dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1介導(dǎo)的RNAi對煙草靶斑病的抑制作用

王 妍，郭 依，汪漢成，蔡劉體，安夢楠，張 崇，吳元華*

1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽市沈河區(qū)東陵路120號 110866

2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號 550081

煙草靶斑?。╰obacco target spot）是由立枯絲核菌（RhizoctoniasolaniKühn）引起的一種真菌病害，染病煙株葉片有病斑，病斑淺褐色且形狀不規(guī)則，病斑壞死部分易脫落形成穿孔［1］。煙草靶斑病常發(fā)生在煙草旺長期至成熟期，潛育期短，流行性強(qiáng)，危害嚴(yán)重［1-2］。自2006年在我國遼寧丹東首次報(bào)道煙草靶斑病后，廣西、云南、貴州、四川、湖北、湖南、黑龍江和吉林等地區(qū)也陸續(xù)發(fā)生該病危害［3-9］。目前化學(xué)藥劑仍是防治煙草靶斑病的主要手段，但長期使用化學(xué)藥劑容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題［10］，故迫切需要一種環(huán)境友好的防治新方法。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是真核生物共有的一種由RNA介導(dǎo)的保守調(diào)節(jié)機(jī)制，由基因特異性雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）觸發(fā)，隨后dsRNA被RNase Ⅲ樣核酸內(nèi)切酶切割成21～24 nt 的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）。這些siRNA 以同源配對的形式靶向目標(biāo)基因，達(dá)到在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平沉默或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的目的［11-13］。近年來，RNAi 技術(shù)在植物病蟲害防治方面得到廣泛應(yīng)用［14］，噴霧誘導(dǎo)基因沉默（spray-induced gene silencing，SIGS）是實(shí)現(xiàn)RNAi的一種方法，該方法通過外源噴施dsRNA，誘導(dǎo)與病原菌生長發(fā)育和致病相關(guān)基因的沉默，從而降低病原菌的致病力［15］。Koch 等［16］通過在大麥葉片表面噴施靶向禾谷鐮孢菌麥角甾醇生物合成基因（CYP51A、CYP51B和CYP51C） 的 長 dsRNA（CYP3-dsRNA），顯著降低該真菌CYP51A、CYP51B和CYP51C的表達(dá)量，減輕了對大麥的危害。Rao 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，多聚半乳糖醛酸酶（Polygalaturonase，PG）的關(guān)鍵候選基因AG1IA_04727在水稻紋枯病感染期間顯著上調(diào)，靶向AG1IA_04727的dsRNA 在水稻中的穩(wěn)定表達(dá)可有效沉默該基因，抑制水稻紋枯病的發(fā)生。RhizoctoniasolaniAG-3 融合群強(qiáng)致病力菌株YC-9 可產(chǎn)生內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（endo polygalacturonases，endoPGs），該酶能夠降解植物細(xì)胞壁果膠骨架結(jié)構(gòu)，故endoPGs 被認(rèn)為是煙草靶斑病的致病因子之一［18］。此外，促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP 激酶）是一類真核生物都具有的蛋白激酶，能夠參與基因表達(dá)及細(xì)胞的生長、發(fā)育、分裂、死亡等多種生理過程［19］。Tiwari 等［20］通過宿主傳遞的RNAi 有效沉默了RhizoctoniasolaniAG1-IA的致病性MAP激酶1同源物RPMK1-1和RPMK1-2，顯著抑制了該病原菌對水稻的侵染。然而，RNAi防治煙草靶斑病的研究還鮮見報(bào)道。因此，以RhizoctoniasolaniYC-9的endoPGs和MAP 激酶為靶點(diǎn)，通過體外轉(zhuǎn)錄的方式合成dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1，采用SIGS 方法對煙草離體葉片和大田煙株噴施dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1，分析其對煙草靶斑病的防治效果，旨在為煙草靶斑病的綠色防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

普通煙草K326 幼苗培養(yǎng)于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室的溫室中，成苗后移栽至沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)科研試驗(yàn)基地。RhizoctoniasolaniYC-9 菌株由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒研究室分離并培養(yǎng)在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱（北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司）中的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上。Trans2K?DNA Marker 和Trans2K?Plus ⅡDNA Marker 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）井岡霉素可溶液劑購自沈陽紅旗林藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1endoPGs和RMK1的擴(kuò)增

