外切體復(fù)合物基因3在肝癌中的預(yù)后價(jià)值及其免疫相關(guān)性*

孟志勇 范玉純 吳 桐 黎韻琪 彭小花 蔣利和, 陳 闖,△

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 (廣西 南寧, 530000) 2.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院 3.右江民族醫(yī)學(xué)院 4.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤,是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),中國每年約有38.3萬人死于肝癌,占全球肝癌死亡人數(shù)的51%[2]。HCC的主要危險(xiǎn)因素包括乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、飲酒和非酒精性脂肪性肝病[3]。早期HCC患者首選治愈性治療,包括手術(shù)切除(部分肝切除術(shù))或移植,但由于術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高,HCC患者的預(yù)后仍不理想[4,5]。因此,尋找高效的生物標(biāo)志物及藥物靶點(diǎn)可更好預(yù)測(cè)治療效果及提高療效。

外切體復(fù)合物基因3(EXOSC3)是一種具有3′-5′外核糖核酸酶活性的復(fù)合物,該基因編碼人類外泌體的非催化組分,在許多RNA加工和降解活動(dòng)中發(fā)揮作用[6]。研究表明,EXOSC3的突變?cè)谀X橋小腦發(fā)育不全等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[7]。然而,EXOSC3在HCC中的作用卻鮮有研究。本研究通過生物信息學(xué)方法分析EXOSC3在HCC中的表達(dá)、預(yù)后關(guān)系,并探討其調(diào)控HCC的潛在機(jī)制及與免疫細(xì)胞的相關(guān)性,以期為HCC的臨床診斷和預(yù)后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 在癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/)[8]和國際癌癥基因組聯(lián)盟(ICGC)數(shù)據(jù)庫(https://dcc.icgc.org)中下載HCC患者的基因表達(dá)譜及相應(yīng)的臨床病理數(shù)據(jù)。最終在TCGA數(shù)據(jù)庫中納入374例HCC患者作為訓(xùn)練隊(duì)列,在ICGC數(shù)據(jù)庫中納入了243例HCC患者作為驗(yàn)證隊(duì)列。

TCGA和ICGC向公眾開放,所有數(shù)據(jù)都已同意用于分析,并獲得了道德認(rèn)可。本研究基于開源數(shù)據(jù),嚴(yán)格遵守?cái)?shù)據(jù)庫的發(fā)布指南和訪問策略,不受其他道德規(guī)范的約束。

1.2 EXOSC3在HCC中的差異分析 運(yùn)用TIMER 2.0(http://timer.cistrome.org/)數(shù)據(jù)庫[9]分析EXOSC3在泛癌中的差異表達(dá)。來自TCGA數(shù)據(jù)庫和ICGC數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分別用作訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列,R軟件“l(fā)imma”包用于計(jì)算差異表達(dá)基因(DEG),并通過“ggplot2”包繪制箱式圖進(jìn)行可視化處理。

1.3 EXOSC3的表達(dá)與HCC患者的預(yù)后分析 以TCGA數(shù)據(jù)庫作為訓(xùn)練隊(duì)列,ICGC數(shù)據(jù)庫作為驗(yàn)證隊(duì)列,通過Kaplan-Meier 曲線評(píng)估EXOSC3對(duì)HCC患者總生存期的影響。以EXOSC3表達(dá)值的中位值為標(biāo)準(zhǔn),將HCC患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組。通過“survival”包對(duì)高低表達(dá)組的生存差異進(jìn)行比較,P<0.001為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 EXOSC3的表達(dá)與肝癌患者的臨床相關(guān)性分析 通過R軟件利用Logistic回歸分析EXOSC3的表達(dá)與HCC患者臨床分期的相關(guān)性,包括年齡、性別、分級(jí)、分期及TNM分期,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 共表達(dá)基因及功能富集分析 運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫,以相關(guān)性系數(shù)>0.6,P<0.001為標(biāo)準(zhǔn),通過R軟件分析EXOSC3在HCC患者中的共表達(dá)基因。我們通過“clusterProfiler”包對(duì)篩選到的共表達(dá)基因進(jìn)行基因功能本體注釋(GO)、生物進(jìn)程(BP)和京都基因百科全書(KEGG)通路富集分析,P<0.05,FDR<0.1為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 EXOSC3的表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析 通過TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫分析EXOSC3的表達(dá)與6種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的相關(guān)性。此外,我們通過R軟件使用CIBERSORT[10]進(jìn)一步分析了在肝癌中EXOSC3的表達(dá)與免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答的關(guān)系,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 EXOSC3的表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)及免疫治療療效的相關(guān)性分析 運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫,通過R軟件分析EXOSC3的表達(dá)與HCC中免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性,P<0.001為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC患者免疫治療的相關(guān)信息,比較EXOSC3高低表達(dá)組患者與免疫表型評(píng)分(ips)的相關(guān)性,評(píng)估EXOSC3的高低表達(dá)對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制治療的反應(yīng),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng) 3種HCC細(xì)胞株(HepG2,MHCC97H,Huh-7)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所,人正常肝組織細(xì)胞L02受贈(zèng)于廣西大學(xué)吳黎川老師。所有細(xì)胞使用伴有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并放置于含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。

