液體活檢在直腸癌新輔助治療中的研究進展

趙韻琳 黃 詩 柯舒慧 林丹丹

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢 430060

液體活檢是指從體液中檢測各種指標(biāo)，主要是采集血液樣本，檢測指標(biāo)包括細胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、微RNA（microRNA，miRNA）等。血液樣本較組織樣本更易獲取、侵入性更小、監(jiān)測更便捷，且液體活檢為分子層面的檢測，較腫瘤標(biāo)志物更具特異性，能制訂個性化的檢測策略。

對于中低位局部晚期直腸癌（locally advanced rectal cancer，LARC），新輔助治療后達臨床完全緩解（clinical complete response，cCR）的患者甚至可行觀察和等待（watch and wait，W&W）方案，與行全直腸系膜切除術(shù)的患者生存預(yù)后基本無差異[1]。評估LARC 患者新輔助治療效果、監(jiān)測疾病的復(fù)發(fā)及預(yù)測生存預(yù)后對患者治療方案的選擇及其重要，常用的血液學(xué)指標(biāo)癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）特異性不高且結(jié)果較為單一[2]，因此，故探索創(chuàng)傷性更小、更簡便且特異性更高的指標(biāo)尤為重要。

研究證實液體活檢在結(jié)直腸癌相關(guān)的多項研究中與疾病的早期發(fā)現(xiàn)、療效預(yù)測及復(fù)發(fā)監(jiān)測等多個節(jié)點相關(guān)[3]。

1 循環(huán)腫瘤DNA

1.1 ctDNA 在監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)中的應(yīng)用

腫瘤細胞向血液中分泌單鏈或雙鏈DNA 片段，此片段稱為ctDNA。ctDNA 的半衰期（約2 h）使其能夠用于動態(tài)和實時監(jiān)測癌癥進展，且ctDNA 的檢測減少了腫瘤內(nèi)基因異質(zhì)性相關(guān)的偏倚，能從微觀層面特異性監(jiān)測腫瘤發(fā)生與發(fā)展[4]。早在2015 年就有研究者對接受nCRT 的LARC 患者進行ctDNA 的連續(xù)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)患者治療后ctDNA 下降，在CEA、影像學(xué)及病理監(jiān)測到疾病復(fù)發(fā)前ctDNA 進行性升高[5]。對于目前LARC 中尚未大規(guī)模推行的W&W 策略，及時檢測到疾病復(fù)發(fā)并接受搶救性手術(shù)尤為重要，Boniface 等[6]長期監(jiān)測接受W&W 的LARC 患者，發(fā)現(xiàn)ctDNA 的升高早于臨床檢測的疾病復(fù)發(fā)，且其中1 例患者因局部復(fù)發(fā)行搶救性手術(shù)后ctDNA 下降。

這些研究顯示ctDNA 能用于LARC 的復(fù)發(fā)監(jiān)測，靈敏度比血液指標(biāo)CEA 更高[5-6]。因此可在監(jiān)測到患者ctDNA 升高時密切關(guān)注病情變化，有助于盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，進一步改善患者預(yù)后。

1.2 ctDNA 在評估患者nCRT 后最小殘留病灶中的應(yīng)用

LARC 患者經(jīng)放化療或手術(shù)后ctDNA 的檢測率會有所下降，提示ctDNA 可能是由原發(fā)腫瘤釋放[7]。而Liu 等[8]通過收集LARC 患者基線、nCRT 治療過程中、nCRT 后及手術(shù)前的血樣預(yù)測最小殘留病灶（minimal residual diseases，MRD），發(fā)現(xiàn)ctDNA 狀態(tài)和病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）之間并沒有關(guān)聯(lián)。盡管有研究在術(shù)前48 h 內(nèi)采集血樣，但也得到了相同的結(jié)論[7]?，F(xiàn)有研究支持了ctDNA 分析無法區(qū)分LARC 患者新輔助治療后最小和無殘留局部病灶的觀點，目前不能用于選擇患者進行非手術(shù)治療（W&W 策略）[9-11]。但可通過ctDNA 的變化預(yù)估LARC 患者nCRT 療效，有望與其他檢測技術(shù)共同判斷MRD 存在與否，為患者制訂個性化治療策略[12-13]。

