黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)固氮微生物群落多樣性在生物結(jié)皮中的演變規(guī)律

焦冰潔,徐 琳,李香真,張丙昌,*

1 山西師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院, 太原 030031

2 山西師范大學(xué)黃河中游生態(tài)環(huán)境研究中心, 太原 030031

3 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所, 成都 610041

4 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)林業(yè)研究所, 成都 611100

黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)屬于黃土高原向荒漠過渡、森林草原向典型干旱草原過渡的地帶,是黃河流域的重要生態(tài)屏障[1—2],該區(qū)域水土流失和干旱缺水兩大問題并存,加之人類活動(dòng)的影響,是典型的生態(tài)脆弱區(qū)。黃土高原退耕還林還草工程實(shí)施后,生物結(jié)皮廣泛發(fā)育,并逐漸成為恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。生物土壤結(jié)皮(簡(jiǎn)稱生物結(jié)皮,BSCs)是由細(xì)菌、藍(lán)藻、真核藻類、真菌、地衣和苔蘚與土壤顆粒膠結(jié)而成的有機(jī)復(fù)合體[3]。根據(jù)生物結(jié)皮的優(yōu)勢(shì)物種,可將生物結(jié)皮分為藻結(jié)皮、地衣結(jié)皮和蘚結(jié)皮,這種不同類型的生物結(jié)皮反映了其演替趨勢(shì)[4—6]。

黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)極不均勻的降水分布以及單次暴雨的強(qiáng)度導(dǎo)致該地區(qū)嚴(yán)重水土流失[7],造成大量有效養(yǎng)分損失,尤其是氮素[8—9]。氮素是調(diào)節(jié)陸地生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵元素,也是植物凈生產(chǎn)力和土壤生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的主要限制性元素[10]。生物結(jié)皮對(duì)干旱半干旱區(qū)土壤氮素的提高有著重要貢獻(xiàn),在世界不同地區(qū),多數(shù)研究表明,生物結(jié)皮是干旱半干旱區(qū)除大氣氮沉降和豆科植物固氮外土壤氮素輸入的重要貢獻(xiàn)者[11—13]。據(jù)報(bào)道,生物結(jié)皮在全球干旱半干旱區(qū)年固氮量高達(dá)49 Tg,約占全球陸地生態(tài)系統(tǒng)生物總固氮量的1/4[14]。在溫帶荒漠藻類生物結(jié)皮的固氮酶活性可高達(dá)133 μmol m-2h-1[11];Xu等在古爾班通古特沙漠中的研究表明,演替后期的生物結(jié)皮有更高的固氮酶活性[15]。

固氮微生物是固氮過程的關(guān)鍵功能群,在土壤氮素輸入中發(fā)揮著重要作用[10, 16]。研究表明,在門水平,多數(shù)研究區(qū)生物結(jié)皮的固氮類群主要是藍(lán)藻門和變形菌門[17—19],在古爾班通古特沙漠沙漠生物結(jié)皮固氮藍(lán)藻的研究中發(fā)現(xiàn),念珠藻(Nostoc)和偽枝藻(Scytonema)是生物結(jié)皮固氮微生物的核心物種[15]。在內(nèi)蒙古渾善達(dá)克沙地和戈壁荒漠生物結(jié)皮中的固氮微生物優(yōu)勢(shì)菌是藍(lán)藻門和變形菌門,優(yōu)勢(shì)綱為α-變形菌和β-變形菌,在戈壁石下生物結(jié)皮中α-變形菌是穩(wěn)定固氮微生物群落的關(guān)鍵類群,可能是主要固氮者;在屬水平,偽枝藻、念珠藻和斯克爾曼氏菌(Skermanella)在生物結(jié)皮中占明顯優(yōu)勢(shì)[20—21]。Wang等在對(duì)青藏高原高寒草甸土壤非共生固氮菌的研究中發(fā)現(xiàn),中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)和是已知固氮微生物中的優(yōu)勢(shì)物種[22]。土壤理化因子對(duì)不同生態(tài)系統(tǒng)或不同生境的固氮微生物具有明顯的調(diào)控作用,多數(shù)研究認(rèn)為,土壤有機(jī)碳、全氮、有效氮和pH是影響固氮微生物群落的主要因子[19—20],如古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮演替過程中,研究發(fā)現(xiàn)土壤總有機(jī)碳與總氮之比(TOC/TN)和pH是影響固氮微生物群落的關(guān)鍵環(huán)境因素,在青藏高原高寒草甸中,研究也發(fā)現(xiàn)以pH為主導(dǎo)的確定性過程在土壤非共生固氮菌的群落構(gòu)建中發(fā)揮著主要作用,除pH外,慢生根瘤菌和中慢生根瘤菌的豐度還與年平均溫度、年平均降雨量以及沙粒、粉粒和粘粒的比例顯著相關(guān)[15, 22]。

黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)的固氮研究多集中在土壤氮素的積累或循環(huán)[23—24]、固氮酶活性及其影響因子[25]等方面。然而,該區(qū)域生物結(jié)皮演替過程中固氮微生物群落多樣性及其關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子尚不清楚。本研究以黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)生物結(jié)皮為對(duì)象,研究了黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)生物結(jié)皮演替過程的固氮潛力、固氮微生物群落多樣性及其關(guān)鍵環(huán)境影響因子,以期為該區(qū)域生態(tài)修復(fù)提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論支撐。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于陜西省神木縣六道溝小流域(38°46′—48°51′N,110°21′—110°23′E),海拔1081—1274 m,流域面積6.89 km2,屬于典型的水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)帶。該區(qū)主體地貌由風(fēng)沙地貌和黃土丘陵共同構(gòu)成,土壤質(zhì)地為砂質(zhì)土壤,屬中溫帶半干旱氣候;年均降水量408.5 mm,且80%以上集中在7—9月,多以暴雨形式出現(xiàn),氣候變化劇烈,平均水蝕模數(shù)15000 t km-2a-1,平均風(fēng)蝕模數(shù)3200 t km-2a-1,是典型的水蝕風(fēng)蝕生態(tài)脆弱區(qū)。流域?yàn)榈湫偷纳w沙黃土丘陵地貌,分為東西兩半、西部多為固定沙丘,以風(fēng)沙土為主,占流域總面積的13.5%;東部則大部分為黃綿土為主,占流域總面積的86.5%[26]。流域內(nèi)植被蓋度60%以上,現(xiàn)以人工植被和退耕荒坡地演替植被為主,主要是苜蓿(Medicagosativa)、長(zhǎng)芒草(Stipabungeana)、檸條(Caraganakorshinskii)等;生物結(jié)皮的蓋度30%—40%。

2 研究方法

2.1 樣品采集

2021年7月,在神木六道溝封禁良好的小流域典型坡面上,設(shè)置5條20 m×20 m的樣帶(樣帶間距大于30 m),坡度為15—25°,各樣帶區(qū)域大小相同,坡向相同。在每條樣帶隨機(jī)選擇不同的生物結(jié)皮類型:淺色藻結(jié)皮(LAC)、深色藻結(jié)皮(DAC)、地衣結(jié)皮(LC)、蘚結(jié)皮(MC),其蓋度和主要物種組成見表1。將裸地(BS)作為研究對(duì)照,每種類型設(shè)置3個(gè)1 m×1 m的樣方,沿樣方對(duì)角線采用自然剝離法收集土壤樣品,分為結(jié)皮層和結(jié)皮下層(0—5 cm)2個(gè)土壤層次。為減少空間異質(zhì)性,每條樣帶收集同種類型的3個(gè)土壤樣品均勻混合后作為一個(gè)樣品,共獲得60份土壤樣品。用無菌采樣鏟收集樣品后裝入無菌封口袋,并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)樣品分為兩份:一部分土壤自然風(fēng)干,用于測(cè)定理化性質(zhì)及固氮酶活性,另一份土壤于-20℃冰箱保存,用于分子分析。

表1 生物結(jié)皮不同類型的關(guān)鍵物種組成

2.2 固氮酶活性與環(huán)境變量測(cè)定

2.3 樣品DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增測(cè)序及熒光定量PCR

采用PowerSoil?DNA提取試劑盒(Qiagen,德國(guó)希爾登)并按照說明從(0.6±0.1)g土壤樣品中提取DNA,利用Nanodrop2000對(duì)DNA濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)(OD A260/A280比值在1.8—2.0之間)。

以nifH1(5′-GCC ATC ATY TCN CC-3′)和nifH2(5′-TGY GAY CCN AAR GCN GA-3′)為引物,對(duì)nifH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min),通過Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序長(zhǎng)度2×250 bp。

