外泌體在膿毒癥心肌病中的研究進(jìn)展

姚白雪,王 磊,唐澤文,徐宇璇,張麗楠,林樂清

(1.杭州師范大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院,浙江 杭州 311121;2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,浙江 杭州 310015)

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)主要的衛(wèi)生健康問題,造成16%～33%的患者死亡[1]。膿毒癥引起的心功能障礙稱為膿毒癥心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy,SICM),有報(bào)道表明50%的膿毒性休克患者存在心功能不全,死亡率高達(dá)70%[2]。SICM的發(fā)病機(jī)制尚未明確,近年來的研究表明外泌體在其中扮演著重要角色。本文對(duì)不同細(xì)胞來源的外泌體在膿毒癥心肌病中作用機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為膿毒癥心肌病的診療提供一些新的思路。

1 外泌體概述

外泌體是一種直徑在40～160 nm(平均100 nm)的細(xì)胞外囊泡,包含核酸、脂類、代謝物、胞質(zhì)和細(xì)胞表面蛋白質(zhì),介導(dǎo)體內(nèi)不同類型細(xì)胞之間的信號(hào)通訊[3]。不同來源的外泌體及外泌體的不同內(nèi)含物在膿毒癥心肌病的病理生理機(jī)制中起著重要作用。研究表明膿毒癥患者血漿外泌體水平與器官衰竭的嚴(yán)重程度及預(yù)測(cè)死亡率相關(guān)[4]。Pei等[5]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在膿毒癥小鼠模型中能減輕其心肌損傷。在這過程中發(fā)揮重要作用的是外泌體分泌的非編碼RNA,包括微小RNA(microRNAs, miRNAs)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)。此外,外泌體還與循環(huán)中的促炎因子、氧化物、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、鈣調(diào)節(jié)等這些與膿毒癥心肌病相關(guān)的因素也有著密切聯(lián)系。其中,不同類型細(xì)胞來源的外泌體在膿毒癥心肌病中發(fā)揮著不同的作用。

2 外泌體與SICM

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體 內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙被認(rèn)為是膿毒癥導(dǎo)致器官功能障礙的關(guān)鍵因素[6]。膿毒癥發(fā)展過程中產(chǎn)生的病原體相關(guān)分子模式可激活內(nèi)皮細(xì)胞,上調(diào)趨化因子和黏附分子的表達(dá),從而促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤和炎癥反應(yīng),導(dǎo)致器官損傷。熱休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞,對(duì)血管的生成起關(guān)鍵作用[7]。既往研究表明,HSPA12B在減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心功能不全中起重要作用。最近,Tu等[8]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確了內(nèi)皮細(xì)胞可以通過分泌外泌體來釋放HSPA12B,進(jìn)而下調(diào)巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng),起到對(duì)SICM的保護(hù)作用。與之相關(guān)的研究表明,血清外泌體可分泌以黏附分子為靶標(biāo)的miRNA-126,HSPA12B通過調(diào)節(jié)miRNA-126的表達(dá),從而減少免疫細(xì)胞在心肌中的積聚,進(jìn)而減輕膿毒癥所致的心功能障礙[9]。

此外,內(nèi)皮細(xì)胞還可以通過旁分泌調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞功能,而外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)是旁分泌的重要途徑之一。暴露于脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體可促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞增殖,通過下調(diào)凋亡相關(guān)基因減輕心肌細(xì)胞凋亡,降低心肌細(xì)胞中乳酸脫氫酶和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,同時(shí)增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的水平。這提示了外泌體對(duì)心肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。在實(shí)驗(yàn)中,研究人員發(fā)現(xiàn)在高濃度(10 μg/mL)的LPS下,內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的微泡主要是凋亡小體,外泌體則明顯減少。這說明內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能僅存在于膿毒癥早期[10]。還有研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥小鼠循環(huán)中的外泌體比正常小鼠循環(huán)中的外泌體含有更高水平的ROS,可以有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)足體簇的生成。而足體簇促使細(xì)胞間連接的中央調(diào)節(jié)因子ZO-1的移位來破壞內(nèi)皮細(xì)胞完整性,從而導(dǎo)致血管滲漏和心功能不全[11]。

2.2 血小板來源的外泌體 活性氧在各種心臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,如心肌梗死和心力衰竭。體內(nèi)活性氧和活性氮主要來源于產(chǎn)生超氧化物的還原型輔酶Ⅱ氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS),而血小板可以表達(dá)這兩種酶,同時(shí)也具有相應(yīng)的活性,而外泌體在這過程中發(fā)揮著重要的作用。膿毒癥患者血小板來源的外泌體誘導(dǎo)產(chǎn)生NOX,通過活性氧依賴的途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞凋亡[12]。在另一項(xiàng)研究中,膿毒癥患者血小板分泌的外泌體含有NOS,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO),促進(jìn)活性氧/活性氮的產(chǎn)生,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡;同時(shí)外泌體可導(dǎo)致暴露于內(nèi)毒素的離體動(dòng)物心肌收縮力下降,且這種改變?cè)谕饷隗w退出時(shí)是完全可逆的[13]。

