芽孢桿菌糖基水解酶GH489的表達及生物活性研究

田宇曦 杜思源 余曉華 夏昊天 劉曉艷 閔勇 陳凌 朱鐳1 邱一敏

摘要：為了探究芽孢桿菌（Bacillus sp.）糖基水解酶GH489的生物活性，通過設計特異性引物擴增得到目的基因gh489，采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對重組GH489蛋白進行表達，利用組氨酸標簽對目的蛋白進行分離純化，并檢測芽孢桿菌糖基水解酶GH489對二斑葉螨的殺螨活性。結(jié)果表明，由大腸桿菌BL21（DE3）表達的重組GH489蛋白為可溶性蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為57 kDa。純化后的GH489重組蛋白顯示出良好的殺螨活性，處理24 h后，二斑葉螨的半致死濃度（LC50）為30.296 μg/mL，處理48 h后，二斑葉螨的半致死濃度（LC50）為21.212 μg/mL。

關鍵詞：芽孢桿菌（Bacillus sp.）；糖基水解酶；表達；蛋白純化；殺螨活性

中圖分類號：TS201 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）11-0198-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.11.034 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Expression and biological activity of Bacillus sp. glycosyl hydrolase GH489

TINA Yu-xi1， DU Si-yuan1， YU Xiao-hua2， XIA Hao-tian2， LIU Xiao-yan1，

MIN Yong1， CHEN Ling1， ZHU Lei1， QIU Yi-min1，2

（1.Hubei Biopesticide Engineering Research Centre， Wuhan ?430064， China；

2.Yangxin County Specialty Service Center， Huangshi ?435299， Hubei， China）

Abstract： In order to investigate the biological activity of Bacillus sp. glycosyl hydrolase GH489， the target gene gh489 was amplified by designing specific primers，the recombinant GH489 protein was expressed using the Escherichia coli prokaryotic expression system， and the target protein was isolated and purified using histidine tags. The acaricidal activity of Bacillus sp. glycosyl hydrolase GH489 against Tetranychus urticae was detected. The results showed that the recombinant GH489 protein expressed by Escherichia coli BL21 （DE3） was a soluble protein with a molecular weight of approximately 57 kDa. The purified GH489 recombinant protein showed good acaricidal activity，after 24 hours of treatment， the half lethal concentration （LC50） of Tetranychus urticae was 30.296 μg/mL， and after 48 hours of treatment， the half lethal concentration （LC50） of Tetranychus urticae was 21.212 μg/mL.

Key words： Bacillus sp.； glycosyl hydrolase； expression； protein purification； acaricidal activity

碳水化合物是地球上最豐富的生物分子。從結(jié)構(gòu)元素（纖維素、甲殼素）、能量分子（淀粉、糖原）到參與細胞識別過程，它們在生物體內(nèi)發(fā)揮不同的作用。將碳水化合物（糖）分子與另一個糖或非糖類物質(zhì)的基團用共價連接起來，形成長鏈聚合物。糖基水解酶（Glycoside hydrolases，GH，EC3.2.1），又稱為糖苷酶或糖苷水解酶，是一種廣泛存在于大部分生物體的酶，可水解糖苷鍵，形成糖半縮醛或半縮酮和游離苷元。糖基水解酶還可以水解碳水化合物與 ?O—、N—、S—鍵的連接。其分類方式具有多樣性，可以根據(jù)水解反應的立體化學結(jié)果（保留或反轉(zhuǎn)）進行分類，也可以根據(jù)酶的作用方式分類，即外切（非還原端）和內(nèi)切（分子中間），還可以基于蛋白序列和結(jié)構(gòu)進行分類?；谛蛄蟹诸惤Y(jié)果得出有150多個不同的糖基水解酶家族［1］。

糖基水解酶存在于絕大部分的生命領域，在原核生物中既是細胞內(nèi)酶又是細胞外酶，主要參與糖苷分子水解、營養(yǎng)物質(zhì)獲取、操縱子表達調(diào)控、翻譯后修飾、高等生物溶酶體儲存、糖原生物合成和降解。在高等生物中，糖基水解酶存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體（負責N-連接糖蛋白的加工）、腸道中的溶酶體（負責碳水化合物結(jié)構(gòu)的降解）和唾液中的碳水化合物降解酶（淀粉酶），腸道中的內(nèi)皮細胞糖基磷脂酰錨定酶，如乳糖酶（降解牛奶中的乳糖）、O-GlcNAcase酶（負責定位于細胞質(zhì)和核的絲氨酸和蘇氨酸殘基中N-乙酰氨基葡萄糖基的去除）。