分別針對(duì)nifH基因(引物:nifH1;nifH2)、16S rRNA基因(引物 515F:5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′;909R:5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)、ITS基因(引物 ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′;gITS7:5′-GTGARTCATCGARTCTTTG-3′)采用熒光定量PCR的方法定量檢測(cè)固氮微生物、細(xì)菌和真菌的絕對(duì)豐度,ITS與16S rRNA基因豐度之比定義為真菌與細(xì)菌之比(F/B)[19]。

2.4 生物信息學(xué)分析

使用QIIME2將下機(jī)的原始序列利用FLASH進(jìn)行雙端測(cè)序數(shù)據(jù)拼接,根據(jù)樣品標(biāo)簽信息對(duì)序列進(jìn)行分類,并進(jìn)行質(zhì)控及優(yōu)化[28]。Usearch8對(duì)序列進(jìn)行嵌合體檢測(cè)[29],使用Framebot去除移碼突變[30],UCLSUT以96%序列相似性基于基本操作單元(OTU)進(jìn)行聚類分析,去除<10的聚類簇[31],將各樣品序列抽平到同一深度,共得到每個(gè)樣品5548條序列;使用晶體結(jié)構(gòu)可視化軟件(Diomand)構(gòu)建對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類信息注釋,注釋閾值選用80%。固氮酶活性與nifH基因豐度采用單因子方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)在不同生物結(jié)皮演替階段的差異顯著性,并使用Origin 2021繪圖;其余數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與繪圖使用R4.2.0軟件加載Microeco包進(jìn)行[32]:計(jì)算固氮微生物群落的α及β-多樣性;分別在門、目和屬分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣品的群落組成;采用單因子ANOVA檢驗(yàn)和多重比較(LSD)檢驗(yàn)固氮微生物α-多樣性、物種組成在不同生物結(jié)皮演替階段間的顯著性差異;通過主成分分析(PCoA)確定群落結(jié)構(gòu)差異,并采用置換多元方差分析(PERMANOVA)對(duì)Bray-Curtis距離檢驗(yàn)群落差異顯著性;通過冗余分析(RDA)和Mantel檢驗(yàn)固氮微生物群落與環(huán)境因子的顯著性。

3 研究結(jié)果

3.1 固氮酶活性與nifH基因豐度

生物結(jié)皮層的固氮酶活性隨結(jié)皮演替呈顯著增加趨勢(shì)(圖1),其中蘚結(jié)皮層的固氮酶活性最高,可達(dá)(4.78±0.66) μmol C2H4m-2h-1,高于地衣結(jié)皮、淺色和深色藻結(jié)皮,顯著高于裸地(P<0.05);生物結(jié)皮層的固氮酶活性均顯著高于結(jié)皮下層土壤(圖1)。nifH基因豐度的變化趨勢(shì)也與其相似(圖1),nifH基因絕對(duì)豐度在結(jié)皮層與結(jié)皮下層中均表現(xiàn)為隨演替呈現(xiàn)增加趨勢(shì);除裸地外,其余四種結(jié)皮的nifH基因絕對(duì)豐度均顯著高于結(jié)皮下層(圖1)。

圖1 不同演替階段生物結(jié)皮層與結(jié)皮下層土壤的固氮酶活性及nifH基因豐度

3.2 固氮微生物群落α-多樣性的變化規(guī)律

在生物結(jié)皮不同演替階段中,Shannon指數(shù)、譜系多樣性(PD)與固氮酶活性變化規(guī)律類似,均表現(xiàn)為蘚結(jié)皮最高,顯著高于裸地、藻結(jié)皮和地衣結(jié)皮階段,而裸地、藻結(jié)皮和地衣結(jié)皮Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)無顯著差異(圖2),表明生物結(jié)皮的演替顯著提高了固氮微生物多樣性。生物結(jié)皮層的Shannon、PD指數(shù)顯著高于結(jié)皮下層(圖2);而結(jié)皮層的chao1指數(shù)高于結(jié)皮下層但不顯著(圖2)。

圖2. 生物結(jié)皮不同演替階段及生物結(jié)皮層與結(jié)皮下層土壤固氮微生物群落α-多樣性指數(shù)

