一株二型蠟蚧菌的鑒定及其對煙蚜的致病性和防效

羅毅紅，劉明科，胡 剛，李茂業(yè)，劉 蘇*

1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室，合肥市蜀山區(qū)長江西路130號 230036

2.中國煙草總公司四川省公司科技處，成都市高新區(qū)世紀(jì)城路936號 610041

煙蚜（Myzuspersicae）又稱桃蚜，是為害煙草的重要害蟲［1］。煙蚜通過刺吸煙草汁液、引發(fā)煤污病以及傳播多種病毒病等方式嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)［2-3］。目前對煙蚜的防治主要依賴化學(xué)殺蟲劑，但化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用，造成了煙蚜的抗藥性逐年增強［4-6］。因此，亟需開發(fā)針對煙蚜的高效生物防治技術(shù)，以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量。昆蟲病原真菌（又稱蟲生真菌）是能夠從體表侵入昆蟲體內(nèi)寄生并使昆蟲發(fā)病致死的真菌，已被作為一種生物防治手段用于控制害蟲種群數(shù)量［7］。前人已經(jīng)開展了一系列有關(guān)昆蟲病原真菌對煙蚜致病性的研究。田佳等［8］分離了1株球孢白僵菌（Beauveriabassiana）BQ-63菌株，該菌處理煙蚜無翅成蚜7 d 后的校正死亡率為90.1%。孟豪等［9］研究了玫煙色棒束孢（Paecilomyces furmosoroseus）IF-1106菌株對煙蚜的致病力，發(fā)現(xiàn)試蟲的累計死亡率達(dá)到91.7%。鄧建華等［10］發(fā)現(xiàn)粉擬青霉（Paecilomycesfarinosus）Pf-27 菌株處理煙蚜5 d 后的感染率達(dá)到98.0%。

蠟蚧菌是一類寄主范圍廣泛的昆蟲病原真菌［11］，其中的一些種類如蠟蚧輪枝菌（Verticillium lecanii）［12］、刀孢蠟蚧菌（Lecanicilliumpsalliotae）［13］和長孢蠟蚧菌（L.longisporum）［14］等均對煙蚜具有較強的侵染力。但目前二型蠟蚧菌（L.dimorphum）對煙蚜致病性的研究鮮見報道。為此，從野外采集的染菌煙蚜上分離了1 株二型蠟蚧菌（編號HFLD1），并通過生物測定分析該菌株對煙蚜的致病性，同時通過田間試驗評價了該菌株對煙蚜的防效，以期為利用該菌株開發(fā)煙蚜生物防治新產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

于2020年5月在安徽省合肥市大楊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)園采集染菌煙蚜。將其置于75%乙醇中消毒10 s，再置于滅菌蒸餾水中清洗3 次。用接種針從其體表上挑取孢子，采用劃線法接種于薩氏培養(yǎng)基（SDAY）平板，于（25±1）℃、相對濕度75%±2%條件下全黑暗環(huán)境培養(yǎng)7 d，再挑取少量孢子至新的SDAY平板純化培養(yǎng)。純化后的菌株轉(zhuǎn)接到SDAY 斜面上，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試蟲源

供試煙蚜為本實驗室飼養(yǎng)種群［15］。將無翅胎生雌蚜單頭接于煙草（品種為云煙87）植株上，在（25 ±1）℃，光周期L∶D=16∶8，相對濕度65%±2%條件下飼養(yǎng)，獲得單克隆系種群。選取羽化2 d內(nèi)體型大小一致的健康無翅胎生雌蚜作為供試蟲源。

1.3 菌株形態(tài)觀察

將供試菌株接種于SDAY平板，在（25±1）℃、相對濕度75%±2%、全黑暗環(huán)境下培養(yǎng)10 d。利用光學(xué)顯微鏡［DS-Ri2 型，尼康精機（上海）有限公司］觀察菌絲和孢子等形態(tài)特征。將滅菌玻璃紙貼在新的SDAY 平板表面，將供試菌株涂布接種于玻璃紙上，培養(yǎng)7 d后將玻璃紙揭下并剪成小塊放入2.5%戊二醛溶液中固定12 h。固定后的樣品用梯度乙醇溶液（體積濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%）逐級脫水10 min，再用叔丁醇置換樣品中的乙醇。將樣品用CO2臨界點干燥儀（K850型，英國Quorum 公司）干燥2.5 h，再經(jīng)高速離子濺射儀（E-1010 型，日立科學(xué)儀器有限公司）在樣品表面噴鍍一層金屬導(dǎo)電膜后，在掃描電鏡（TM-1000 型，日立科學(xué)儀器有限公司）下觀察并拍照。