使用RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取RhizoctoniasolaniYC-9 總RNA。使用HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）反轉(zhuǎn)錄合成RhizoctoniasolaniYC-9 cDNA。使用引物對endoPGs_F：5'-CTCGCCCTTTTTGCTCTCCC-3'和endoPGs_R：5'- AAGCTTGGACATAACCAGCG-3'通過PCR 擴(kuò)增endoPGs；使用引物對RMK1_F：5'-CGAGATCAAGCTACTCAGAC-3' 和RMK1_R：5'-GAATGTGAGCATGACCTCGG-3'通過PCR 擴(kuò)增RMK1。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。通過1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后將獲得的PCR 產(chǎn)物分別與pMD19-T載體［寶生物工程（大連）有限公司］進(jìn)行連接，將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，在GenBank 中根據(jù)序列同源性進(jìn)行BLAST比對。

1.2.2 dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1的體外轉(zhuǎn)錄

使用5'端帶有T7啟動(dòng)子的引物對T7-endoPGs_F：5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTCGCCCTTTTTGCTCTCCC-3'和endoPGs_R：5'-AAGCTTGGACATA ACCAGCG-3'，endoPGs_F：5'-CTCGCCCTTTTTGCTCTCCC-3'和T7-endoPGs_R：5'- TAATACGACTCAC TATAGG GAAGCTT GGACATAACCAGCG-3'分別擴(kuò)增dsRNA-endoPGs的模板1 和模板2；使用T7-RMK1_F：5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA GATCAAGCTACTCAGAC-3'和RMK1_R：5'-GAATGTGAGCATGACCTCGG-3'，RMK1_F：5'-CGAGATCAAGCTACTCAGAC-3'和T7-RMK1_R：5'-TAATA CGACTCACTATAGGGGAATGTGAGCATGACCT CGG-3'分別擴(kuò)增dsRNA-RMK1的模板1 和模板2。反應(yīng)條件同1.2.1 節(jié)。使用T7 RNAi Transcription Kit 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將獲得的模板1 和模板2 合成dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1。通過2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

1.2.3 dsRNA-endoPGs 和dsRNA-RMK1對離體葉片煙草靶斑病病斑的抑制效果測定

將溫室栽培7～8 葉期的普通煙草K326 離體葉片正面朝上平鋪在玻璃皿（30 cm×30 cm）上，葉片下方墊有用無菌水浸潤過的2層紗布，葉片莖部用無菌水浸潤過的棉花包裹進(jìn)行保濕。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，分別向葉片表面噴施200 μg dsRNA-endoPGs（T1）、200 μg dsRNA-RMK1（T2）、200 μL 8%井岡霉素可溶液劑的500 倍稀釋液（T3）和200 μL 無菌水（對照，T4）。每個(gè)處理3 片煙草葉片，重復(fù)3 次。24 h 后在煙草葉片葉脈的兩側(cè)分別用無菌注射器針頭制造1個(gè)小傷口，將直徑為5 mm的RhizoctoniasolaniYC-9菌餅接種于葉片傷口處并于28 ℃的人工氣候溫室培養(yǎng)7 d，光處理周期為16 h光照/8 h黑暗。采用十字交叉法［21］測量病斑直徑，計(jì)算病斑抑制率，計(jì)算公式如下：

1.2.4 dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的大田防治效果測定

dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1防治煙草靶斑病的大田試驗(yàn)于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)科研試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)處理，分別向葉片表面噴施20 μg/mL的dsRNA-endoPGs（T1）、20 μ g/mL 的dsRNA-RMK1（T2）、8%井岡霉素可溶液劑500 倍稀釋液（900 mL/hm2，T3）和無菌水（對照，T4）。每個(gè)處理5株煙株，重復(fù)3次。每個(gè)處理為1個(gè)小區(qū)，共12個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列。每7 d 施藥1 次，共施藥3 次。分別于首次施藥后7、14、21 d 對各處理煙草植株全株葉片進(jìn)行調(diào)查，根據(jù)單株每個(gè)葉片病斑面積占單株每個(gè)葉片面積的百分比進(jìn)行分級（葉片無病斑為0級；病斑面積占葉片面積的1%以下為1級；病斑面積占葉片面積的1%～10%以下為3 級；病斑面積占葉片面積的10%～30%為5級；病斑面積占葉片面積的31%～50%為7級；病斑面積占葉片面積的51%以上為9級）［22］，并記錄葉片總數(shù)和各級葉片數(shù)量，計(jì)算病情指數(shù)和相對防效，計(jì)算公式如下：