3.3 固氮微生物群落組成

在門水平上,藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、廣古菌門(Euryarchaeota)的相對(duì)豐度占固氮微生物總豐度的98%以上。在裸地中,變形菌門的相對(duì)豐度高達(dá)63.1%,主要包含紅螺菌目(Rhodospirillales)、酸硫桿菌目(Acidithiobacillales)和根瘤菌目(Rhizobiales),其次是藍(lán)藻門的念珠藻目(Nostocales)和厚壁菌門的梭菌目(Clostridiales);淺色和深色藻結(jié)皮、地衣結(jié)皮中藍(lán)藻門的念珠藻目占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(相對(duì)豐度在84.72%—88.53%之間),而藍(lán)藻門的顫藻目(Oscillatoriales)、色球藻目(Chroococcales)和聚球藻目(Synechococcales)的豐度只占很小比例,變形菌門與厚壁菌門的相對(duì)豐度也顯著低于裸地;而在蘚結(jié)皮階段,仍以藍(lán)藻門的念珠藻目占優(yōu)勢(shì),其次是變形菌門的紅螺菌目、酸硫桿菌目和根瘤菌目(圖3)。

圖3 生物結(jié)皮不同演替階段及生物結(jié)皮層與結(jié)皮下層土壤固氮微生物在目水平上的群落組成

在屬水平上,裸地中的優(yōu)勢(shì)物種主要是斯克爾曼氏菌屬(Skermanella)、瘤胃梭菌屬(Ruminclostridium),其次為嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)和Trichomus;但Trichomus在淺色和深色藻結(jié)皮、地衣結(jié)皮、蘚結(jié)皮中均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),且在藻結(jié)皮和地衣結(jié)皮的相對(duì)豐度顯著高于蘚結(jié)皮和裸地(P<0.05);除此之外,念珠藻屬(Nostoc)、藍(lán)桿藻屬(Cyanothece)、魚腥藻屬(Anabaena)、斯克爾曼氏菌、瘤胃梭菌屬在藻結(jié)皮、地衣結(jié)皮、蘚結(jié)皮均占明顯優(yōu)勢(shì)。在OTUs水平上,發(fā)現(xiàn)有多個(gè)OTUs屬于同一物種,如Trichormusvariabilis和Skermanellaaerolata分別有130和98個(gè)OTUs,另外Nostocpunctiforme、念珠藻(Nostocsp. PCC7120)、魚腥藻(Anabaenasp. L31)等均有多個(gè)OTUs,這表明生物結(jié)皮中的固氮微生物具有豐富的多樣性。

在物種組成上,結(jié)皮層和結(jié)皮下層具有明顯的差別,如在門水平上,藍(lán)藻門是結(jié)皮層的優(yōu)勢(shì)類群,而結(jié)皮下層則是變形菌門占優(yōu)勢(shì);除藍(lán)藻綱外,α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)和Acidithiobacillia在結(jié)皮下層占明顯優(yōu)勢(shì),其相對(duì)豐度均顯著高于結(jié)皮層;在目水平上,結(jié)皮層以念珠藻目占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),其相對(duì)豐度為81.74%±2.24%,顯著高于結(jié)皮下層(34.60%)(P<0.01);在屬水平上,結(jié)皮下層的固氮微生物優(yōu)勢(shì)物種是斯克爾曼氏菌、Trichormus、瘤胃梭菌屬、念珠藻屬、酸硫桿狀菌屬,與裸地接近。

3.4 固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵環(huán)境因子的關(guān)系

基于Bray-Curtis距離的主成分分析(PCoA)表明,第一、二排序軸分別解釋累積變量的29.2%和12.3%(圖4);淺色藻結(jié)皮、深色藻結(jié)皮和地衣結(jié)皮的固氮微生物群落重合度高,表明這三個(gè)演替階段的固氮微生物群落結(jié)構(gòu)具有明顯相似性;而裸地和蘚結(jié)皮的固氮微生物群落與這三個(gè)演替階段彼此分離,且PERMANOVA顯著性檢驗(yàn)表明裸地與其它所有結(jié)皮類型之間的固氮微生物群落差異為極顯著(P<0.01);蘚結(jié)皮與裸地、淺色和深色藻結(jié)皮、地衣結(jié)皮之間的固氮微生物群落差異也為極顯著水平(P<0.01),說明生物結(jié)皮演替對(duì)固氮微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響。生物結(jié)皮層與結(jié)皮下層土壤的固氮微生物群落有明顯的分離(圖4),PERMANOVA分析亦表明它們之間差異極顯著(P<0.01),進(jìn)一步說明生物結(jié)皮對(duì)固氮微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響。