1.4 菌株ITS序列擴增

使用UNIQ-10 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取菌株基因組DNA，利用通用引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3'）擴增其ITS 序列［16］。使用KOD FX 高保真DNA 聚合酶［東洋紡（上海）生物科技有限公司］進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系50 μL。其中，2×PCR buffer 25 μL，dNTPs 10 μL，上、下游引物各1.5 μL（0.3 μmol/L），KOD FX 聚合酶1 μL，DNA 模板1 μL（50 ng），無菌水10 μL。反應(yīng)條件：94 °C 預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；68 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒［康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司］回收目的DNA片段。將擴增產(chǎn)物連接pMD18-T載體［寶生物工程（大連）有限公司］，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株后，送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株ITS 序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫，使用BLAST 在線程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性比對。下載同源性較高的蠟蚧菌不同菌種ITS 序列，先利用ClustalW 程序（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進(jìn)行序列連配，連配結(jié)果導(dǎo)入MEGA X 軟件，使用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹各分支置信度經(jīng)過Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗［17］。

1.6 菌株致病性測定與侵染癥狀觀察

從SDAY 平板上收集分生孢子，在滅菌的0.05% Tween-80水溶液中充分分散，配制成5個不同濃度（1×104、1×105、1×106、1×107和1×108個/mL）的孢子懸浮液。采用浸蟲法對煙蚜進(jìn)行致病性測定，用毛筆尖挑取無翅成蚜浸入孢子懸浮液中，5 s 后取出。待試蟲體表液體自然風(fēng)干后，將其轉(zhuǎn)接到新鮮煙草葉片上（葉柄處棉球保濕）并置于潔凈的玻璃培養(yǎng)皿中，放入（25±1）℃、光周期L∶D=16∶8、相對濕度65%±2%的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。每個處理30 頭試蟲，以0.05% Tween-80 無菌水溶液作為對照，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。每天觀察菌株侵染試蟲的癥狀，并記錄死蟲數(shù)。用毛筆尖碰觸試蟲，足與觸角皆不動者視為死亡。將死亡的試蟲保濕培養(yǎng)，并觀察蟲體表面菌絲生長情況，以確定是否被真菌侵染致死。

1.7 田間試驗

田間試驗在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)萃園實驗基地進(jìn)行。供試煙草品種為云煙87，株行間距為100 cm × 80 cm，采用常規(guī)水肥管理，整個生育期內(nèi)未使用任何殺蟲劑、殺菌劑和除草劑。試驗設(shè)3 個處理，分別噴施1×106、1×107和1×108個/mL的懸浮液（0.05% Tween-80水溶液配制）。對照僅噴施0.05% Tween-80。處理和對照均重復(fù)3次，共12個小區(qū)，每小區(qū)面積20 m2。使用電動噴霧器（3WBD-16 型，臺州市嘉能植保機械廠）進(jìn)行整株噴霧，保證葉片正反面液滴分布均勻。噴霧前采用五點取樣法從每個小區(qū)固定選取10株煙草，每株固定選取3片葉，用標(biāo)簽標(biāo)記后調(diào)查蟲口基數(shù)。分別于噴霧后3 d、5 d 和7 d 調(diào)查各處理植株葉片上的活蟲數(shù)，并計算蟲口減退率和防效。

計算公式：

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)輸入WPS Office 2019版軟件，使用DPS軟件［18］的Probit 模塊求得毒力回歸方程和致死中時間（median lethal time，LT50），用單因素方差分析法和Tukey’s HSD法分析不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征

