基于Box-Benhnken 響應面法優(yōu)化紅花籽油超聲回流提取工藝

魏 偉，藺發(fā)聰，侯建忠，朱順娟，呂培霖*

（1.酒泉市藥品檢驗檢測中心,甘肅 酒泉 735000；2.聯(lián)勤保障部隊第九四四醫(yī)院 藥劑科，甘肅 酒泉 735000）

紅花籽為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的種子[1]，又叫“白平子”“血平子”，富含油脂，經(jīng)加工得到的紅花籽油，主要含有亞油酸、維生素 E 、棕櫚酸、β-胡蘿卜素等多種生物活性物質(zhì)[2-3]，其中亞油酸含量可達60% ～ 80%，有“亞油酸之王”的稱號。研究表明，紅花籽油具有降血脂、降低膽固醇、預防和治療動脈粥樣硬化的功效，有“人體血管清道夫”的美譽，另外還有抗炎、增強細胞代謝、延緩衰老的作用[4-5]，是一種營養(yǎng)豐富、保健功能優(yōu)良高品質(zhì)的食用植物油。目前，紅花籽油的加工方式有壓榨法、水酶法、有機溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法等[6]，與傳統(tǒng)壓榨法相比較，有機溶劑超聲浸提法具有提取效率高，提取時間短，提取油品質(zhì)量高的特點。本研究在單因素試驗的基礎上，以紅花籽油提取率、綜合評分為考察指標，以液料比、超聲提取時間、提取溫度為變量因素，采用Box-Benhnken 響應面法考察優(yōu)化了紅花籽油超聲溶劑回流提取工藝參數(shù)，為后期擴大生產(chǎn)和開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀（包括四元低壓泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外可見檢測器，日本島津公司）；XP205DR 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KH-250B 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；EV351 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州博勒泰科技有限公司）。

1.2 試藥

亞油酸對照品（批號：B21412，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純；石油醚（30 ～ 60℃）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅花籽油的提取

取紅花籽粉末（過一號篩）約15 g，精密稱定，置連接冷凝裝置的圓底燒瓶中，加入規(guī)定液料比的石油醚（30 ～ 60℃，下同），在規(guī)定的提取溫度、提取時間內(nèi)超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）提取，放冷后過濾，減壓回收石油醚至不再有液滴溜出后繼續(xù)蒸餾3 min，剩余提取物即為紅花籽油，精密稱定重量，計算紅花籽油提取率，公式為：

2.2 亞油酸含量測定

2.2.1 色譜條件 采用InertSustain C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5μm），乙腈-0.1%磷酸溶液（85 : 15）為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為207 nm；進樣體積為10 μL，色譜峰理論板數(shù)均不低于4 000[7-8]。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取亞油酸對照品0.141 67 g，置磨口三角瓶中，加入0.5 mol/L NaOH 甲醇溶液20 mL，連接冷凝裝置，60℃回流提取30 min至油滴完全消失，冷卻至室溫，加酚酞指示液2 滴，滴加0.5 mol/L 鹽酸溶液至紅色褪去，再將上述溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，并用甲醇洗滌三角瓶3 次，合并洗滌液至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45μm 有機微孔濾膜，取續(xù)濾液測定。

2.2.3 供試品溶液制備 取“2.1”項下紅花籽油約0.2 g，精密稱定，置磨口三角瓶中，加入0.5 mol/L NaOH 甲醇溶液20 mL，按照“2.2.2”項下方法處理。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液，“2.2.3”項下供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果見圖1。陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按照“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，測得亞油酸峰面積的RSD 為0.78%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批紅花籽油，按照“2.2.3”項下方法制備6 份平行供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，計算樣品中亞油酸含量的RSD 為1.48%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件分別于0、4、8、12、24 h 各進樣1 次，記錄色譜圖，測得亞油酸峰面積的RSD 為0.86%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液1、3、5、8、10 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為0.283 3、0.850 0、1.416 7、2.266 7、2.833 4 mg/mL 的系列標準溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標，進樣質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得到亞油酸的回歸方程為Y=8.917 49×106X+3.054 7×106（r= 0.998 9）。表明亞油酸在0.283 3 ～ 2.833 4 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知亞油酸含量的紅花籽油樣品9 份，分別按加入50%、100%、150% 的亞油酸對照品各3 份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算亞油酸的平均回收率為96.28%，RSD 為1.93%。表明方法符合要求。

