針刀微創(chuàng)聯合鼠神經生長因子夾脊穴位注射治療對帶狀皰疹后遺神經痛大鼠脊髓背角自噬水平的影響

苑寶文 魏玲 李籌忠

(1貴州省骨科醫(yī)院神經內科,貴州 貴陽 550000;2畢節(jié)市第一人民醫(yī)院針灸科;3貴州省人民醫(yī)院神經外科)

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)感染引起的急性皰疹性皮膚病,部分患者皰疹消退后局部皮膚仍遺留神經痛,即為帶狀皰疹后遺神經痛(PHN)。PHN主要表現為局部皮膚灼熱、敏感、針刺樣疼痛及麻木。疼痛劇烈且持續(xù)時間較長,嚴重影響患者生活質量〔1〕。張愛民等〔2〕研究表明PHN的維持可能與脊髓自噬過度激活有關。劉永達等〔3〕也發(fā)現自噬活性的改變可能參與神經病理性痛的發(fā)生。章軍等〔4〕發(fā)現針刀微創(chuàng)治療組可以有效緩解患者疼痛,其治療效果高于毫針圍刺組。于云等〔5〕通過觀察30例接受華佗夾脊穴針刺法與30例接受針刀阻滯松解法治療PHN患者的臨床療效,發(fā)現針刀阻滯松解法對患者疼痛、焦慮、睡眠質量等方面的改善優(yōu)于華佗夾脊穴針刺法。鼠神經生長因子(mNGF)具有促進突起生長、神經元營養(yǎng)的功能,研究顯示mNGF聯合普瑞巴林、奧卡西平、紅光均具有很好的治療效果,但會產生頭暈、嗜睡、過敏等不良反應〔6～8〕。而針刀微創(chuàng)聯合mNGF夾脊穴位注射在治療PHN中是否通過調節(jié)細胞自噬活性發(fā)揮治療功效尚未報道。本研究觀察針刀微創(chuàng)聯合mNGF夾脊穴位注射治療對PHN模型大鼠的影響,探討脊髓背角自噬改變在其中的可能作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 100只體質量為200～240 g的SPF級雄性SD大鼠購自中生北動(北京)科技發(fā)展有限公司〔SYXK(京)2020-0051〕。飼養(yǎng)環(huán)境為22～25 ℃、濕度50%～60%、周期光照12 h、自由飲水、進食。1 w后用于實驗。

1.2主要試劑和儀器 mNGF(廈門北大之路生物有限公司);非洲綠猴腎母纖維細胞(CV-1,美國ATCC細胞庫);白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司);免疫組化試劑盒(上海齊一生物科技有限公司);TUNEL染色試劑盒(安徽佰歐晶醫(yī)學科技有限公司);酵母自噬相關基因6的哺乳動物同源體(Beclin1)、微管相關蛋白輕鏈(LC3)-Ⅱ、自噬調控多功能蛋白(p62)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化核糖體40 S小亞基S6蛋白激酶(P-S6K)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(武漢博歐特生物科技有限公司);NX-1R高速臺式冷凍離心機(天津鼎昊源生物科技有限公司);蛋白電泳儀、轉膜儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);透射電鏡(日本JEOL公司)。

1.3動物分組與造模 分組:100只大鼠隨機分為對照組、模型組、mNGF肌肉注射(肌肉注射)組、mNGF夾脊穴位注射(穴位注射)組、針刀微創(chuàng)聯合mNGF夾脊穴位注射(針刀聯合)組。模型制作:VZV感染CV-1細胞,培養(yǎng)2 d后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并制成細胞懸液,進行帶狀皰疹病毒接種;腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠,將50 μl細胞密度為1.2×108個/ml的細胞懸液接種至大鼠左趾蹼中,對照組注射等量生理鹽水;接種3～4 d后,測定造模大鼠機械縮足閾值(MWT)降低表明造模成功。干預:肌肉注射組給予肌肉注射mNGF〔2.1 μg/(kg·d)〕,1次/d,共14 d;穴位注射組給予夾脊穴位注射mNGF〔2.1 μg/(kg·d)〕,1次/d,共14 d;針刀聯合組在穴位注射組基礎上進行針刀治療,1次/w,共2 w(操作方法:大鼠常規(guī)消毒、切點皮下淺筋膜下浸潤麻醉,戴無菌手套,于脊柱或神經敏感點垂直進針刀,刺破皮膚,針刀與皮膚平行,行橫向扇形切割,松解粘連帶,退出針刀,無菌紗布按壓3 min);對照組、模型組不做處理。