糖基水解酶被廣泛應用于生物和化學工業(yè)，如纖維素酶、木聚糖酶等被用于植物原料的生物煉制，生產(chǎn)高附加值的生物基質(zhì)產(chǎn)品。在食品工業(yè)中，轉(zhuǎn)化酶被用于生產(chǎn)反式糖，淀粉酶被用于生產(chǎn)麥芽糊精；在造紙和紙漿工業(yè)、洗滌劑制造工業(yè)中，纖維素酶常被用于棉織物的洗滌，通過去除微纖維以保持織物的色澤［2］。此外，一些糖基水解酶具有轉(zhuǎn)糖基能力，用于合成低聚糖和糖苷，例如低聚半乳糖（由β-半乳糖苷酶合成）和辛基葡萄糖苷（由β-glucosidase合成）。糖基水解酶還可以降解微生物生物膜胞外聚合物（EPS）的基質(zhì)多糖，提高抗生素效力，增強宿主免疫功能［3，4］。除了降解植物多糖外，它們還在抗菌防御機制（溶菌酶）、正常細胞功能（通過甘露糖苷酶合成N-連接糖蛋白）、病毒神經(jīng)氨酸酶的發(fā)病機制中發(fā)揮作用［5，6］。

本研究以芽孢桿菌糖基水解酶GH489的基因為研究對象，通過構(gòu)建GH489重組蛋白表達載體、對GH489重組蛋白進行表達和純化，測定其殺螨活性，為全面認識和了解芽孢桿菌糖基水解酶的生物活性、進一步豐富芽孢桿菌糖基水解酶的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

貝萊斯芽孢桿菌NBIF-256、pColdII冷休克載體、Escherichia coli DH5α以及Escherichia coli BL21（DE3）菌種均來源于湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心。

1.2 試劑

質(zhì)粒DNA小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒均購自Omega公司；Nde I、Xba I限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；TransStart? FastPfu DNA聚合酶、PCR SuperMix均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；dNTPS、T4 DNA連接酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；Ni-NTA 6FF預裝重力柱購自生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉等常規(guī)分析純試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器

Gel Doc EZ凝膠成像儀、PCR儀均購自Bio-Rad 公司；UV 2450型紫外可見分光光度計購自島津公司；無菌超凈工作臺購自蘇凈安泰公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自恒豐醫(yī)療器械有限公司。

1.4 GH489重組表達載體及重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)貝萊斯芽孢桿菌NBIF-256糖基水解酶GH489（WP_032873382.1）編碼基因序列設計引物gh489-F和gh489-R（表1）。以貝萊斯芽孢桿菌NBIF-256基因組DNA為模板，用引物gh489-F和gh489-R擴增gh489基因。PCR反應體系：5×FastPfu PCR buffer 5.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.5 μL，模板DNA（10 ng/μL）1.0 μL，上下游引物gh489-F和gh489-R（10 μmol/L）各1.0 μL，添加ddH2O至終體積為25 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸2 min，共計30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。純化回收PCR產(chǎn)物后，用Nde I和Xba I雙酶切處理后回收酶切DNA片段，同時將表達質(zhì)粒pColdII用相同方法酶切處理后回收純化。利用T4 DNA連接酶連接處理過的DNA片段與載體片段，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取抗性單菌落進行菌落PCR驗證，初步確定為陽性克隆子后，抽提質(zhì)粒并測序，保存測序正確的重組表達質(zhì)粒pColdII-gh489。

將重組表達質(zhì)粒pColdII-gh489轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR鑒定以及測序鑒定后，保存測序正確的菌種，將其命名為Escherichia coli BL21（DE3）/pColdII-gh489。

1.5 GH489重組蛋白在大腸桿菌中的誘導表達

將Escherichia coli BL21（DE3）/pColdII-gh489菌株接種至含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)12 h后，以5%的接種量接種至含100 μg/mL氨芐青霉素的50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)至OD 600 nm為0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃ 220 r/min誘導培養(yǎng)12 h。4 ℃ 8 000 r/min收集菌體，用20 mL裂解緩沖液洗滌菌體1次，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，再用20 mL裂解緩沖液將菌體重懸，超聲波破碎后，4 ℃ 8 000 r/min離心30 min，收集上清液得到粗酶液，SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。