2.4 單因素試驗

2.4.1 超聲提取時間的影響 按“2.1”項下紅花籽油的提取方法，石油醚作為提取溶劑，加入10 倍提取溶劑，提取溫度為30℃，超聲提取時間分別為10、20、30、40、50 min，考察對紅花籽油提取率的影響，結(jié)果見圖2A。結(jié)果為超聲提取時間30 min 時紅花籽油提取基本完全，考慮到效率和能耗問題，選定超聲提取時間為30 min。

圖2 單因素試驗結(jié)果Fig.2 Single factor test results

2.4.2 液料比的影響 按“2.1”項下紅花籽油的提取方法，以石油醚作為提取溶劑，超聲提取溫度和時間分別為30℃和30 min，加入提取溶劑分別為10倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍，考察對紅花籽油提取率的影響，結(jié)果見圖2B。結(jié)果為加入20 倍提取溶劑時紅花籽油的提取趨于最大，故選定加入提取溶劑為20 倍。

2.4.3 提取溫度的影響 按“2.1”項下紅花籽油的提取方法，石油醚作為提取溶劑，加入20 倍提取溶劑，提取時間為30 min，提取溫度分別為20、30、40、50、60℃，考察對紅花籽油提取率的影響，結(jié)果見圖2C。結(jié)果為提取溫度40℃時紅花籽油提取率最高，故選定超聲提取溫度為40℃。

2.5 Box-Behnken 響應面法優(yōu)選提取參數(shù)

2.5.1 綜合評分計算方法 將紅花籽油提取率、亞油酸含量進行標準化處理，公式為：

X=(x-xmin)/(xmax-xmin)×100% （2）

其中，X為標準化處理后數(shù)值，x為該組的實測數(shù)值，xmax為該組數(shù)據(jù)中最大數(shù)，xmin為該組數(shù)據(jù)中最小數(shù)。

綜合評分為紅花籽油提取率、亞油酸含量標準化處理后數(shù)值與相應的權(quán)重系數(shù)相乘后的和。紅花籽油提取率、亞油酸含量的權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4。

2.5.2 試驗設計與結(jié)果 參照單因素試驗結(jié)果，選取液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）三個因素，確定三水平，見表1，采用Design Expert 8.0.6軟件設計試驗，試驗設計及結(jié)果見表2。

表1 紅花籽油超聲提取試驗因素與水平表Tab.1 Factors and level table for ultrasonic extraction of Carthami semen oil

表2 紅花籽油超聲提取試驗設計與結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of ultrasonic extraction of Carthami semen oil

2.5.3 建立模型與方差分析 以紅花籽油提取率為考察目標，采用Design Expert 8.0.6 軟件對紅花籽油超聲溶劑提取工藝結(jié)果進行二次多元擬合分析，得到回歸方程：紅花籽油提取率=17.39+0.33A+0.67B+0.58C+0.05AB+0.27AC-0.34BC-1.82A2+0.30B2-1.02C2。

紅花籽油超聲溶劑法提取工藝方差分析結(jié)果見表3。從表中結(jié)果可知，此模型具有極好的顯著性（P＜0.001），模型失擬項不顯著（P= 0.869）,表明模型方程擬合度較高，可用于分析和預測紅花籽油超聲溶劑提取工藝參數(shù)。預測R2為0.991 7 與校準的0.994 9 基本一致，變異系數(shù)CV = 0.58%＜10%，信噪比為51.485 ＞4，說明模型試驗的穩(wěn)定性好，誤差小。從P值可知，一次項A、B、C，交互項AC、BC，二次項A2、B2、C2對綜合評分的影響極顯著，其他項影響不顯著；從F值可知一次項因素對紅花籽油提取率的影響順序為：B＞C＞A，即提取時間＞提取溫度＞液料比。

表3 紅花籽油提取率方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance of extraction rate of Carthami semen oil

以紅花籽油提取率和亞油酸含量的綜合評分為考察目標，采用Design Expert 8.0.6 軟件對紅花籽油超聲溶劑提取工藝結(jié)果進行二次多元擬合分析，得到回歸方程：綜合評分= 89.25+5.38A+5.38B-1.94C+0.70AB+2.19AC-5.59BC-31.69A2+2.68B2-26.60C2， 紅花籽油超聲溶劑法提取工藝方差分析結(jié)果見表4。從表中結(jié)果可知，此模型具有極好的顯著性（P＜0.001），模型失擬項不顯著（P= 0.109）,表明模型方程擬合度較高，可用于分析和預測紅花籽油超聲溶劑提取工藝參數(shù)。預測R2為0.842 1 與校準的0.970 8 基本一致，變異系數(shù)CV = 6.19%＜10%，信噪比為22.643 ＞4，說明模型試驗的穩(wěn)定性好，誤差小。從P值可知，一次項A、B，二次項A2、C2對綜合評分的影響極顯著，交互項BC 對綜合評分的影響顯著，其他項影響不顯著；從F值可知一次項因素對綜合評分的影響順序為：A＞B＞C，即液料比＞提取時間＞提取溫度。