1.9 RNA提取和定量實(shí)時(shí)PCR 根據(jù)試劑說明書進(jìn)行總RNA提取,并通過Thermo Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄cDNA。所有的定量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)通過Roche FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)完成。最終通過2-ΔΔCt方法定量分析相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物(中國,上海)合成,包括GAPDH(F:5′-GGACCTG-ACCTGCCGTCTAG-3′;R:5′-GTAGCCC-AGGATGCCCTTGA-3′)和EXOSC3(F:5′-CGTTGAGCCTGAAT-GCTAGAG-3′;R:5′-GCT-GAGAGTCCACCCAGTAAA-3′)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R4.0.4軟件和SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EXOSC3在泛癌中的表達(dá) EXOSC3在大部分腫瘤組織中高表達(dá),尤其在HCC中,EXOSC3的表達(dá)顯著升高(圖1)。

圖1 EXOSC3在泛癌中的差異表達(dá)

2.2 EXOSC3在HCC組織中的表達(dá) 在TCGA隊(duì)列和ICGC隊(duì)列中,EXOSC3在HCC中的表達(dá)量都顯著高于正常組織(圖2A,B)。

此外,通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證EXOSC3在3種肝癌細(xì)胞(HepG2,MHCC97H,Huh-7)及人正常肝組織細(xì)胞L02中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常肝細(xì)胞L02相比,EXOSC3的表達(dá)水平在3種肝癌細(xì)胞中均明顯升高(P<0.001,圖2C)。

2.3 EXOSC3的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)性 Kaplan-Meier生存分析顯示,在TCGA訓(xùn)練隊(duì)列中,EXOSC3高表達(dá)HCC患者的總生存期(OS)明顯低于低表達(dá)患者(P<0.001,圖3A)。在ICGC驗(yàn)證隊(duì)列中,EXOSC3高表達(dá)的HCC患者OS明顯低于低表達(dá)患者(P=0.03,圖3B)。

圖3 EXOSC3在HCC中的預(yù)后價(jià)值

2.4 EXOSC3的表達(dá)與肝癌患者的臨床相關(guān)性 Logistic回歸分析結(jié)果表明,EXOSC3的表達(dá)與HCC患者的年齡、分級(jí)、分期及T分期顯著相關(guān)(P<0.05),與患者的性別、N分期及M分期無關(guān)(圖4)。

2.5 共表達(dá)基因及相關(guān)通路分析 運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫通過R軟件分析EXOSC3的共表達(dá)基因,最終篩選出差異顯著(r>0.6,P<0.001)的共表達(dá)基因166個(gè)。為了探究EXOSC3相關(guān)的生物進(jìn)程和通路,我們對(duì)篩選的共表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。結(jié)果顯示,這些共表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、mRNA代謝等生物進(jìn)程(圖5A)。KEGG分析主要富集在細(xì)胞周期、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA復(fù)制、信號(hào)通路等(圖5B)。