1.6 GH489重組蛋白的純化

按照Ni-NTA 6FF預裝重力柱（5 mL柱體積）說明書操作，進行GH489重組蛋白的純化。放空預裝重力柱中的儲存液，加入2倍柱體積的裂解緩沖液平衡Ni-NTA介質(zhì)。將收集的蛋白粗酶液利用0.22 μm過濾器過濾，隨后轉(zhuǎn)入重力柱中，控制流速0.5 mL/min；向重力柱加入2倍柱體積的洗滌緩沖液（咪唑濃度10 mmol/L），控制流速0.5 mL/min，洗去雜蛋白；用10 mL洗脫緩沖液洗脫帶組氨酸標簽的目的蛋白，以每管1.5～2.0 mL裝液量分管收集流出液。利用SDS-PAGE對洗脫后的蛋白進行電泳檢測。利用Thermo Scientific Slide-A-Lyzers?蛋白透析盒對重組蛋白GH489進行透析處理，將載有目的蛋白的透析盒放入PBS緩沖液中，每隔1 h更換新的PBS緩沖液，4 ℃透析8 h，收集透析后的蛋白溶液，即獲得純化的GH489重組蛋白。

1.7 GH489重組蛋白的殺螨活性測定

采用玻片浸漬法對純化的GH489重組蛋白進行室內(nèi)二斑葉螨的毒殺活性測定，具體操作如下：選取行動活潑、大小一致的成螨個體，將其背部通過雙面膠黏附于載玻片的一端，生化培養(yǎng)箱中放置3 h后鏡檢剔除死亡、受傷與不活潑個體，保證每個玻片上活蟲數(shù)大于30頭。將上述帶螨玻片的一端浸于藥液（5～7個濃度梯度的GH489重組蛋白液或PBS緩沖液）內(nèi)5 s，取出并用濾紙吸干殘留藥液。置于生化培養(yǎng)箱中，定時鏡檢觀察試驗結(jié)果。用毛筆輕觸螨體觀察其反應，以螨足不動為死亡標準，統(tǒng)計各處理組的成螨死亡情況。每個處理設置3個重復。以浸漬PBS緩沖液作為空白對照組，計算各組的死亡率、校正死亡率，公式如下：

M =a/b ? ? ? ? ? ? ?（1）

式中，M為死亡率，%；a為死亡蟲數(shù)，頭；b為供試總蟲數(shù)，頭。

Mcorrected =（Mtest-Mcontrol）/（1-Mcontrol） ? ? ? （2）

式中，Mcorrected為校正死亡率，%；Mtest為處理組死亡率，%；Mcontrol為對照組死亡率，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌表達質(zhì)粒pColdII-gh489的構(gòu)建

利用引物gh489-F和gh489-R克隆得到糖基水解酶gh489基因編碼序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測gh489基因的PCR產(chǎn)物，如圖1a所示，1 500 bp處顯示出特異條帶，片段大小與預期相符（1 513 bp）。gh489片段雙酶切回收產(chǎn)物與pColdII載體、T4 DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH5α，抽提質(zhì)粒并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1b所示。重組質(zhì)粒測序，目的片段區(qū)域沒有發(fā)生突變，重組質(zhì)粒pColdII-gh489構(gòu)建完成。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21（DE3），獲得重組表達菌株Escherichia coli BL21（DE3）/pColdII-gh489。

2.2 GH489重組蛋白的表達與純化

預測GH489重組蛋白的分子質(zhì)量約為57 kDa，利用SDS-PAGE電泳檢測工程菌株Escherichia coli BL21（DE3）/pColdII-gh489的IPTG誘導表達產(chǎn)物。結(jié)果表明，由大腸桿菌表達的GH489重組蛋白主要以可溶性形式存在于上清液中，在細胞破碎沉淀物中含一些雜蛋白（圖2a）。純化后的GH489重組蛋白的分子質(zhì)量約為57 kDa，符合預測結(jié)果（圖2b）。純化后的GH489重組蛋白經(jīng)考馬斯亮藍法分析，其濃度約為313 μg/mL。

2.3 GH489重組蛋白的殺螨活性

按照上述試驗步驟，利用SPSS 26.0數(shù)據(jù)處理軟件計算，純化的GH489重組蛋白懸液對二斑葉螨24、48 h的滅螨活性結(jié)果見表2。處理24 h后，GH489重組蛋白殺蟲概率模型方程為y=-3.811+2.573x（變量x使用底數(shù)為10的對數(shù)進行轉(zhuǎn)換），Pearson模型擬合優(yōu)度檢驗（x2=6.193，P=0.185）表明模型擬合良好，半致死濃度（LC50）為30.296 μg/mL。處理48 h后，GH489殺蟲概率模型方程為y= -2.757 + 2.078x（變量x使用底數(shù)為10的對數(shù)進行轉(zhuǎn)換），Pearson模型擬合優(yōu)度檢驗（x2=2.222，P=0.695）表明模型擬合良好，半致死濃度（LC50）為21.212 μg/mL。結(jié)果表明，芽孢桿菌糖基水解酶GH489具有良好的殺螨活性。