HFLD1 菌株在SDAY 平板上培養(yǎng)10 d 后，菌落直徑約6.8 cm，整體呈薄絮狀，質(zhì)地較密，菌絲不蓬松。菌落正面乳白色，孢子粉白色（圖1A），菌落背面乳黃色（圖1B）。分生孢子梗自菌絲上直接長出，單生、對生或3～4 個輪生；分生孢子梗較長，且向上逐漸變細(xì)，形成瓶梗（圖1C、D）。分生孢子在瓶梗頂部黏附、聚集，形成分生孢子頭（圖1E），分生孢子圓柱形，兩端圓（圖1F）。在適宜的培養(yǎng)環(huán)境下，菌株產(chǎn)生大量結(jié)晶（圖1G）?；谝陨咸卣?，初步判斷HFLD1為蠟蚧菌屬真菌。

圖1 HFLD1菌株的培養(yǎng)形狀與形態(tài)特征Fig.1 Shape and morphological characteristics of HFLD1 strain

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

以HFLD1 菌株的基因組DNA 為模板，擴增出一段577 bp 的ITS 序列（已提交至GenBank，登錄號：MZ572198）。將該序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中其他真菌物種的序列進(jìn)行BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)HFLD1菌株的ITS 序列與多個蠟蚧菌物種的ITS 具有較高的同源性。選取GenBank 數(shù)據(jù)庫中蠟蚧菌屬（Lecanicillium）共12 個代表性菌種的ITS 序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖2）表明，HFLD1 菌株與二型蠟蚧菌CBS 363.86（NR_111101）的親緣關(guān)系最近，因此鑒定HFLD1為二型蠟蚧菌。該菌已于2022年3月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC No.40114。

圖2 基于ITS序列的HFLD1菌株和其他蠟蚧菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of HFLD1 strain and other Lecanicillium species based on ITS sequences

2.3 菌株對煙蚜的致病性及其侵染過程

配制HFLD1菌株不同濃度孢子懸浮液，分析其對煙蚜的致病性。結(jié)果（表1）顯示，孢子懸浮液濃度越大，試蟲死亡率越高。孢子懸浮液濃度為1×108個/mL 時，處理后7 d 試蟲累計校正死亡率達(dá)到95.06%，顯著高于其他濃度處理的累計校正死亡率。使用Probit模型計算HFLD1菌株不同濃度孢子懸浮液致死煙蚜的LT50，結(jié)果（表2）表明，1×108個/mL濃度下的LT50最短，為3.28 d。

表1 HFLD1菌株侵染導(dǎo)致的煙蚜死亡率①Tab.1 Mortality rate of Myzus persicae after infection with HFLD1 strain

表2 HFLD1菌株對煙蚜的致病性回歸分析Tab.2 Regression equations of pathogenicity of HFLD1 strain against Myzus persicae

使用1×108個/mL懸浮液接種煙蚜，觀察HFLD1菌株侵染過程。接種1 d后，試蟲未見明顯變化；2 d后，試蟲行動逐漸變得遲緩，3 d后，頭部和胸腹部變?yōu)榧t褐色至褐色，4 d后，蟲體干癟皺縮，胸腹部和足變?yōu)樯詈稚w表開始出現(xiàn)白色菌絲，之后菌絲逐漸布滿整個蟲體，見圖3。

圖3 煙蚜無翅成蚜感染HFLD1菌株后的外部癥狀Fig.3 Morphological characteristics of wingless adults of Myzus persicae after inoculation with HFLD1 strain

2.4 菌株對煙蚜的田間防效

不同濃度HFLD1 孢子懸浮液對煙蚜的田間防效如表3所示。從表3 中可見，使用1×108、1×107和1×106個/mL 懸浮液處理后3 d，對煙蚜的防效均較低，分別為34.10%、27.67%和24.64%。處理后5 d，3個處理組的防效均有所提高。其中以1×108個/mL懸浮液處理組的防效最高，為69.57%。處理7 d后，1×108個/mL 懸浮液處理組的防效仍為最高，達(dá)到79.87%，且顯著高于1×107個/mL 處理（67.50%）和1×106個/mL 處理的防效（56.01%）。總體來看，HFLD1菌株對煙蚜的防效隨著孢子濃度和處理時間的增加而提高。

