基于網絡藥理學和體外實驗探索黃連-大黃-肉桂復方治療肝癌的作用機制*

何佳慧 陳佳悅 陳心怡 劉小美△

1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院 (上海, 201203) 2.上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院

原發(fā)性肝癌是全球高發(fā)病率和致死率的惡性腫瘤之一[1],可分為肝細胞癌(HCC)、肝內膽管癌以及其他罕見類型,其中HCC占病例的75%～85%,是最主要的肝癌類型[2]。在過去幾十年中,HCC臨床治療方面雖取得了一些進展,但因肝癌發(fā)病機制的復雜性以及對化療藥物的耐藥性等,使得其診斷和治療以及預后仍然不能令人滿意。中醫(yī)藥在治療HCC方面具有多途徑、多靶點、多效應優(yōu)勢,是HCC綜合治療體系的重要組成部分,深入挖掘臨床治療肝癌的有效中藥,全面探索其發(fā)揮作用的分子機制,尋找新的治療靶點,對提高HCC的臨床療效顯得尤為重要。黃連-大黃-肉桂復方(RRC)由黃連、大黃和肉桂(9∶3∶1)組成,具有清熱解毒、活血化瘀之功,我們前期的研究已發(fā)現(xiàn)其對HCC小鼠的腫瘤生長和肝癌細胞增殖均具有明顯抑制作用,其中調節(jié)肝癌細胞自噬是其作用機制之一[3-6]。鑒于HCC發(fā)病的復雜性、以及中藥作用的多途徑特點,本研究采用網絡藥理學分析和體外實驗驗證探索RRC治療HCC的復雜作用機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學研究

1.1.1 RRC活性成分與相應靶標的獲取 以“黃連”“大黃”“肉桂”為檢索詞在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(http://tcmsp-e.com/tcmsp.php)中檢索黃連-大黃-肉桂復方所有活性成分。然后篩選出其中口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18的活性成分,并進一步獲取其對應的作用靶點(其中因肉桂各成分的DL均未高于0.18,因此其DL設置為≥0.12)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對上述獲得的作用靶點進行標準化處理及靶點蛋白-基因名的轉換,以備后續(xù)數(shù)據(jù)處理之用。

1.1.2 HCC相關基因的檢索與篩選 在人類基因數(shù)據(jù)庫Genecards(https://www.genecards.org/)中,以“hepatocellular carcinoma”為關鍵詞檢索并下載HCC疾病相關基因,用于后續(xù)分析。

1.1.3 RRC作用靶點與肝癌相關基因的交集 以Venny 2.1網上在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對以上檢索得到的RRC活性成分潛在靶點與HCC相關基因進行交集,并制作韋恩圖。

1.1.4 復方中藥-成分-肝癌靶點網絡圖的構建與分析 將RRC中三味中藥、各自有效成分以及這些成分靶點與HCC疾病交集的基因,導入Cytoscape 3.7.2軟件,構建復方中藥-成分-HCC靶點網絡圖。

1.1.5 GO及KEGG通路的富集分析 將復方各成分靶點與HCC疾病交集的基因導入DAVID 6.8在線工具(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),限定物種條件為“Homo sapiens”,進行基因本體(GO)分類富集分析以及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。在P<0.01的情況下,以富集基因數(shù)從多到少進行排序,選擇排序靠前的GO分類和KEGG通路,利用微生信在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)制作可視化圖形。

