質(zhì)子感知受體在骨代謝中的研究進展

李風波，孫曉雷，馬信龍

（天津市天津醫(yī)院骨科，天津 300211）

人體雖然動脈血pH 值接近中性，但局部組織會因灌注減少或糖酵解增加，出現(xiàn)局部酸中毒［1］。骨組織在生理或病理狀態(tài)下同樣會出現(xiàn)局部缺氧，H+增多，局部pH 值下降，從而影響骨代謝［2］。人體細胞膜存在可以感知細胞外H+特異性受體，能夠在酸性環(huán)境中被激活，影響胞內(nèi)相關(guān)信號通路，使細胞功能發(fā)生相應改變［3］。質(zhì)子感知受體廣泛參與人體多系統(tǒng)調(diào)節(jié)［4］。研究發(fā)現(xiàn)骨內(nèi)酸性環(huán)境通過質(zhì)子感知受體來影響骨代謝動態(tài)平衡，尤其是卵巢癌G 蛋白偶聯(lián)受體1 廣泛在骨細胞上表達，并參與調(diào)節(jié)破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成等［5，6］。因此，了解質(zhì)子感知受體在骨組織中的功能及相關(guān)機制對治療相關(guān)骨病有重要意義。本文就近年來質(zhì)子感知受體在骨代謝中的相關(guān)研究進行綜述。

1 質(zhì)子感知受體的分類及相關(guān)作用機制

G 蛋白偶聯(lián)受體是細胞膜表面可以與G 蛋白耦聯(lián)的受體，含有7 個跨膜區(qū)，是人體發(fā)現(xiàn)最大的蛋白質(zhì)超家族，可以調(diào)節(jié)多種生物學反應［7］。目前GPCRs 亞家族中發(fā)現(xiàn)有4 種質(zhì)子感知受體，包括卵巢癌G 蛋白偶聯(lián)受體1（ovarian cancer G protein-coupled receptor 1,OGR1）、G 蛋白偶聯(lián)受體4（G proteincoupled receptor 4,GPR4）、誘導細胞停滯于G2/M 期的G 蛋白偶聯(lián)受體（G2 accumulation,G2A）和T 細胞死亡偶聯(lián)基因8（T-cell death associated gene 8，TDAG8）。他們存在于細胞膜的表面，能夠被細胞外酸激活，進而與G 蛋白偶聯(lián)影響細胞內(nèi)下游相關(guān)信號通路，改變細胞的功能［8～10］。

這4 種質(zhì)子感知受體都可以感知細胞外質(zhì)子的濃度變化，但相關(guān)機制不完全相同。在pH 值比較低的情況下，OGR1 受到細胞外質(zhì)子刺激后與Gq/11 蛋白偶聯(lián)，激活磷脂酶C（PLC）/Ca2+信號通路，引起細胞生物學變化［11］。而GPR4 和TDAG8 感知質(zhì)子后與Gs 蛋白偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶/cAMP 信號通路發(fā)揮作用［12，13］。TDAG8 感知質(zhì)子后與G12/13 蛋白偶聯(lián)，還可激活Rho 信號通路，導致相關(guān)生物學變化［14］。OGR1 和G2A 可誘導細胞內(nèi)肌醇磷酸（inositol phosphate,IP）增加，并且與質(zhì)子濃度成正相關(guān)，G2A 還可以增加細胞內(nèi)cAMP 以及激活zif269 啟動子［15］。研究報道在不同pH 值下以cAMP 和IP 為指標，對4 種質(zhì)子感知受體對質(zhì)子敏感程度進行研究，得出GPR4 和TADG8 對質(zhì)子最為敏感，G2A 最弱，OGR1 中等［16］。OGR1 在pH 值7.8 環(huán)境下是沒有活性的，但在pH 值6.8 環(huán)境下可完全激活肌醇磷酸［17］。質(zhì)子感知受體通過胞外結(jié)構(gòu)域中的組氨酸殘基來識別質(zhì)子，并與細胞內(nèi)的其他因子相互作用，在細胞的不同階段發(fā)揮著不同的作用［18］。質(zhì)子感知受體在堿性環(huán)境中組氨酸殘基間氫鍵比較穩(wěn)定，而在酸性環(huán)境下組氨酸殘基被破壞處于不穩(wěn)定狀態(tài)，轉(zhuǎn)化為活性構(gòu)象，從而啟動下游一系列信號變化。質(zhì)子感知受體廣泛存在于人體各組織中，在不同組織不同pH值調(diào)節(jié)下發(fā)生不同的反應［19］。下面詳細介紹質(zhì)子感知受體在骨組織的作用。