NOS是一種能結(jié)合鈣調(diào)蛋白且含有血紅素的酶,其中誘導(dǎo)型NOS在細(xì)胞內(nèi)幾乎不表達(dá),但可以被LPS、細(xì)胞因子等誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生過量的NO,在膿毒癥發(fā)展的過程中造成組織的損傷。NO是一種在心血管病理生理中起核心作用的信號(hào)分子,通過調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈張力、血栓形成、炎癥、興奮-收縮偶聯(lián)等影響心臟功能。其中NO與超氧化物結(jié)合可導(dǎo)致過氧亞硝酸鹽的產(chǎn)生,這種化合物被認(rèn)為是心肌抑制的主要因素,且可以引起包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA在內(nèi)的生物分子的氧化損傷。有研究將膿毒患者循環(huán)中的外泌體靜脈注入小鼠體內(nèi),觀察到小鼠心臟中的NO、前列腺素、誘導(dǎo)型NOS表達(dá)增強(qiáng),而這些效應(yīng)與促炎反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)[14]。

中性粒細(xì)胞在膿毒癥的免疫反應(yīng)中起著重要的作用,除了吞噬功能,中性粒細(xì)胞還可以釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps ,NETs)來捕殺微生物。但過度的NETs形成可能導(dǎo)致膿毒癥中多器官功能障礙的發(fā)生,而血小板可能參與了膿毒癥中NETs形成的這一過程[15]。有研究證明了血小板來源的外泌體通過分泌高遷移率族蛋白1(high mobility group protein,HMGB1)和/或miRNA-15b-5p和miRNA-378a-3p誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞內(nèi)自噬通路激活和NETs的形成;同時(shí)也發(fā)現(xiàn)抑制血小板來源外泌體的分泌能減輕膿毒癥相關(guān)的肺損傷[16]。結(jié)合上述研究,血小板分泌的外泌體可能通過表達(dá)NOS、NOX和形成NETs這些途徑參與SICM的發(fā)展過程中。

2.3 巨噬細(xì)胞來源的外泌體 目前SICM的潛在機(jī)制仍不明確,但已明確的是膿毒癥引起的多器官功能衰竭是由于持續(xù)的促炎細(xì)胞因子風(fēng)暴。膿毒癥中外泌體的促炎作用包括誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化,增強(qiáng)其促炎因子的分泌,誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞分化輔助T細(xì)胞及刺激白細(xì)胞趨化。循環(huán)中過量的促炎因子被認(rèn)為是心肌抑制物質(zhì),而外泌體被認(rèn)為是這些細(xì)胞因子的載體[17]。其中細(xì)胞因子主要通過巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞激活Toll樣受體(Toll-like receptor, TLRs),而Toll樣受體在誘導(dǎo)先天免疫和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。它通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式,將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞,主要激活核轉(zhuǎn)錄因子-kB,控制促炎因子的表達(dá),在介導(dǎo)膿毒癥所致的心功能不全中起重要作用[18]。既往研究表明,從分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中分離出的外泌體可以誘導(dǎo)促炎反應(yīng),而LPS處理后的巨噬細(xì)胞缺陷的小鼠能部分恢復(fù)心肌細(xì)胞縮短[19]。為進(jìn)一步探究巨噬細(xì)胞來源的外泌體與膿毒癥引起的心功能不全的關(guān)系,Essandoh等[20]用大腸桿菌LPS處理巨噬細(xì)胞并分離外泌體,發(fā)現(xiàn)外泌體含量明顯增加,且促炎因子水平升高。用GW4869(一種中性鞘磷脂酶抑制劑,目前應(yīng)用最廣泛的阻斷外泌體生成的藥物)抑制LPS處理的巨噬細(xì)胞外泌體的產(chǎn)生,能減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生;同時(shí)能在小鼠模型中抑制LPS引起的中性粒細(xì)胞的心肌浸潤,減輕心功能障礙,降低死亡率。這證實(shí)了阻斷巨噬細(xì)胞來源的外泌體的釋放,可以減少循環(huán)中促炎細(xì)胞因子水平,減輕膿毒癥所致的心功能障礙和死亡率[20]。

高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種核蛋白,在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。HMGB1一旦釋放到細(xì)胞外,可被巨噬細(xì)胞激活,以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。循環(huán)中HMGB1水平升高與膿毒癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Yang等[21]研究表明,乳酸促進(jìn)了HMGB1的乳糖化、乙?；?并通過巨噬細(xì)胞外泌體分泌促進(jìn)HMGB1的釋放。而含有HMGB1的外泌體進(jìn)一步破壞內(nèi)皮黏附和緊密連接蛋白,增加黏附分子表達(dá),導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能障礙。結(jié)合HMGB1在心臟炎癥損傷和再生重塑中的作用[22],這種核蛋白可能在膿毒癥患者出現(xiàn)心功能不全中發(fā)揮一定的作用。事實(shí)上,已有研究表明,miRNA-181b過表達(dá)可下調(diào)膿毒癥大鼠HMGB1的表達(dá),從而減少炎癥因子和心肌損傷,抑制心肌細(xì)胞凋亡[23];lncRNA PVT1通過miRNA-29a/HMGB1軸促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化,加重LPS誘導(dǎo)的心肌損傷[24]。