1.2 體外實驗驗證

1.2.1 實驗材料 (1)細胞株:人肝癌HepG2和Huh7細胞購自中國科學院上海細胞研究所。(2)實驗藥物:黃連、大黃和肉桂飲片購自上海養(yǎng)和堂張江店,粉碎機粉碎,按復方比例混合后置一個圓底燒瓶中,加入8倍量70%乙醇,浸泡30 min,80℃加熱回流1 h后紗布過濾,往濾渣中再加入8倍量70%乙醇,80℃加熱回流1 h后紗布過濾,合并濾液。旋轉蒸發(fā)回收乙醇并濃縮藥物至1 g生藥/ml。臨用時用培養(yǎng)液稀釋至10 mg/ml后抽濾滅菌,再根據(jù)實驗需要用培養(yǎng)液配制成不同濃度作用于細胞。(3)主要試劑:RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶、青霉素-鏈霉素均購于美國Gibco公司;胎牛血清購于美國Corning公司;CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司;TRIzol試劑購自美國Ambion公司;PrimeScript RT Master Mix試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)購自日本Takara公司。(4)主要儀器:1300系列A2生物安全柜、Steri-Cycle i160 CO2培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000超微量分光光度計、QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀,均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;ELx800酶標儀,購自美國Bio Tek公司;CytoFLEX流式細胞儀,購自美國Beckman公司。

1.2.2 方法 (1)細胞培養(yǎng):人肝癌HepG2、Huh7細胞復蘇后接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于37℃恒溫且通入5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)CCK-8法測定細胞增殖:選擇對數(shù)生長期的HepG2和Huh7細胞,胰酶消化后以5×103/孔接種于96孔板中,置于培養(yǎng)箱中過夜。第2天往兩種細胞各孔中加入不同濃度的RRC藥液,使其終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/ml,每個濃度做5個復孔,同步設立不用藥的對照組。分別在藥物作用24 h和48 h后加入CCK-8溶液,孵育1.5 h后測定570 nm的吸光度(OD值),計算各組細胞的存活率,公式:存活率(%)=(OD值實驗-OD值空白)/(OD值對照-OD值空白)×100%;計算藥物作用48 h時對肝癌細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。(3)Annexin V-FITC測定細胞凋亡情況:選擇對數(shù)生長期細胞,胰酶消化后按5×105/孔接種于6孔板中,置于培養(yǎng)箱中過夜。第2天按處理因素不同,設置對照組和復方組,每組3個復孔,對照組每孔加入2 ml新鮮培養(yǎng)液,復方組每孔加入新鮮培養(yǎng)液配制的1.5 mg/ml RRC藥液2 ml。48 h后,按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書,收集細胞,以CytoFLEX流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,以FlowJo V10分析凋亡檢測數(shù)據(jù)。(4)RT-qPCR檢測細胞凋亡相關基因的mRNA表達:細胞鋪板、分組和用藥同(3)。用藥48 h后吸棄培養(yǎng)液,PBS漂洗后加入0.5 ml/孔TRIzol裂解細胞,提取細胞總RNA并測定濃度,將其中的mRNA逆轉錄為cDNA(37℃ 15 min,85℃ 5 s);實時熒光定量PCR擴增cDNA,反應條件為95℃ 3 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。以GAPDH作為內參,采用2-ΔΔCT法計算mRNA相對表達量,并計算BCL2/BAX比值。Primer3(v.0.4.0)在線軟件設計引物,序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 RRC的活性成分和治療HCC的潛在靶點篩選 黃連、大黃和肉桂共檢索到化合物244個,其中符合篩選條件的化合物34個,見表2。篩選出的RRC活性成分中有25個化合物檢索到作用靶點,去重后得到234個靶點,排除其中5個未在Uniprot數(shù)據(jù)庫找到對應記錄的靶點后,與Genecards中檢索到的7 100個HCC相關基因取交集,得到190個RRC治療HCC的潛在靶點。RRC-成分-HCC靶點網絡見圖1。其中,每個成分均對應多個靶點,每個靶點又受多個成分調控,其中HL1(quercetin,槲皮素)作用的靶點最多。