圖4 生物結(jié)皮不同演替階段及生物結(jié)皮層與結(jié)皮下層土壤固氮微生物群落組成的主坐標(biāo)分析

土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)、土壤含水量(SWC)、全氮(TN)與Chao1顯著或極顯著正相關(guān)(P<0.05或P<0.01),表明多因子共同調(diào)控固氮微生物多樣性,導(dǎo)致固氮能力的提升;土壤碳氮比(C/N)與Shannon指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05),也說明生物結(jié)皮固氮微生物對(duì)土壤氮素積累的貢獻(xiàn);真菌與細(xì)菌之比(F/B)與Shannon指數(shù)也呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明固氮微生物以細(xì)菌為主(表2)。通過測(cè)試進(jìn)一步分析環(huán)境因子與固氮微生物群落的關(guān)系,結(jié)果表明,土壤pH值、TN與固氮微生物群落呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)(表3);pH值與念珠藻目、念珠藻科(Nostocaceae)以及其中的Trichormus屬均呈顯著或極顯著正相關(guān)的關(guān)系(P<0.05或P<0.01),而與變形菌門中的紅螺菌目及其中的紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、斯克爾曼氏菌屬呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01);土壤TN與念珠藻屬呈顯著正相關(guān)(P<0.01),這表明pH與TN是影響黃土高原生物結(jié)皮固氮微生物的關(guān)鍵環(huán)境因子。

表2 土壤環(huán)境因子與固氮微生物群落α-多樣性的相關(guān)性分析

表3 土壤環(huán)境因子與固氮微生物群落的相關(guān)性分析

3.5 影響固氮潛力的關(guān)鍵微生物

相關(guān)性分析表明,固氮酶活性與固氮基因豐度(nifH)之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.27,P=0.000),固氮酶活性(NAc)、nifH基因豐度與藍(lán)藻中的念珠藻目均為極顯著的正相關(guān)關(guān)系,而與紅螺菌目、酸硫桿菌目、梭菌目、根瘤菌目呈顯著負(fù)相關(guān)(圖5);表明隸屬藍(lán)藻門的念珠藻目可能是固氮微生物的關(guān)鍵物種,在生物結(jié)皮的固氮功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用;而紅螺菌目、酸硫桿菌目、梭菌目、根瘤菌目只在裸地表現(xiàn)出較高的豐度,但在生物結(jié)皮的固氮基因豐度和固氮酶活性中均貢獻(xiàn)微弱。

圖5 生物結(jié)皮關(guān)鍵固氮物種與環(huán)境因子的相關(guān)性

4 討論

4.1 念珠藻目是黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)生物結(jié)皮固氮微生物的優(yōu)勢(shì)類群

本研究中發(fā)現(xiàn),黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)固氮微生物類群中念珠藻目為主要優(yōu)勢(shì)類群。念珠藻目的物種,其絲狀體均存在數(shù)量不等的異形胞,而異形胞是一種特有的能固氮的細(xì)胞,內(nèi)含有固氮酶,可將大氣中的氮分子固定為氮素化合物[33]。本文發(fā)現(xiàn)黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)藻結(jié)皮(淺色和深色)、地衣結(jié)皮和蘚結(jié)皮階段的固氮微生物以藍(lán)藻門的念珠藻目占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),其中的Trichormus和念珠藻(Nostocsp.)為主要優(yōu)勢(shì)種;其次是變形菌門的紅螺菌目、酸硫桿菌目和根瘤菌目以及厚壁菌門的梭菌目。Trichormus是從魚腥藻屬分離出來的新屬,其包含的Trichormusvariabilis則是念珠藻科魚腥藻屬的多變魚腥藻(Anabeanavariabilis)[34]。在荒漠區(qū)域的多數(shù)研究也發(fā)現(xiàn)固氮藍(lán)藻是生物結(jié)皮固氮的關(guān)鍵類群,如在科羅拉多高原、奇瓦瓦(Chihuahuan)沙漠中深色藻結(jié)皮的固氮藍(lán)藻主要來自念珠藻目的念珠藻(Nostocspp.)、偽枝藻(Scytonemaspp.)、單岐藻(Tolypothrixspp.)、魚腥藻(Anabeanaspp.)、眉藻(Calothrixspp.)[35—36]。在古爾班通古特沙漠中,生物結(jié)皮固氮微生物的關(guān)鍵物種是念珠藻和偽枝藻[19]。念珠藻目物種一方面可以固氮,另一方面還可以通過光合作用進(jìn)行固碳,增加土壤中的C和N[5, 37]。在毛烏素沙地,化能合成固氮微生物共有4455個(gè)OUTs,96.57%屬于變形菌門,其中固氮螺菌屬(Azospirillum)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、中生根瘤菌屬(Mesorhizobium)是該區(qū)域的核心固氮物種[38]。在荒漠區(qū),變形菌門的異養(yǎng)固氮細(xì)菌與厚壁菌門的梭菌科是早期生物結(jié)皮的重要固氮類群[17, 19, 35—36],本研究發(fā)現(xiàn)裸地中的固氮微生物則以變形菌門的紅螺菌目、酸硫桿菌目和根瘤菌目為主,同時(shí)裸地中的nifH基因豐度最低,這說明變形菌門的物種適于在養(yǎng)分貧瘠的環(huán)境中生長(zhǎng)。

