絨毛白蠟嫩枝扦插生根的解剖學特征與內源激素變化

王因花，燕麗萍，孔雨光，吳德軍，任 飛，梁 靜

（1. 山東省林業(yè)科學研究院 山東省林木遺傳育種重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山東省國土空間規(guī)劃院，山東 濟南 250014）

絨毛白蠟Fraxinusvelutina為木犀科Oleaceae白蠟屬Fraxinus植物，落葉喬木，是我國北方重要的用材、防護及園林觀賞樹種，因其抗逆性強，適應范圍廣而得到廣泛栽培利用。黃河三角洲作為環(huán)渤海經濟發(fā)展的重要組成部分，其土壤鹽堿化問題突出，生態(tài)環(huán)境十分脆弱，亟待開發(fā)利用。絨毛白蠟具有優(yōu)異的耐鹽性且壽命長，在鹽堿地改良和生態(tài)建設中有很好的應用前景。近年來，我國已選育出諸多生長性狀良好、觀賞性、抗逆性更強的絨毛白蠟優(yōu)良品種[1-2]，但良種資源的規(guī)模化與普及程度低，苗木供應不足，已成為其產業(yè)化發(fā)展的瓶頸。

絨毛白蠟是從美國引進的雌雄異株物種[3]，種子繁殖不能保留雙親的優(yōu)良特性，因此需要無性繁殖技術進行良種培育。扦插繁殖因其操作簡單，是林木無性品種在林業(yè)生產中推廣利用的主要繁殖方式。研究表明，絨毛白蠟嫩枝扦插適宜在溫濕度可控的溫室內進行，經NAA 處理后的嫩枝生根率可達100%[4]；磁化水處理可極大提高絨毛白蠟嫩枝扦插的生根率和根系效果指數(shù)[5]；植物生長調節(jié)劑處理影響插穗生根率[6]，其中，IBA 和NAA 對白蠟嫩枝扦插生根的促進作用較為顯著[7]。

目前，我國白蠟嫩枝扦插技術已取得一定突破，生根率顯著提高，但絨毛白蠟良種嫩枝扦插生根機理尚無系統(tǒng)研究。鑒于此，本研究對絨毛白蠟嫩枝扦插過程中的形態(tài)解剖特征進行觀察，分析內源激素含量變化，探討絨毛白蠟嫩枝扦插的生根機制，以期為深入研究絨毛白蠟扦插生根機理提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材 料

7 月份，采集絨毛白蠟2 ～3 年生母樹上的半木質化穗條，長度為8 ～10 cm。插穗的下切口呈45°斜剪，上切口平剪，每個插穗保留2 片復葉。扦插基質由椰糠、珍珠巖、蛭石按體積比7∶2∶1配制而成。扦插前24 h 將基質澆透水，并用800倍多菌靈溶液消毒。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

以200 mg·L-1IBA 浸泡20 min 為處理組，清水浸泡為對照組，每個處理50 個插穗，重復5 次。其中2 個重復用于切片制作及激素測定，3 個重復用于生根指標調查。

1.2.2 扦插及插后管理

試驗于2021 年7 月份在配有自動噴霧和降溫設施的塑料大棚內進行，棚內溫度控制在30 ～45 ℃，濕度控制在90%以上。插穗處理完畢后，隨即扦插。扦插完成后立即澆透水，并將插孔周圍的基質壓實。

1.2.3 生根調查

扦插后第40 天，調查生根率、不定根數(shù)量及不定根長。

1.2.4 取樣及切片制作

以處理組的插穗為樣品，扦插當天取樣1 次，之后每隔7 d 取樣1 次，直至生根為止。截取插穗基部1 cm 處莖段，置于70% FAA 固定液固定24 h 以上。經脫水、包埋后，用石蠟切片機（型號RM2016）切片，切片厚3 μm，番紅固綠染色，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，Olympus 顯微鏡觀察。

1.2.5 內源激素測定

以處理組和對照組的插穗為樣品：扦插后的第0、10、20、30、40 d 隨機抽取插穗基部1 cm處的韌皮部1.0 g 左右，重復3 次，用錫紙包好后立即放入液氮中冷凍保存。用ELISA 法進行IAA、ABA、ZR 及GA3含量測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016 補充版本進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，SPSS 23.0 軟件進行方差分析與多重比較。

2 結果與分析

2.1 絨毛白蠟扦插生根指標調查

扦插后第40 天對處理組和對照組的生根率、不定根數(shù)量及不定根長度進行統(tǒng)計分析，結果見表1。結果表明，對照組的生根率為80.7%，處理組的生根率為96.7%，兩者之間差異顯著（P＜0.05）；對照組的總根數(shù)平均為7.7 條，不定根長度平均為6.2 cm，而處理組的總根數(shù)平均為8.2 條，不定根長度平均為7.8 cm，對照組和處理組的總根數(shù)、不定根長度之間在統(tǒng)計學上無顯著差異。由此可見，外源IBA 顯著提高了絨毛白蠟的嫩枝扦插生根率。