圖1 RRC-成分-肝癌靶點網絡圖

表2 RRC中符合篩選條件的化合物

2.2 潛在靶點的GO與KEGG通路富集 根據(jù)P<0.01的篩選條件,GO富集分析得到GO條目共281條,其中細胞組成(CC)21條、生物過程(BP)209條、分子功能(MF)51條。按富集基因數(shù)量降序排列后,分別選取BP、CC和MF富集基因數(shù)前20、6和12的條目繪制柱狀圖,BP中P值最小的是凋亡信號通路,以及程序性細胞死亡正調控和凋亡信號通路調控等與細胞凋亡密切相關的條目,見圖2。KEGG通路富集分析顯示富集基因數(shù)最多的通路為癌癥通路,包含與細胞凋亡、周期等密切相關的基因,見圖3。

圖2 潛在靶點的GO富集分析結果

GO和KEGG通路富集結果均顯示,細胞凋亡通路可能是RRC治療HCC的主要靶標,進一步反向尋找靶向凋亡的復方成分及對應的靶點,發(fā)現(xiàn)中藥成分主要是黃連中的槲皮素(quercetin),大黃中的β-谷甾醇(beta-sitosterol)和蘆薈大黃素(aloe-emodin),其靶向的凋亡分子主要是CASP9、CASP8、CASP3、BCL2、BAX等。

2.3 RRC對人肝癌細胞增殖的抑制作用 與對照組比較,不同濃度的RRC作用24 h和48 h對HepG2(圖4A)和Huh7細胞(圖4B)的增殖具有不同程度的抑制作用,且呈現(xiàn)時效和量效關系;相同作用時間下,同濃度的RRC對Huh7細胞的增殖抑制優(yōu)于HepG2細胞,0.5 mg/ml的RRC作用24 h即可顯著抑制Huh7細胞的增殖,而1.0 mg/ml作用48 h才可顯著抑制HepG2細胞增殖。RRC抑制HepG2和Huh7細胞增殖的IC50分別為2.226 mg/ml和1.395 mg/ml。

2.4 RRC對人肝癌細胞凋亡的影響 與對照組比較,HepG2和Huh7細胞經RRC作用48 h后,其凋亡細胞明顯增加(均P<0.001),且藥物對HepG2細胞(凋亡約26%)的作用強于Huh7細胞(凋亡約20%)。見圖5。

2.5 RRC對人肝癌細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響 RRC作用48 h后,HepG2(圖6A)和Huh7(圖6B)細胞的CASP9、CASP8、CASP3 mRNA表達均不同程度上調,其中CASP9變化幅度較小,CASP8、CASP3 mRNA表達上調比較明顯,但均無統(tǒng)計學差異;另外,用藥后,BCL2/BAX在HepG2細胞中呈下降趨勢,而在Huh7細胞中卻顯著上升(P<0.01)。

圖6 RRC對人肝癌細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響與對照組比較,**P<0.01

3 討論

古典中醫(yī)文獻中并無“肝癌”之病名,據(jù)其肝區(qū)疼痛、進行性肝腫大、腹脹等臨床癥狀,可將其歸為中醫(yī)痞氣、臌脹、脅痛、肝積、積聚、癥瘕等范疇。中醫(yī)認為,HCC的病機為本虛標實,患者正氣不足,局部痰、濕、瘀、毒互結積滯而成腫塊。幾千年來,基于辨證論治理論,中醫(yī)藥在HCC的防治中發(fā)揮著重要的作用,據(jù)報道,我國約80%的HCC患者在不同階段不同程度地使用了中醫(yī)藥治療[7],HCC不同階段辨證各有不同,早期多以邪實為主,根據(jù)邪實性質不同又有疏肝解郁、清熱解毒、活血化瘀等治法[8]。RRC本為課題組前期治療熱盛而陰未傷2型糖尿病的經驗方(曾用名“糖尿寧”)[9],方中黃連為君,大黃為臣,共用可起到清熱解毒和活血化瘀的作用,方中極少量的肉桂起反佐作用:《四科簡效方》記載肉桂可與黃連組成交泰丸,可交通心腎,起到安神的作用;另外肉桂性溫,可以佐制大黃、黃連等藥的苦寒敗胃之性。有文獻報道黃連有效成分小檗堿、大黃有效成分大黃素,以及肉桂有效成分桂皮醛等均具有抑制肝癌細胞增殖、誘導凋亡的作用[10-12],但其均為中藥單一有效成分的研究,未能有效體現(xiàn)中醫(yī)整體調節(jié)、辨證論治的思想。鑒于此,課題組嘗試探索在中醫(yī)理論指導下組方而成的RRC對肝癌細胞增殖的影響,體外和體內實驗均發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗肝癌效果,機制研究已發(fā)現(xiàn)其作用與調節(jié)自噬有關[3-6]。本文進一步利用網絡藥理學和生物分析工具等探索了RRC抗HCC潛在的廣泛作用機制,發(fā)現(xiàn)其三味中藥各自有多種有效成分,共同靶向HCC的190個靶點,相互作用網絡圖顯示每個成分均對應多個靶點,每個靶點又受多個成分調控,即可能靶向復雜的分子生物網絡發(fā)揮抗GCC的作用,其中細胞凋亡途徑可能是其靶向的重要通路之一。