表3 HFLD1菌株對煙蚜的防治效果Tab.3 Control efficacy of HFLD1 strain against Myzus persicae

3 討論

昆蟲病原真菌能夠迅速侵染昆蟲并致其死亡，因此可以利用其開展害蟲生物防治，以減少化學(xué)農(nóng)藥使用量［7］。昆蟲病原真菌對害蟲的侵染包括體表附著、體壁穿透、體內(nèi)定殖等階段［19］。本研究中發(fā)現(xiàn)HFLD1菌株侵染煙蚜后，試蟲行動逐漸遲緩，蟲體顏色變深且干癟皺縮。這一現(xiàn)象可能是由于HFLD1菌株已經(jīng)侵入煙蚜血腔，破壞細(xì)胞和組織，消耗蟲體養(yǎng)分，導(dǎo)致煙蚜活力減弱，直至死亡。當(dāng)HFLD1 菌株在煙蚜體內(nèi)生長一定時間后，則從蟲體薄弱處穿出，因此本研究觀察到試蟲體表出現(xiàn)大量菌絲并產(chǎn)生大量孢子。這些新生的孢子可作為侵染源，持續(xù)控制煙蚜的種群數(shù)量［11］。

評價昆蟲病原真菌是否具有應(yīng)用于害蟲生物防治的潛力，致病性是重要的評價標(biāo)準(zhǔn)之一。前人研究發(fā)現(xiàn)，使用蠟蚧輪枝菌和刀孢蠟蚧菌處理煙蚜7 d后，試蟲的校正死亡率分別為84.99%和83.56%［12-13］；而使用長孢蠟蚧菌處理煙蚜10 d 后，試蟲校正死亡率為74.5%［14］。本研究中還發(fā)現(xiàn)，HFLD1 菌株接種煙蚜7 d 后，試蟲校正死亡率達(dá)到95.06%。因此，HFLD1菌株對煙蚜的致病性強于前人報道的其他蠟蚧菌種類。導(dǎo)致差異的原因可能是HFLD1 菌株分離自染菌煙蚜具有較強的寄主專化性，一般認(rèn)為源自寄主的病原真菌對該寄主的致病性要高于來自其他寄主的病原真菌［20］。另一方面，煙蚜對不同種類病原真菌的免疫防御機制具有差異，可能也是導(dǎo)致真菌致病性不同的原因之一［21］。

本研究中HFLD1 對煙蚜的田間防效隨著孢子濃度和處理時間的增加而提高。當(dāng)HFLD1 濃度為1×108個/mL 時，處理7 d 后對煙蚜的防效達(dá)到79.87%。表明HFLD1 菌株對煙蚜具有較好的控制作用，可用于開發(fā)防治煙蚜的生物防治產(chǎn)品。但本研究中僅分析了單獨使用HFLD1 菌株對煙蚜的防效，未考察HFLD1菌株與其他防治措施對煙蚜的協(xié)同防治效果。已有文獻(xiàn)報道昆蟲病原真菌與低劑量殺蟲劑聯(lián)用，不僅能提高殺蟲效率，還有助于農(nóng)藥減量化［22］。因此，后續(xù)研究將聯(lián)合使用HFLD1菌株和高效低毒殺蟲劑，并評價其對煙蚜的防效。另一方面，在田間環(huán)境中，昆蟲病原真菌對害蟲的防治效果會因為低濕度的影響而下降［23］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過噴施水霧增加環(huán)境濕度，能夠?qū)⒗ハx病原真菌的田間防效提高30%以上［24］。因此，后續(xù)試驗將根據(jù)煙草品種的特性合理調(diào)控環(huán)境濕度因子，最大化地發(fā)揮HFLD1菌株對煙蚜的控制作用。

4 結(jié)論

從自然染菌的煙蚜上分離出1 株二型蠟蚧菌HFLD1。室內(nèi)條件下，使用濃度為1×108個/mL 的HFLD1孢子懸浮液侵染煙蚜7 d后煙蚜死亡率達(dá)到95.06%，LT50僅為3.28 d；田間條件下，使用1×108個/mL 的HFLD1 孢子懸浮液處理7 d 后對煙蚜的防效為79.87%。HFLD1菌株對煙蚜具有極高的致病性，具有用于煙蚜生物防治的潛力。