通過nifH基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)固氮微生物具有高度多樣性[34]。有研究表明,Trichormus和魚腥藻屬是多系的,可能包含幾個(gè)屬[30]。本研究發(fā)現(xiàn)黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)生物結(jié)皮固氮微生物具有豐富的多樣性,如在OTU水平上,Trichormusvariabilis和Skermanellaaerolata分別有130和98個(gè)OTUs,另外點(diǎn)狀念珠藻(Nostocpunctiforme)、念珠藻(Nostocsp. PCC7120)、魚腥藻(Anabaenasp. L31)等均有多個(gè)OTUs,表明生物結(jié)皮中孕育著豐富的固氮微生物物種資源。因此,在黃土高原固氮微生物的研究中,為了挖掘物種資源及應(yīng)用,需重視固氮微生物的分離、純化及規(guī)?；囵B(yǎng)。

4.2 pH為主導(dǎo)的多因子共同調(diào)控固氮微生物群落

在黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū),自然和人工生物結(jié)皮的發(fā)育對(duì)土壤有機(jī)碳、總氮和速效氮、總磷和有效磷、速效鉀等均有顯著貢獻(xiàn),蘚結(jié)皮的C、N、P含量較藻結(jié)皮分別增加了161%、127%和9%[6,39]。同時(shí),生物結(jié)皮的演替有利于降低土壤pH、增加土壤水分、促進(jìn)土壤團(tuán)聚體的形成[40]。在全球尺度上,土壤pH是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和譜系多樣性的關(guān)鍵環(huán)境因子,土壤pH通過改變酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對(duì)豐度影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[41—42]。在高寒草甸土壤中發(fā)現(xiàn)pH是影響固氮群落的關(guān)鍵環(huán)境因子,與低pH(pH 5.02—7.00)土壤相比,高pH(pH 7.00—8.00)土壤的固氮微生物群落多樣性更高,群落聚集性更強(qiáng)[43]。在古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮中,固氮微生物的核心物種是與念珠藻和偽枝藻相關(guān)的OTUs,pH與固氮微生物群落譜系多樣性指數(shù)βNTI呈顯著正相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn),pH值與固氮微生物群落和關(guān)鍵固氮類群念珠藻目及其主要物種之間存在顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系,表明在固氮過程中起關(guān)鍵作用的念珠藻目相關(guān)物種更適于在中性到堿性土壤環(huán)境生長(zhǎng)。一些研究證實(shí),藍(lán)藻更適合在堿性土壤中生長(zhǎng),堿性土壤易形成藍(lán)藻占優(yōu)勢(shì)的生物結(jié)皮[44];Li等在沙坡頭固沙植被區(qū)的研究表明,生物結(jié)皮群落中藍(lán)藻物種豐富度和多樣性隨沙面土壤pH和總鹽的增加而增加[45]。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下,發(fā)現(xiàn)念珠藻和魚腥藻在高pH(pH>8)的培養(yǎng)基中具更高的生物量[46],預(yù)示著高pH的堿性環(huán)境可能更利于念珠藻目的物種生長(zhǎng)。本研究中,藻結(jié)皮和地衣結(jié)皮的pH分別為8.53—8.56和8.47,明顯高于裸地(8.36)和蘚結(jié)皮(8.32),高pH土壤對(duì)藍(lán)藻中的念珠藻目種類提供了適宜的微環(huán)境,對(duì)固氮微生物起到篩選作用,導(dǎo)致念珠藻目物種在藻結(jié)皮和地衣結(jié)皮中占有更高的相對(duì)豐度。