表1 對照組和處理組扦插生根指標分析?Table 1 Analysis of cutting rooting indexes of CK and treatment group

2.2 絨毛白蠟扦插生根過程觀察

以處理組的插穗為材料，取樣過程中同時進行插穗外部形態(tài)觀察。扦插后第7 天，插穗切口處已有少量白色愈傷組織形成；第14 天，韌皮部與木質部之間被愈傷組織充滿；第21 天，愈傷組織繼續(xù)膨大，尚未觀察到不定根生成；第28 天，有少部分插穗在切口處的皮部長出幼嫩的乳白色根系，此后插穗開始陸續(xù)生根；第40 天，大部分插穗已生根。經觀察，絨毛白蠟為皮部生根類型，具體情況見圖1。

圖1 絨毛白蠟生根過程Fig. 1 Rooting process of F. velutina

2.3 絨毛白蠟生根解剖結構研究

扦插前絨毛白蠟的莖橫切面結構見圖2a。由圖2a 可以看出，絨毛白蠟的橫切面結構由外到內可分為表皮、皮層、韌皮部、形成層、木質部、髓六部分。表皮的最外層為緊密排列的柱狀細胞，往內由2 ～3 層長方形細胞排列而成，表皮染色顏色較深。表皮內部是由數(shù)層薄壁細胞組成的皮層，皮層細胞形狀不規(guī)則，排列較疏松；從皮層向內部看，有一圈團狀的韌皮纖維，但韌皮纖維不是連續(xù)的；韌皮纖維內部依次為韌皮部、維管形成層、木質部和髓。經過多張橫面段結構圖的觀察，在絨毛白蠟莖段中未發(fā)現(xiàn)根原基。

圖2 絨毛白蠟嫩枝扦插生根過程的解剖結構Fig. 2 Anatomical structure of softwood cutting during rooting process of F. velutina

圖3 扦插生根過程中內源激素的變化情況Fig. 3 Changes in endogenous hormones during the rooting process of cuttings

進一步觀察絨毛白蠟的生根過程發(fā)現(xiàn)，扦插生根可以大致分為根原始細胞的形成和分化、根原基的形成以及不定根的表達3 個階段。圖2a 為扦插前絨毛白蠟莖的橫切面結構。扦插第14 天左右，觀察到靠近維管形成層的韌皮部薄壁細胞分生形成根原始細胞團（圖2b），根原始細胞團不斷進行分裂；第21 天左右，形成近三角形的根原基（圖2c），根原基朝著皮層方向生長，并從韌皮纖維間隙處到達皮層；第28 天左右，突破種皮形成不定根（圖2d）。

扦插后第7 天左右，插穗切口處的韌皮部和木質部之間開始形成愈傷組織，愈傷組織不斷生長，直至充滿整個切口，但在愈傷組織內并未發(fā)現(xiàn)根原基（圖2e）。愈傷組織的形成可以保護插穗免受病菌進入，從而降低插穗腐爛率。

2.4 嫩枝扦插生根過程中的內源激素變化情況

圖3 為扦插生根過程中內源激素IAA、GA3、ZR 及ABA 的變化情況。由圖3a 可以看出，從扦插開始，處理組和對照組的IAA 含量始終處于上升趨勢，尤其是在不定根形成期，IAA 含量大幅上升，且處理組的IAA 含量始終高于對照組的IAA 含量，至扦插第40 天，處理組的IAA 含量比扦插前提高了20.3%，對照組的IAA 含量比扦插前提高了11.1%。

圖3b 為處理組和對照組的GA3含量變化情況?？梢钥闯觯幚斫M和對照組的GA3含量呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。自扦插開始至第30 天，處理組的GA3含量逐漸下降，第30 天降至最低，而后逐漸升高；對照組的GA3含量變化趨勢則恰好相反，自扦插開始至第30 天，對照組的GA3含量持續(xù)升高，第30 天后達到峰值，而后逐漸降低。總體來看，對照組的GA3含量始終高于處理組的GA3含量。

圖3c 為處理組和對照組的ZR 含量變化情況?？梢钥闯?，處理組的ZR 含量也是以扦插的第30天為分界點，30 天內其ZR 含量逐漸上升，第30天達到峰值，而后逐漸下降；對照組的ZR 含量則一直處于上升狀態(tài)，前20 天內處理組的ZR 含量高于對照組的ZR 含量，20 天后對照組的ZR 含量則高于處理組的ZR 含量。