2 質(zhì)子感知受體與骨代謝的聯(lián)系

骨代謝穩(wěn)定主要依靠成骨細胞骨形成以及破骨細胞骨吸收兩者之間平衡來維持，一旦兩者之間失衡，會導致各種骨病如骨質(zhì)疏松、骨硬化癥等骨?。?0，21］。骨代謝受到局部pH 值影響很大，眾所周知骨骼中含有大量的堿性礦物如羥基磷灰石，但酸堿失衡后，骨組織中的堿性物質(zhì)可用于中和酸性物質(zhì)。pH 值對骨細胞影響也極為敏感，酸中毒可抑制成骨細胞的礦化，激活破骨細胞吸收骨和其他礦化組織。細胞外酸中毒可能由激素、生長因子或細胞因子等刺激細胞引起細胞代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)導致局部酸化［1，22］。酸中毒對骨骼的危害早已為人所知，特別是質(zhì)子感知受體GPCR 家族，如OGR1，對細胞外酸反應敏感并能調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞骨形成吸收等細胞功能［23］。所以，研究質(zhì)子感知受體和骨代謝之間的關(guān)系，有助于進一步闡明細胞外酸化作用于機體骨代謝的機制，這可能對臨床治療骨質(zhì)疏松癥等代謝骨病提供一種新的思維策略及治療靶點。

2.1 質(zhì)子感知受體與破骨細胞

酸中毒對骨組織危害早已眾所周知但被認為是由骨礦物質(zhì)物理化學溶解引起的，是骨組織充當“離子交換”以被動方式緩沖酸中毒。然而細胞培養(yǎng)和動物實驗表明，質(zhì)子對培養(yǎng)的大鼠破骨細胞有直接的刺激作用。代謝性酸中毒可直接誘導破骨細胞骨吸收并抑制成骨細胞骨形成［24，25］。

Pereverzev 等［26］首次報道了 RANKL 誘導RAW264.7 細胞獲得的破骨細胞中表達OGR1。細胞外酸化作用于OGR1 通過破骨細胞內(nèi)Ca2+信號傳導對破骨細胞遷移、分化和骨吸收活性至關(guān)重要。破骨細胞OGR1 感知細胞外質(zhì)子后，可激活蛋白激酶C（PKC），影響促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白的磷酸化狀態(tài)，或經(jīng)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1 和2（ERK1/2）信號傳導，延長破骨細胞存活時間，并且破骨細胞存活具有pH 值依賴性。Krieger 等［27］采用顯微CT 掃描和組織形態(tài)學測量8 周雄性OGR1 基因敲除小鼠和野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)OGR1 基因敲除小鼠脛骨和椎體骨小梁的皮質(zhì)骨體積明顯增加；OGR1 基因敲除小鼠中成骨細胞和破骨細胞表達均增加，骨轉(zhuǎn)換增加，但骨形成增加大于骨吸收。最終質(zhì)子受體OGR1 缺乏的小鼠骨密度增加。為進一步驗證酸中毒對破骨細胞OGR1 影響是否對骨吸收至關(guān)重要，后續(xù)采用特異性破骨細胞OGR1 敲除的小鼠培養(yǎng)3 個月，顯微CT 顯示OGR1 基因敲除小鼠脛骨和股骨骨密度增加；脛骨抗酒石酸酸性磷酸酶染色顯示OGR1 基因敲除小鼠脛骨破骨細胞數(shù)目減少。與野生型小鼠相比，體外培養(yǎng)敲除OGR1 基因小鼠破骨細胞表現(xiàn)為骨陷窩形成、破骨細胞特異性染色和破骨細胞特異性基因表達減少，這與破骨細胞影響細胞NFATc1 核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