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2021 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析，采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行處理間的差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 endoPGs和RMK1的擴(kuò)增結(jié)果

以RhizoctoniasolaniYC-9 的cDNA 為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到endoPGs（562 bp）和RMK1（412 bp）（圖1）。

圖1 endoPGs和RMK1的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretogram for endoPGs and RMK1

2.2 dsRNA-endoPGs 和dsRNA-RMK1 的體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果

使用T7 RNAi Transcription Kit 試劑盒構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄dsRNA 體系，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分別得到dsRNA-endoPGs（562 bp）和dsRNA-RMK1（412 bp）（圖2）。

圖2 dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoretogram for dsRNA-endoPGs and dsRNA-RMK1

2.3 dsRNA-endoPGs 和dsRNA-RMK1 對離體葉片煙草靶斑病病斑的抑制效果

將噴施dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK124 h后接種RhizoctoniasolaniYC-9的煙草離體葉片培養(yǎng)于28 ℃的人工氣候溫室（16 h 光照/8 h 黑暗），接種后7 d 煙草離體葉片病斑見圖3。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的病斑抑制率分別為62.10%和60.00%（表1）。

表1 不同處理對離體葉片煙草靶斑病病斑抑制率①Tab.1 Inhibition rates of different treatments on tobacco target spot lesions for tobacco leaves in vitro

2.4 dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的大田防治效果

dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的大田防治效果試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1均能有效抑制RhizoctoniasolaniYC-9對煙草的侵染。使用dsRNA-endoPGs3次對煙草靶斑病的相對防效分別為58.88%、53.11%和50.38%，使用dsRNA-RMK13 次對煙草靶斑病的相對防效分別為57.51%、53.85%和50.19%，雖均低于8%井岡霉素可溶液劑，但仍然顯示出較好的防治效果（表2）。

表2 不同處理對煙草靶斑病的大田防治效果Tab.2 Control efficacies of different treatments on tobacco target spot in field

3 討論

離體葉片煙草靶斑病病斑抑制效果試驗(yàn)和煙草靶斑病大田防治效果試驗(yàn)結(jié)果表明，向煙草葉片表面噴施dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1可有效抑制RhizoctoniasolaniYC-9 對煙草的侵染，這與McLoughlin等［12］在葉片表面噴施dsRNA顯著抑制甘藍(lán)型油菜上核盤菌侵染的研究結(jié)果一致。dsRNAendoPGs和dsRNA-RMK1對煙草靶斑病的相對防效低于對照藥劑8%井岡霉素可溶液劑，可能是由于本研究中的dsRNA不夠穩(wěn)定，在使用過程中被降解。納米載體介導(dǎo)的RNAi遞送系統(tǒng)具有高效、穩(wěn)定、低劑量、緩釋等優(yōu)點(diǎn)［23］，下一步可考慮根據(jù)周晨等［24］的研究結(jié)果，使用殼聚糖和CQD納米粒子與dsRNA進(jìn)行混合，形成穩(wěn)定的復(fù)合顆粒，還可根據(jù)王嘉琪等［25］的研究結(jié)果，將層狀雙氫氧化物（layered double hydroxide，LDH）與dsRNA融合，進(jìn)一步提高dsRNA-endoPGs和dsRNARMK1防治煙草靶斑病的效果。

4 結(jié)論

以endoPGs 和MAP 激酶作為RhizoctoniasolaniYC-9 的RNAi 靶點(diǎn)，合成了dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1。將dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK1噴施于煙草葉片表面有效抑制了煙草靶斑病的發(fā)生。離體葉片煙草靶斑病病斑抑制效果試驗(yàn)中，dsRNA-endoPGs和 dsRNA-RMK1對RhizoctoniasolaniYC-9的病斑抑制率分別達(dá)62.10%和60.00%；煙草靶斑病大田防治效果試驗(yàn)中，使用dsRNA-endoPGs和dsRNA-RMK13次對煙草靶斑病的相對防效均高于50%。