本研究中,還發(fā)現(xiàn)土壤SOM、C/N對(duì)微生物多樣性起著調(diào)控作用。在生物結(jié)皮的演替過程中,藻結(jié)皮主要以絲狀藍(lán)藻為主,當(dāng)發(fā)育到地衣結(jié)皮時(shí),除地衣植物外,還有大量的藻類植物[47—48],固氮微生物中念珠藻目占優(yōu)勢(shì);當(dāng)進(jìn)一步演替至蘚結(jié)皮,藻類種類和生物量下降,逐漸被蘚類植物取代,顯著增加了土壤中有機(jī)碳的含量,為異養(yǎng)微生物提供了豐富的能源物質(zhì),致使細(xì)菌和真菌生物量隨生物結(jié)皮的演替顯著升高[5,15],在蘚結(jié)皮中,異養(yǎng)固氮微生物(如紅螺菌目、酸硫桿菌目和根瘤菌目)可能獲取更多的碳源,致使其生物量的增加,加之念珠藻目的物種,最終導(dǎo)致蘚結(jié)皮的固氮微生物多樣性和生物量顯著高于其它階段,固氮微生物群落結(jié)構(gòu)也有了明顯區(qū)別。

除土壤pH、SOM外,TN含量、土壤含水量與固氮微生物群落多樣性亦有明顯的相關(guān)性,說明多因子共同調(diào)控固氮微生物群落。這表明生物結(jié)皮的演替可能改變土壤理化性質(zhì)導(dǎo)致生態(tài)位的變化,進(jìn)而影響其中的固氮微生物群落組成,這在一定程度上也驗(yàn)證了在小尺度上確定性過程在固氮微生物群落構(gòu)建中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

4.3 黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)固氮微生物的固氮潛力

在草原土壤中,研究證明固氮微生物β-多樣性與固氮酶活性具顯著相關(guān)性[46]。在黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū),本研究表明固氮酶活性、nifH基因豐度、固氮微生物α-多樣性均隨生物結(jié)皮的演替呈顯著升高,而生物結(jié)皮中TN與固氮微生物多樣性、固氮群落以及關(guān)鍵物種均存在顯著正相關(guān)關(guān)系,說明生物結(jié)皮中固氮微生物多樣性和數(shù)量的增加,其固氮能力明顯提升,導(dǎo)致土壤氮素含量的升高。在黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū),生物結(jié)皮中的念珠藻目以及Trichormusvariabilis的豐度與固氮酶活性、固氮微生物nifH基因豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系,這表明與念珠藻目的Trichormusvariabilis相關(guān)的OTUs在黃土高原生物結(jié)皮氮輸入過程中發(fā)揮著重要作用。黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū)土壤氮素含量隨水土流失損失嚴(yán)重[9],但在生物結(jié)皮形成后,土壤TN隨生物結(jié)皮演替而呈顯著上升趨勢(shì)[40, 49],說明黃土高原生物結(jié)皮中的固氮微生物對(duì)土壤氮積累具有重要貢獻(xiàn)。

5 結(jié)論

在黃土高原水蝕風(fēng)蝕交錯(cuò)區(qū),生物結(jié)皮演替顯著影響固氮酶活性、nifH基因豐度和固氮微生物α-多樣性,各參數(shù)表現(xiàn)為蘚結(jié)皮顯著高于其它演替階段,且生物結(jié)皮層高于結(jié)皮下層土壤。生物結(jié)皮演替對(duì)固氮微生物群落組成與結(jié)構(gòu)具有明顯影響;在裸地,固氮微生物以變形菌門的紅螺菌目、酸硫桿菌目和根瘤菌目為主,而在藻結(jié)皮、地衣結(jié)皮和蘚結(jié)皮均表現(xiàn)為藍(lán)藻門的念珠藻目占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),是固氮微生物的關(guān)鍵類群。念珠藻目以及Trichormusvariabilis的豐度與固氮酶活性、固氮微生物nifH基因豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系,Trichormus相關(guān)的類群在黃土高原生物結(jié)皮固氮過程中發(fā)揮著重要作用。生物結(jié)皮演替引起的土壤pH、SOM、TN、土壤含水量等理化性質(zhì)的變化改變了微生境,進(jìn)而影響固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性,其中pH發(fā)揮著關(guān)鍵作用。