進一步溯源成分-靶點對應關系,發(fā)現(xiàn)RRC靶向凋亡途徑的成分主要是來自黃連的槲皮素和來自大黃的β-谷甾醇、蘆薈大黃素,而肉桂中的4個成分均無作用于凋亡的靶點,這與肉桂在RRC中用量極少,未用其抗肝癌作用,僅用其反佐作用是相一致的。已有研究證明,槲皮素、β-谷甾醇、蘆薈大黃素均有抑制肝癌細胞增殖和誘導肝癌細胞凋亡的作用[13-15],但三者兩兩配伍或三者配伍在一起對HCC的防治作用是否具有協(xié)同作用,尚無文獻報道,有待進一步研究。

眾所周知,死亡受體介導的外源性凋亡途徑和線粒體介導的內源性凋亡途徑是細胞凋亡的兩個進化保守的信號轉導途徑,其中CASP8是前者的執(zhí)行者,CASP9是后者的執(zhí)行者,而CASP3是兩者最終的凋亡執(zhí)行分子之一;抑凋亡成員BCL2和促凋亡成員BAX則可通過改變線粒體膜上原有孔道或通道調控內源性凋亡途徑,兩者構成比例常用以評價此類凋亡的程度。本研究體外實驗顯示,RRC能顯著促進HepG2和Huh7細胞的凋亡,且對前者的作用強于后者。RRC對兩種細胞中凋亡分子CASP9、CASP8、CASP3的作用具有一致性,但對兩者BCL2/BAX比值的影響存在差異,該比值在HepG2中下降,而在Huh7細胞中上升,提示RRC可不同程度的誘導HepG2細胞內源性和外源性凋亡的發(fā)生,且以外源性凋亡為主;而在Huh7細胞,主要是誘導外源性凋亡的發(fā)生,同時可能還對細胞的內源性凋亡具有抑制作用。這也可以解釋為什么相同濃度RRC作用下Huh7存活細胞低于HepG2細胞,而凋亡細胞比例卻是Huh7低于HepG2,提示RRC導致Huh7細胞存活較低的原因,不僅與導致部分細胞凋亡有關,同時可能還有其他原因導致其死亡細胞較HepG2細胞多,具體將有待進一步探索。

綜上,RRC成分復雜,治療HCC具有多靶點和多通路的作用特點,其中凋亡通路可能是其作用的主要途徑之一,發(fā)揮抗凋亡作用的成分可能是其中的槲皮素、β-谷甾醇和蘆薈大黃素,外源性的凋亡途徑可能是其作用的主要靶點。值得注意的是,網絡藥理學分析同時富集到的凋亡途徑之外的一些分子,可能也是RRC抗HCC的作用靶點,后續(xù)值得進一步探索。