1.4行為學實驗測定大鼠MWT 采用電子測痛儀測定干預后1、7和14 d時機械痛閾值。用探頭垂直刺激大鼠后足底部,逐漸增加力度,待其出現舔足、抬足和躲避等行為時,記錄電子測痛儀顯示最大值。每隔10 min檢測1次,連續(xù)檢測5次。

1.5收集標本 MWT檢測結束后,將大鼠斷頭處死,取L4～L6脊髓組織,部分加入9倍生理鹽水制成勻漿,1 000 r/min離心10 min后,收集上清液,置于液氮保存?zhèn)溆?部分以4%多聚甲醛固定;部分置于-80 ℃冰箱中保存;部分胰蛋白酶消化制成細胞懸液。

1.6ELISA檢測脊髓組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取凍存的脊髓組織上清液,按照ELISA操作說明書配制標準品和檢測溶液,加入抗體和顯色劑,在酶標儀450 nm下測定吸光度,根據標準曲線算出IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7TUNEL染色檢測脊髓神經細胞凋亡 4%多聚甲醛固定脊髓組織,制成石蠟切片。經脫蠟、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶活性、二氨基聯苯胺(DAB)顯色、復染、鹽酸酒精分化、返藍、脫水、透明、中性膠封片等,于顯微鏡(×400)下觀察,使用ImageJ圖像處理軟件統(tǒng)計凋亡細胞數量。細胞凋亡指數=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.8免疫組化染色檢測脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、p62表達水平 取脊髓組織石蠟切片,經脫蠟、乙醇梯度脫水、高壓抗原修復后分別滴加Beclin1、LC3-Ⅱ、P62一抗(1∶200)孵育過夜,加入二抗(1∶500)孵育20 min,DAB顯色液顯色,蘇木素復染,乙醇梯度脫水、透明、封片,于顯微鏡(×200)下鏡檢。

1.9透射電鏡觀察脊髓組織自噬泡形成 取L4～L6脊髓組織,胰蛋白酶消化制成細胞懸液,接種于6孔板上培養(yǎng)48 h,收集細胞,加入4%戊二醛,4 ℃固定1 h,常規(guī)電鏡固定、脫水、包埋,制成超薄切片,于透射電鏡下觀察細胞自噬泡和亞細胞超微結構。

1.10Western印跡檢測脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、p62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3蛋白表達水平 取脊髓組織,加入適量裂解液提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法定量后制樣,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離蛋白,轉膜,室溫封閉2 h,分別加入Beclin1、LC3-Ⅱ、p62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3一抗(1:500)4 ℃過夜。加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,避光加入ECL發(fā)光液,Bio-rad凝膠成像儀記錄蛋白灰度并拍照,以β-actin作為對照,對各組蛋白進行相對定量分析。

1.11統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行χ2檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組不同時間點PWT比較 與對照組相比,模型組給藥后相同時間PWT明顯降低(P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯合組給藥后7 d和14 d時PWT明顯升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點PWT的比較

2.2各組脊髓組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 與對照組相比,模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯增加(均P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯合組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組脊髓組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.3各組脊髓組織神經細胞凋亡比較 與對照組〔(3.17±0.59)%〕相比,模型組細胞凋亡水平〔(34.28±3.85)%〕明顯升高(P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯合組細胞凋亡水平明顯降低〔(22.69±2.43)%、(16.81±1.38)%、(11.76±1.54)%,P<0.05〕;針刀聯合組抗凋亡效果最佳(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組脊髓組織神經細胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.4免疫組化染色檢測各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達 Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白陽性染色為棕黃色。對照組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62少量表達;與對照組相比,模型組Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達明顯減少,P62表達明顯增多(P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯合組Beclin1、LC3-Ⅱ表達水平明顯增多,P62表達水平明顯減少(P<0.05);針刀聯合組各蛋白變化量最明顯。見表3、圖2。

圖2 各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(免疫組化染色,×200)

表3 各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達水平

2.5各組脊髓組織自噬泡的形成比較 對照組細胞核、線粒體等結構形態(tài)正常,細胞質內存在極少自噬泡;模型組存在少量自噬泡;與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯合組自噬泡數量明顯增加;針刀聯合組自噬泡數量多于其他組。見圖3。

圖3 各組脊髓組織自噬泡的形成(×8 000)

2.6各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3蛋白水平比較 與對照組相比,模型組Beclin1、LC3-Ⅱ、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3水平明顯升高,P62水平明顯降低(P<0.05);與模型組相比,肌肉注射組、穴位注射組、針刀聯合組Beclin1、LC3-Ⅱ水平明顯升高,P62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3水平明顯降低(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3表達