2.4 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源于骨髓或脂肪組織,在適當(dāng)環(huán)境下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞,具有多種生物學(xué)功能,如促進(jìn)損傷組織再生、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。以往研究表明,MSCs在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型中能有效降低死亡率和改善心肌功能,且在注射MSCs 5～10 min后發(fā)現(xiàn)其主要分布在肺和肝臟中,在心臟組織檢測(cè)不到[25-26]。因此考慮MSCs誘導(dǎo)的心肌保護(hù)作用可能與局部作用無關(guān),與旁分泌所致的全身效應(yīng)相關(guān)。而外泌體是MSCs旁分泌的關(guān)鍵效應(yīng)因子,從MSCs釋放的外泌體(MSC-exos)能通過調(diào)節(jié)miRNA-182的表達(dá)來減輕動(dòng)物模型的心肌缺血再灌注損傷[27]。為明確MSC-exos是否與膿毒癥中心肌保護(hù)相關(guān),Wang等[28]將缺少miR-223的MSC-exos注射到膿毒癥小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)其并未改善心功能和存活率,而miR-223是一種在高度富集于MSC-exos中的microRNA,進(jìn)而表明MSCs對(duì)膿毒癥心臟的保護(hù)作用可能依賴于外泌體中miR-223的表達(dá)。此外,Liu等[29]的研究在證明MSC-exos對(duì)體外炎癥模型心肌細(xì)胞和體內(nèi)膿毒癥模型心肌細(xì)胞均有保護(hù)作用的同時(shí),還發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控MSC-exos的潛在基因miR-146a-5p過表達(dá)可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖,抑制其凋亡。

除了通過調(diào)節(jié)microRNA外,MSC-exos還可能通過降低鈣超載來減少線粒體損傷進(jìn)而保護(hù)膿毒癥時(shí)的心功能。鈣是體內(nèi)重要的第二信使,在心肌收縮力中起關(guān)鍵作用。線粒體主要通過鈣攝取——由呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子泵通過內(nèi)膜產(chǎn)生的相當(dāng)大的電壓驅(qū)動(dòng)以及由線粒體Na+/Ca2+交換器介導(dǎo)的線粒體Ca2+外流[30]來調(diào)節(jié)鈣。膿毒癥早期心肌細(xì)胞線粒體鈣攝取無明顯變化,但鈣外流明顯異常,這表明SICM是與線粒體鈣外流減少所致的線粒體鈣超載相關(guān)[31]。有研究證實(shí)了MSC-exos會(huì)被盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞攝取,同時(shí)觀察到被外泌體處理后的心肌細(xì)胞中僅表現(xiàn)為少數(shù)線粒體嵴數(shù)量減少,并能逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞鈣外流的減少,這表明了外泌體的線粒體保護(hù)作用。目前越來越多的證據(jù)表明,間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可以改善心臟功能,促進(jìn)心臟再生和修復(fù)[32],對(duì)未來膿毒癥心肌病的治療具有指導(dǎo)意義。

3 結(jié)語

綜上所述,目前對(duì)膿毒癥患者如何導(dǎo)致心功能不全仍缺乏完整的了解,但其中外泌體在膿毒癥心肌病中的作用機(jī)制可包括:內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體通過釋放HSPA12B減輕促炎反應(yīng)、降低ROS水平保護(hù)心肌細(xì)胞;血小板來源的外泌體可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中NO的產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和功能障礙,從而導(dǎo)致心肌病,且也可能通過形成NETs這一途徑參與膿毒癥心肌病的發(fā)展過程中;巨噬細(xì)胞來源的外泌體可增加循環(huán)中細(xì)胞因子水平,促進(jìn)中性粒細(xì)胞的心肌浸潤及內(nèi)皮屏障功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥的心功能障礙;間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過釋放miR-223及降低鈣超載來保護(hù)心肌細(xì)胞,抑制其凋亡,可作為未來一種保護(hù)心肌的手段。此外,外泌體分泌的miRNAs和lncRNAs通過參與炎癥信號(hào)通路、調(diào)節(jié)炎癥因子、調(diào)控心肌纖維化及內(nèi)皮細(xì)胞功能等途徑也在膿毒癥心肌病中發(fā)揮著重要的作用。近年來,越來越多的研究聚焦于膿毒癥及外泌體的聯(lián)系上,這些新的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)對(duì)膿毒癥心肌病的早期識(shí)別、早期診斷及治療提供臨床意義。