表4 紅花籽油超聲工藝綜合評分方差分析結(jié)果Tab.4 Analysis of variance of ultrasonic comprehensive score for Carthami semen oil

2.5.4 交互作用響應面分析 以單因素A、B、C中任意2 個變量對紅花籽油提取率和綜合評分的影響，采用Origin 2018 軟件繪制等高線圖和3D 響應面圖，結(jié)果見圖3、4。提取時間與提取溫度的交互作用對紅花籽油提取率和綜合評分的影響最大，液料比與提取時間的交互作用影響最小。

圖3 交互作用對紅花籽油提取率影響的響應面圖Fig.Response surface diagram of interaction effect on Carthami semen oil extraction

圖4 交互作用對綜合評分影響的響應面圖Fig.3 Effect of interaction on comprehensive score response surface

2.6 驗證試驗

通過軟件分析，以紅花籽油提取率為考察目標，最優(yōu)提取參數(shù)為：液料比為19.47 : 1，提取時間為39.91min，提取溫度為49.79℃，紅花籽油提取率理論值為17.28%。以綜合評分為考察目標，最優(yōu)提取參數(shù)為：液料比19.39 : 1，提取時間為36.19 min，提取溫度為38.16℃，綜合評分理論值為92.57。為檢驗試驗結(jié)果的可靠性，考慮到試驗條件和操作的便利性，確定最佳提取工藝為：液料比為20 : 1，提取時間為35 min，提取溫度為40℃。采用上述試驗參數(shù)重復提取3 次，實際測得紅花籽油平均提取率為17.15%，綜合評分為90.34，與理論值基本一致，相對誤差分別為0.75%、2.47%。表明優(yōu)化后的試驗條件可靠，具有應用價值。

3 討論

亞油酸的測定有HPLC 法、GC 法[9-11]，GC 法適合分析分子量較小，易氣化的物質(zhì),亞油酸經(jīng)皂化處理后可采用GC 法分析。課題組分別建立了HPLC 法和GC 法測定紅花籽油中亞油酸含量的方法，通過方法學考察發(fā)現(xiàn)HPLC 法各項指標優(yōu)于GC 法。樣品采用氫氧化鈉甲醇溶液皂化處理后，色譜峰更加對稱、尖銳，故采用HPLC 法測定紅花籽油中亞油酸的含量。紅花籽油含有多種不飽和脂肪酸，易受到光線、溫度、氧氣等因素的影響而引起質(zhì)量的變化，優(yōu)化紅花籽油超聲回流提取工藝時，不能只注重紅花籽油提取率的多少，還應考慮提取工藝對其內(nèi)在活性成分的影響，本研究選取紅花籽油中含量最高的亞油酸為不飽和脂肪酸代表，將紅花籽油提取率和亞油酸的含量按不同權(quán)重計算綜合評分，以綜合評分為指標優(yōu)化提取工藝，既注重了紅花籽油提取率，又關注了紅花籽油中活性成分的多少，使得優(yōu)化的紅花籽油提取工藝更加的科學、合理。

Box-Behnken 響應面法是一種常用的工藝參數(shù)優(yōu)化方法，可以評估各參數(shù)的非線性影響及交互影響，能夠預測最佳工藝參數(shù)[12]。課題組在單因素試驗的基礎上，以紅花籽油提取率和亞油酸含量的綜合評分為考察指標，采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化了紅花籽油超聲回流提取的重要影響參數(shù)，采用多元二次回歸方程得到了最優(yōu)提取工藝參數(shù)，經(jīng)試驗驗證與理論值基本一致，表明回歸模型方程能夠很好地預測紅花籽油超聲回流提取工藝結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究以紅花籽油提取率和亞油酸含量的綜合評分為指標，采用Box-behnken 響應面法優(yōu)化的紅花籽油超聲回流提取工藝，為后期的開發(fā)利用奠定了理論基礎。為了解決紅花籽油易氧化變質(zhì)、不利于保存的問題，課題組后期擬制備紅花籽油水包油型乳劑，考察β-環(huán)糊精包和技術(shù)，將紅花籽油進一步應用于藥品、保健食品等領域。