圖5 基于共表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

2.6 EXOSC3與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤的關(guān)系 運(yùn)用TIMER數(shù)據(jù)庫分析EXOSC3在HCC中與腫瘤純度調(diào)節(jié)的免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系。結(jié)果顯示,EXOSC3的表達(dá)與B細(xì)胞(r=0.379,P=3.54×1013)、CD8+T細(xì)胞(r=0.368,P=2.09×10-12)、CD4+T細(xì)胞(r=0.279,P=1.45×10-7)、 巨噬細(xì)胞(r=0.404,P=8.71×10-15)、 中性粒細(xì)胞(r=0.386,P=1.13×10-13)、樹突狀細(xì)胞(r=0.449,P=2.71×10-18)具有顯著相關(guān)性(圖6A)。此外,我們通過CIBERSORT進(jìn)一步分析了EXOSC3與免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答的關(guān)系。結(jié)果顯示,EXOSC3的表達(dá)與T細(xì)胞CD4記憶激活(r=0.3,P=0.029)、濾泡輔助T細(xì)胞(r= 0.28,P=0.048)呈現(xiàn)正相關(guān),而與T細(xì)胞CD4記憶休止(r=-0.28,P=0.047)呈負(fù)相關(guān)(圖6)。結(jié)果表明EXOSC3可能通過影響免疫細(xì)胞浸潤及免疫應(yīng)答過程調(diào)控HCC的發(fā)生與發(fā)展過程。

圖6 在HCC中EXOSC3與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤的相關(guān)性

2.7 EXOSC3的表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)及免疫治療療效的相關(guān)性 運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫,我們計(jì)算了EXOSC3與HCC相關(guān)免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性得分,以評(píng)估EXOSC3與相關(guān)免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系。結(jié)果顯示,EXOSC3與CD276的相關(guān)性最高(r=0.37,P=1.43×10-13;圖7)。此外,我們通過ips評(píng)估了EXOSC3的高低表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)抑制治療的療效差異。結(jié)果顯示,在不接受抗程序性細(xì)胞死亡受體(PD-1)與抗CTLA4治療時(shí),EXOSC3低表達(dá)組療效優(yōu)于高表達(dá)組(P=0.031,圖8A)。然而,無論是單獨(dú)抗PD-1或者抗CTLA4治療,亦或者是二者聯(lián)合治療,EXOSC3高低表達(dá)組之間療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8B-D)。

圖7 在HCC中EXOSC3與免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性

圖8 在HCC中EXOSC3的表達(dá)與免疫抑制治療的療效差異

3 討論

作為一種預(yù)后不良的惡性腫瘤,HCC的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后因素研究具有重要意義[11]。據(jù)報(bào)道,EXOSC3的表達(dá)與多種癌癥相關(guān),包括胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等[12-14]。然而,EXOSC3與HCC之間的相關(guān)性尚不清楚。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫與ICGC數(shù)據(jù)庫分析并驗(yàn)證了EXOSC3在HCC中的差異表達(dá)與預(yù)后價(jià)值。結(jié)果顯示,EXOSC3高表達(dá)與HCC患者的生存預(yù)后緊密相關(guān)。

共表達(dá)基因被廣泛應(yīng)用于研究基因功能、蛋白質(zhì)關(guān)系和信號(hào)通路等[15]。在本研究中,我們通過R軟件篩選出166個(gè)與EXOSC3顯著相關(guān)的共表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果顯示,EXOSC3可能主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、p53等信號(hào)通路調(diào)控HCC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

肝臟是新陳代謝、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及免疫監(jiān)視的關(guān)鍵樞紐,被認(rèn)為是免疫耐受的主要部位[16]。近年來,越來越多的證據(jù)揭示了免疫療法對(duì)HCC的重要性[17,18]。靶向抑制途徑的單克隆抗體如PD-1/PD-L1和CTLA-4對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細(xì)胞的治療應(yīng)用,最近已被證明對(duì)肝癌可產(chǎn)生有意義的臨床結(jié)果[19]。我們的結(jié)果表明,EXOSC3可能會(huì)通過影響免疫細(xì)胞浸潤及免疫應(yīng)答過程進(jìn)而調(diào)控HCC的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述,我們明確了EXOSC3在HCC中的高表達(dá)及其對(duì)HCC患者的預(yù)后價(jià)值。EXOSC3作為一種全新的預(yù)后標(biāo)志物,其可能通過影響細(xì)胞周期、p53等信號(hào)通路及免疫細(xì)胞免疫應(yīng)答過程控制TCC的發(fā)展進(jìn)程。盡管我們的研究提供了多層次的證據(jù)來證實(shí)EXOSC3是HCC潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物,這項(xiàng)研究仍然有一些局限性,需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。