3 小結(jié)與討論

二斑葉螨是一種重要的世界性經(jīng)濟害螨，危害多種作物，具有成熟期短、繁殖率高和活動范圍小等特點［7］。傳統(tǒng)的殺螨劑主要為化學殺螨劑，如喹螨唑、唑螨酯、噠螨靈、吡螨胺、螺螨酯和擬除蟲菊酯類殺螨劑，化學藥劑的大量且重復、長期使用，不僅會殺死大量的害螨天敵和其他有益生物，同時也使二斑葉螨產(chǎn)生了嚴重的抗藥性［8］。為了減少化學藥劑帶來的負面影響，從自然環(huán)境和天然產(chǎn)物中挖掘低毒、安全、環(huán)境友好型農(nóng)藥是目前新農(nóng)藥開發(fā)的一個重要策略［9］。植物源殺螨劑的發(fā)掘和應用逐漸成為國內(nèi)外綠色農(nóng)藥領域的研究熱點之一。很多植物精油及相關成分對螨蟲和其他害蟲具有廣譜活性，被認為是潛在的植物保護劑，可用于田間害蟲管理。植物源農(nóng)藥具有低毒、低殘留等優(yōu)點，對害蟲最有效的精油通常具有植物毒性［10］。在試驗條件下，球孢白僵菌和金龜子綠僵菌顯示出對多種螨蟲的致病性［11，12］，被認為具有應用潛力。然而，由于批量生產(chǎn)困難，或在室外條件下對螨蟲的感染效率低、持久效力差，大多數(shù)治螨微生物制劑未能實現(xiàn)商業(yè)化使用。因而人們?nèi)匀辉诓粩嗵剿骱秃Y選新的治螨微生物資源。

鑒于芽孢桿菌屬細菌能產(chǎn)生多種蛋白酶，本研究以芽孢桿菌糖基水解酶GH489為研究對象，探究其殺螨活性。研究表明，在室內(nèi)條件下芽孢桿菌糖基水解酶GH489具有良好的殺螨活性，該結(jié)果將進一步豐富人們對于芽孢桿菌糖基水解酶功能的認識。后續(xù)需要進一步建立GH489重組蛋白的田間施用方案，實現(xiàn)該蛋白在農(nóng)作物螨蟲防治上的應用。

參考文獻：

［1］ SHRIVASTAVA S. Industrial applications of glycoside hydrolases［M］. Singapore：Springer， 2020.

［2］ LINARES-PASTEN J， ANDERSSON M， KARLSSON E. Thermostable glycoside hydrolases in biorefinery technologies［J］. Current biotechnology， 2014， 3（1）：26-44.

［3］ FLEMING D， RUMBAUGH KP. Approaches to dispersing medical biofilms［J］. Microorganisms， 2017， 5（2）： 5020015.

［4］ FLEMING D， CHAHIN L， RUMBAUGH. Glycoside hydrolases degrade polymicrobial bacterial biofilms in wounds［J］. Antimicrobial agents & chemotherapy， 2017， 61（2）：e01998-16.

［5］ BOURNE Y， HENRISSAT B. Glycoside hydrolases and glycosyltransferases： Families and functional modules［J］. Current opinion in structural biology， 2001， 11（5）：593-600.

［6］ HENRISSAT B， DAVIES G. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases［J］. Current opinion in structural biology， 1997， 7（5）：637-644.

［7］ 王 丹. 姜黃素對朱砂葉螨幾丁質(zhì)酶活性及基因表達的影響［D］.重慶：西南大學， 2016.

［8］ 藍華國， 莫朝龍. 柑橘病蟲害綠色防控技術(shù)［J］. 世界熱帶農(nóng)業(yè)信息， 2021 （6）： 66-68.

［9］ 陳萬浩. 二斑葉螨類酵母共生菌和蛛生真菌的分子鑒定及遺傳多樣性［D］. 貴陽：貴州大學， 2017.

［10］ ISMAN MB. Plant essential oils for pest and disease management［J］. Crop protection， 2000， 19（8-10）：603-608.

［11］ SREENIVAS AG， RAMANUJAM BR， MOHANRAJ P， et al. Efficacy of entomopathogenic fungi against red spider mite Tetranychus neocalodonicus Zacher （Acarl： Tetranychidae）［J］. Karnataka journal of agricultural sciences， 2010， 18（4）：192052.

［12］ SANJAYA Y， OCAMPO V， CAOILI B. Entomopathogenic characterization of Beauveria bassiana fungi against Tetranychus kanzawai （Kishida） （Tetranychidae： Acarina） spider mite by its region［J］. Thai journal of pharmaceutical sciences，2014， 47：13-21.