圖3d 為處理組和對照組的ABA 含量變化情況?？梢钥闯?，處理組的ABA含量變化趨勢較復雜，呈現(xiàn)出上升—下降—上升的趨勢，對照組的ABA含量則是先下降然后持續(xù)上升，且處理組的ABA含量始終高于對照組的ABA 含量。

3 討 論

3.1 外源IBA 對絨毛白蠟嫩枝扦插生根指標的影響

植物生長調節(jié)劑在提高扦插生根率方面發(fā)揮著重要作用，尤其對于難生根的樹種，其效果更為顯著[8]。路斌等[9]研究了IBA、IAA、NAA 對金葉白蠟扦插生根率的影響，結果表明3 種生長調節(jié)劑都可顯著提高金葉白蠟的生根率和生根數(shù)，其中以IAA 和IBA 的混合液效果最好，可顯著提高插穗體內SOD、POD 及PPO 酶的活性，有利于插穗生根。本研究中，對照組的生根率為80.7%，處理組的生根率為96.7%，兩者之間差異顯著，說明IBA 的使用顯著提高了絨毛白蠟嫩枝扦插的生根率，這與何立在對節(jié)白蠟的相關研究中得出的結論相同[7]，但對照組與處理組在不定根數(shù)量和不定根長度方面并無統(tǒng)計學上的顯著差異。

3.2 絨毛白蠟嫩枝扦插的解剖學研究

植物的莖是扦插材料中應用最廣泛的一種，其結構與植物的生根能力密切相關[10-11]，因此，莖的解剖結構、根原基類型及生根類型是扦插解剖學的研究重點[12]。

絨毛白蠟的莖段結構主要包括周皮、皮層、韌皮部、形成層、木質部和髓，其中在皮層與韌皮部之間存在環(huán)狀的韌皮纖維。有研究認為，韌皮纖維會對根原基的生長形成物理阻礙，進而導致生根困難[13]，但也有人指出，只要該層厚壁組織不是處于連續(xù)狀態(tài)，則較易產生不定根[14-15]。本研究中，絨毛白蠟莖的解剖結構中雖然存在韌皮纖維，但該層纖維組織并不連續(xù)，而是和薄壁細胞組織相間排列，從而在一定程度上減少了不定根發(fā)生、生長的阻力。

在植物的扦插生根過程中，不定根的起源可分為潛伏根原始體和誘生根原始體[16]。潛伏根原始體是指在植物體內休眠的根原始細胞，當離體植物材料被置于適宜的環(huán)境條件下時，潛伏根原始體將恢復分裂能力并逐步發(fā)育成為不定根。而誘生根原始體則是指在植物體內本來不存在的根原始細胞，于特定條件下扦插后被誘導形成，例如朝鮮崖柏、草原櫻桃、韃靼忍冬等[17-19]。本研究在絨毛白蠟當年生莖的解剖結構中未發(fā)現(xiàn)根原基的存在，而是扦插后才形成根原基，說明絨毛白蠟的生根類型為誘導生根型。

根原基可來源于愈傷組織[20]、髓射線細胞[21]、維管形成層、韌皮薄壁細胞、葉隙薄壁組織細胞等[22]。通過對絨毛白蠟生根過程進行觀察，發(fā)現(xiàn)其根原基起始于緊鄰形成層的韌皮部薄壁細胞，在其他位置尚未觀察到根原基的存在。

根據(jù)不定根的生長位置可以分為皮部生根、愈傷組織生根以及混合生根等類型。魯?shù)さ萚23]研究發(fā)現(xiàn)，紅愷木屬于混合生根類型，以皮部生根為主，兼有少量愈傷組織生根；周容濤等[24]研究了歐美雜種山楊的不定根發(fā)育的解剖結構，認為其屬于皮部生根類型。本研究中，絨毛白蠟的切口處雖然形成了較多的愈傷組織，但在愈傷組織內未見根原始細胞，說明絨毛白蠟愈傷組織的形成與不定根的發(fā)生是兩個相互獨立的過程[25-26]，但愈傷組織在一定程度上保護絨毛白蠟的插穗不受病菌感染[27]，降低了插穗腐爛率，對不定根的形成有一定的保護和促進作用。但應注意的是，如果愈傷組織過于發(fā)達而過度爭取插穗內的營養(yǎng)成分，并不利于不定根的形成。經觀察發(fā)現(xiàn)，絨毛白蠟的根原基發(fā)源于維管形成層附近的韌皮薄壁細胞，為皮部生根類型。

