的對(duì)比見圖8。

圖8 氨泊洛沙姆-IR780與IR780最大吸收波長(zhǎng)的對(duì)比

2.5.3 泊洛沙姆-IR780的譜圖表征

泊洛沙姆-IR780的紅外光譜圖見圖9，氫譜圖見圖10。由圖9可知，在1467.6cm-1、1530.cm-1處都出現(xiàn)了中等吸收峰，600 cm-1～900cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了多個(gè)指紋峰，可以推斷樣品分子中存在IR780分子中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)。在圖10的氫譜中，δ=8×10-6附近出現(xiàn)了2個(gè)較小的吸收峰，δ=3×10-6附近的氫原子吸收峰消失了，原因是與泊洛沙姆-IR780相比，苯環(huán)和雙鍵碳上的氫原子數(shù)量較少，吸收峰較小，由此可知合成了泊洛沙姆-IR780產(chǎn)品。

圖9 氨泊洛沙姆-IR780的紅外光譜圖

圖10 泊洛沙姆-IR780的氫譜圖

3 結(jié)論

1）以羰基二咪唑?yàn)榛罨瘎?，在泊洛沙姆的結(jié)構(gòu)中引入羰基結(jié)構(gòu)，再與乙二胺發(fā)生酰胺化反應(yīng)而引入氨基，利用IR780分子中的氯原子已被取代的性質(zhì)進(jìn)行取代反應(yīng)，成功合成了水溶性近紅外染料。

2）該水溶性高分子熒光材料是在低于50℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)下制備的，合成條件溫和，有利于實(shí)現(xiàn)較大規(guī)模的生產(chǎn)。

3）在IR780分子中引入雙親性的醫(yī)用材料泊洛沙姆，可在保持熒光、光熱性能的前提下，提高IR780的穩(wěn)定性，從而為IR780在醫(yī)學(xué)腫瘤影像診斷、光熱治療等領(lǐng)域的應(yīng)用提供新型的水溶性熒光材料。