表4 各組脊髓組織Beclin1、LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、p-S6K、Caspase-3相對表達水平

3 討 論

mNGF可以修復受損的神經細胞,促進神經形成,并且有效改善疼痛癥狀,廣泛用于治療神經系統(tǒng)疾病。如周禮志等〔9〕發(fā)現mNGF可有效著緩解PHN患者疼痛、縮短治療時間,其效果強于腺苷鈷胺。夾脊穴位注射可以使多種感受器興奮,產生具有明顯抑制疼痛的電位,達到活血止痛的作用。黃彬〔10〕發(fā)現電針結合穴位注射mNGF治療Ramsay Hunt綜合征的療效高于電針組,明顯降低后遺神經痛的發(fā)生率。部分患者在帶狀皰疹急性發(fā)作期后,易造成皮下粘連,粘連組織會壓迫周圍神經,影響受損神經恢復。針刀治療可以松解局部粘連組織,減輕病變組織壓力,促進炎癥消退,達到消炎鎮(zhèn)痛、祛除麻木、恢復功能的作用。郭慧等〔11〕發(fā)現穴位注射聯合小針刀可有效減輕PNH患者的疼痛,具有較高的治療效果。本研究說明,針刀微創(chuàng)聯合夾脊穴位注射射mNGF能有效減輕PHN疼痛。

在正常狀態(tài)下,神經系統(tǒng)自噬水平較低,在病理刺激下,自噬狀態(tài)會被激活,從而啟動應激防御,促進神經元的生存。自噬涉及多種信號通路,其中mTOR信號通路在突觸可塑性的形成和維持中起關鍵作用,并且可以抑制自噬。Beclin1是自噬泡形成的特異性基因,與自噬啟動有關。LC3蛋白是酵母自噬基因Atg8的同系物,是最常用的自噬蛋白標志物,LC3-Ⅱ定位在自噬體膜上,其含量與自噬泡數量呈正相關。p62作為一種特異的泛素結合蛋白,可與LC3選擇性結合形成自噬溶酶體被降解,p62增多表明自噬受到抑制。陳雪玲等〔12〕發(fā)現雷帕霉素通過降低mTOR、下游效應分子p70S6K1和4EBP1的表達水平,激活自噬信號蛋白的表達,抑制弗氏佐劑誘導的大鼠炎性疼痛。Feng等〔13〕發(fā)現辛二酰苯胺異羥肟酸可減輕神經性疼痛,并通過抑制mTOR信號通路促進星形膠質細胞和脊髓背角神經元細胞的自噬通量。呂丹等〔14〕發(fā)現電針預處理能抑制mTOR信號通路,增加LC3Ⅱ、Beclin-1水平,降低p62水平,從而增強脊髓背角細胞的自噬功能,最終產生抗炎鎮(zhèn)痛的作用。本研究說明,針刀微創(chuàng)聯合夾脊穴位注射射mNGF通過抑制mTOR信號通路增強PHN大鼠脊髓背角自噬水平。

神經細胞凋亡是疼痛發(fā)生的重要機制,增強自噬能抑制神經元凋亡,而抑制自噬則會增加凋亡〔15〕。陳云婷等〔16〕發(fā)現,PHN小鼠脊髓組織中Caspase-3表達升高,神經細胞凋亡明顯增多。Chou等〔17〕發(fā)現膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子可以降低IL-6、IL-1β、Beclin1、Caspase-3、Caspase-9的表達量,減輕由慢性縮窄性損傷誘導的周圍神經損傷引起的細胞凋亡和自噬。本研究說明,針刀聯合組通過增強PHN大鼠脊髓背角自噬水平抑制細胞凋亡,與上述研究結果一致。

PHN患者血清中IL-1β、IL-6和TNF-α過度表達,而高水平的IL-1β、IL-6和TNF-α可對神經系統(tǒng)造成損傷,引起疼痛〔18〕。徐俊濤等〔19〕發(fā)現,PHN模型大鼠脊髓中IL-1β和TNF-α水平明顯升高。馬洪濤等〔20〕發(fā)現富氫液可以增加LC3Ⅱ和Beclin 1水平,降低IL-1β和TNF-α水平,通過激活自噬減輕PHN大鼠的機械痛敏和炎癥因子的釋放。本研究說明,針刀微創(chuàng)聯合夾脊穴位注射射mNGF通過增強PHN大鼠脊髓背角自噬水平抑制炎癥反應,與上述研究結果一致。