3.3 絨毛白蠟嫩枝扦插生根過程中內源激素變化

不定根的生成是受多種內源激素共同調控的復雜過程。隨著植物扦插生根機理的深入研究，人們對生長激素在促進不定根生成中的作用有了更加明確的認識，其中生長素被認為對不定根的生長發(fā)育起到核心作用[28]。敖紅等[29]研究了內源激素與長白落葉松扦插生根率的關系，發(fā)現(xiàn)IAA含量高的插穗具有明顯較高的生根率，該研究還指出，IAA 在促進不定根形成的過程中發(fā)揮兩個重要作用：一是刺激酶系統(tǒng)的活躍，增強呼吸作用和代謝作用，同時促進細胞分化形成愈傷組織；二是使插穗內部的營養(yǎng)物質集中到插穗切口處，從而有利于生根。韓華[30]在分子水平上對雜種落葉松的扦插生根進行了研究，發(fā)現(xiàn)能量代謝調控和信號傳導調控是調控插穗不定根發(fā)生的兩個重要方面，并且鑒定出與生長素信號轉導有關的兩種蛋白。本研究中，處理組和對照組的IAA 含量始終處于上升趨勢，尤其是在不定根生長期，IAA含量大幅提高，說明IAA 與絨毛白蠟不定根的形成和生長密切相關，該結果與在菊花、歐洲云杉、珍珠黃楊等植物中的研究結果一致[31-33]。另外，處理組的IAA 含量始終高于對照組，說明外源IBA 的使用可以有效提高插穗體內的IAA 含量，更有利于促進插穗生根。

許多研究表明，細胞分裂素和赤霉素類在植物的扦插生根中起到抑制作用[34-35]，但不能一概定論，不同樹種可能存在不同的激素作用機理差異。李朝嬋等[36]在對長蕊杜鵑的研究中發(fā)現(xiàn)，GA3含量與不定根的形成正相關；李永欣等[37]研究了光皮樹扦插生根過程中內源激素的變化情況，認為低濃度的ZR 有利于根原基的分化，高濃度的ZR 有利于根原基生長發(fā)育；韓繼紅等[38]則認為ZR 有利于無患子硬枝扦插的根原基和不定根生成。本研究中，處理組的GA3含量在扦插期的前30 天內持續(xù)下降，此階段正是不定根的形成發(fā)育期，說明GA3含量降低有利于絨毛白蠟根原基的生成和發(fā)育；30 天后其GA3含量升高，有利于不定根的伸長生長。而對照組的GA3含量變化趨勢恰好與處理組相反，說明外源IBA 的使用對插穗體內的GA3變化有一定的影響。處理組的ZR 含量在愈傷組織形成期和根原基形成期上升，在不定根生長期則開始下降，說明高濃度的ZR 有利于絨毛白蠟根原基的形成，低濃度則有利于不定根的生長，這與人們在珍珠黃楊、光皮樹中得出的結論較一致[30,35]。通過觀察GA3 和ZR 的含量變化，發(fā)現(xiàn)外源IBA 的使用可以有效調節(jié)插穗內激素含量，使其向促進生根的方向發(fā)展。

很多研究認為ABA 對不定根的生成有抑制作用，但在本研究中，處理組的ABA 含量表現(xiàn)出上升—下降—上升的趨勢，值得注意的是，處理組的ABA 含量始終高于對照組的ABA 含量，說明在絨毛白蠟扦插苗不定根的生成過程中，ABA 并未起到抑制作用，甚至對不定根的生長有一定的促進作用。楊雪萌等[31]在菊花扦插的研究中也得到了類似的結果，但ABA 的具體作用機制尚待更加深入開展研究。

植物的扦插生根是一個極其復雜的生理過程，除本研究所涉及的解剖結構和內源激素外，其他因素如植物體內氧化酶的活性、可溶性糖、可溶性蛋白、碳氮化合物等營養(yǎng)物質含量及相關基因的表達調控都與根原基的形成密切相關[39]。在后續(xù)的研究中，應深入探索影響因子的代謝與調控，以對白蠟生根機理獲得更加全面的認識[40]。此外，本研究僅觀察到了皮部生根類型，對于白蠟屬其他植物是否存在愈傷生根現(xiàn)象以及愈傷生根的機理等問題，也需要進一步深入研究。

4 結 論

絨毛白蠟的生根類型為誘導生根型，根原基發(fā)源于維管形成層附近的韌皮薄壁細胞，為皮部生根類型。IAA 與絨毛白蠟不定根的形成和生長密切相關，外源IBA 的使用可以有效調節(jié)插穗體內的IAA、GA3和ZR 含量，更有利于促進插穗生根。ABA 對絨毛白蠟的扦插生根沒有抑制作用，但其作用機理尚待更加深入開展研究。