高尿鈣癥是代謝性酸中毒的常見特征，并且對骨代謝產(chǎn)生影響，但具體機制不明確。為研究質(zhì)子感知受體在其中作用，采用敲除OGR1 基因小鼠，研究證實在酸性環(huán)境下OGR1 可改變Na+/H+-交換異構(gòu)體3在腎臟中重新分布，從而導致尿鈣增多［28］。Yang等［29］采用破骨細胞缺乏csf-1 基因的大鼠，通過注射CSF-1 恢復破骨細胞群，在CSF-1 治療2 d 后，開始在長骨中出現(xiàn)TRAP 陽性破骨細胞，并在4 d 達到峰值。 通過高密度微陣列進行測量顯示在CSF-1治療的2 d 內(nèi)，OGR1 mRNA 表達上升了近7 倍，然后在接下來的4 d 內(nèi)略有下降。在體內(nèi)和體外誘導破骨細胞分化，OGR1 的特異性抑制可以明顯抑制破骨細胞分化。研究表明OGR1 在體內(nèi)和體外破骨細胞生成過程中早期表達，并在破骨細胞分化中發(fā)揮作用。有研究采用特異性抑制劑CUCL2 抑制OGR1 作用，利用TRAP 特異性染色、Ca2+熒光標記、Hoechst 33342 核染色、免疫熒光及PCR 等監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，細胞外酸化通過質(zhì)子感知受體OGR1 通過蛋白激酶C 信號通路可提高破骨細胞的存活率［26］。除了質(zhì)子感知受體OGR1 外，質(zhì)子感知受體TDAG8 也能通過Rho信號通路來增強破骨細胞骨吸收活性，當敲除TDAG8 基因小鼠骨密度明顯增加［30］。還發(fā)現(xiàn)TDAG8參與類風濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的疾病進展，TDAG8缺失可減輕類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠疾病進展和疼痛癥狀，并證實TDAG8 確實可以抑制巨噬細胞和衛(wèi)星膠質(zhì)細胞來減弱類風濕關(guān)節(jié)炎疼痛［31］。

2.2 質(zhì)子感知受體與成骨細胞

質(zhì)子感知受體除了在破骨細胞中表達，同樣也表達于成骨細胞上。大鼠組織切片免疫組織化證實了成骨細胞和骨細胞中存在OGR1。Tomura 等［32］研究發(fā)現(xiàn)人類成骨細胞系NHOst 表達OGR1，并發(fā)現(xiàn)細胞外酸性刺激OGR1 與Gq/11 蛋白偶聯(lián)后，導致細胞內(nèi)Ca2+水平和磷酸肌醇短暫增加，誘導環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）表達增加，進一步產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2），之后激活成骨細胞表達RANKL，RANKL 是破骨細胞分化重要因子，可促進破骨細胞分化形成。當使用OGR1 特異性抑制劑siRNA 阻斷后，可抑制酸誘導的成骨細胞COX-2 增加。Kadowaki 等［33］推測成骨細胞可能釋放某種OGR1 激動因子并激活破骨細胞表達OGR1。研究篩選了多種細胞上清液和器官提取物，發(fā)現(xiàn)ST-2 成骨細胞上清液和豬胰腺組織提取物對OGR1 有較強激動作用。最終純化鑒定出活性金屬（Fe、Zn、Co、Mn 和Ni） 是OGR1 一種新型激動劑，可在中性環(huán)境下單獨激活OGR1。這些OGR1 激動金屬通過OGR1 在原代破骨細胞中誘導細胞內(nèi)Gq 偶聯(lián)的肌醇磷酸信號發(fā)揮作用。 并且這些OGR1 激動金屬通過與質(zhì)子作用的相同殘基激活OGR1。OGR1 中第2 個跨膜結(jié)構(gòu)域中的L74P 可能導致受體構(gòu)象發(fā)生改變的部位，從而干擾質(zhì)子或金屬離子與組氨酸殘基的相互作用，影響與G蛋白偶聯(lián)，改變細胞內(nèi)信號傳導機制［34］。Krieger等［5］研究這些結(jié)果表明，G 蛋白信號16 在調(diào)節(jié)成骨細胞OGR1 對代謝性酸中毒的反應和后續(xù)刺激破骨細胞骨吸收中也起到重要作用。除了OGR1 質(zhì)子感知受體外，成骨細胞中檢測到質(zhì)子感知受體GPR4 和GPR65 表達，在酸性培養(yǎng)條件下，GPR4 和GPR65可增強破骨細胞活性，并能通過促進成骨細胞分泌RANKL 來發(fā)揮作用［35，36］。

3 總結(jié)與展望

全身及局部代謝性酸中毒與骨代謝關(guān)系密切相關(guān)，但常常易被忽視。雖然研究已證實細胞外酸中毒可以通過質(zhì)子感知受體抑制成骨細胞分化和生長，同時促進破骨細胞的形成和骨吸收活性。但成骨細胞和破骨細胞感知細胞外酸變化的機制可能很復雜，在本綜述中，作者討論了質(zhì)子感知受體對成骨和破骨細胞的影響及其機制，尤其是質(zhì)子感知受體OGR1。越來越多的證據(jù)證實OGR1 在骨組織生理和病理狀態(tài)中的重要作用；但其具體機制仍不完全明確，進一步研究質(zhì)子感知受體在骨代謝中的調(diào)節(jié)機制對于開發(fā)治療骨代謝疾病藥物提供了新的治療靶點和新思路。