1.3 ctDNA 與腫瘤分期及生存時間的關(guān)聯(lián)

在LARC 患者中治療前ctDNA 定量或者是否存在ctDNA 均與腫瘤TNM 分期無關(guān)，不同的檢測技術(shù)得到的結(jié)論是相同的，但較高的ctDNA 定量與較高的死亡風(fēng)險和大概率的遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)[14-16]。術(shù)后可檢測到ctDNA 的LARC 患者無復(fù)發(fā)生存時間顯著短于術(shù)后不可檢測到ctDNA 的患者[9]。在LARC 患者新輔助治療后，NAR 評分通過治療前后T 和N 的分期計算，能間接反映接受新輔助治療的LARC 患者的最終生存結(jié)局，NAR 分值越低患者無病生存期越長[17]。Mcduff 等[15]采用NAR 評分將LARC 患者分組，并分析入組的29 例患者監(jiān)測基線、nCRT 后及術(shù)后1～5 個月的ctDNA 變化，判斷ctDNA 變化與NAR 關(guān)系，發(fā)現(xiàn)nCRT 后未檢測到ctDNA 與檢測到ctDNA 的患者比較，具有更高比例的NAR 低分和NAR 中分，進一步證實了ctDNA 能預(yù)估接受nCRT 治療的LARC 患者的生存預(yù)后。

2 其他液體活檢指標(biāo)

2.1 細胞游離DNA

cfDNA 是指循環(huán)血液中的核酸類物質(zhì)，在正常人血樣中也存在[18]。有項研究證實LARC 新輔助放化療（neoadjuvant radiochemotherapy，nCRT）前cfDNA 水平有利于鑒別高低危患者，基線cfDNA 水平高于第75個四分位數(shù)的患者與低于第75 個的四分位數(shù)患者比較，局部或遠處復(fù)發(fā)的風(fēng)險更高，無復(fù)發(fā)生存時間更短[19]。由于cfDNA 本身特異性不高，在LARC 患者評估中發(fā)揮作用較小，單用cfDNA 總量無法準(zhǔn)確判斷患者生存預(yù)后，判斷nCRT 療效亦存在一定困難[20]。

2.2 循環(huán)腫瘤細胞

CTC 為患者體液中的腫瘤細胞，部分研究采取測定mRNA 狀態(tài)判定CTC 的存在，而主要檢測方法仍是通過特異性靶點，著重于CTC 檢出與預(yù)后的關(guān)系，進一步分析CTC 上表達靶點對pCR 的預(yù)測作用[21]。

2.2.1 CTC 與患者生存預(yù)后 對腫瘤患者而言，CTC 檢出率越高往往提示疾病預(yù)后不佳[21]，與以往研究結(jié)果不同，Magni 等[22]通過CellSearch System 識別接受nCRT的LARC 患者血液中有細胞核且胞質(zhì)表達CD45 靶點的CTC，CTC 陽性并沒有達到統(tǒng)計學(xué)意義上的與預(yù)后相關(guān)。但該研究中CTC 的檢測效率較低，檢測效率是否影響了實驗結(jié)果無法評估，所以CTC 能否預(yù)估LARC 患者nCRT 后的生存狀態(tài)仍存在爭議，未來需大量實驗驗證。

2.2.2 CTC 評估nCRT 后反應(yīng) 多項研究表明，CTC 檢出率及RAD23B/TYMS 是否缺失與腫瘤療效相關(guān)，在LARC 患者nCRT 中也得到了相同的結(jié)果，即CTC 檢出率越高、RAD23B/TYMS 缺失者療效更差[23-25]。為了進一步評估CTC 能否輔助檢測LARC 患者的MRD，有研究將PET、高分辨率MRI、CT 灌注成像及CTC 綜合檢測MRD，表明當(dāng)與CT 灌注成像的全腫瘤通透性和平均通過時間測量相結(jié)合時，CTC 可能有助于提高治療反應(yīng)評估的準(zhǔn)確性[26]。由于CTC 的檢測技術(shù)不同，效率也不盡相同，進一步提高CTC 檢測效率或是尋找更多的靶點能更好識別MRD，為nCRT 后達到cCR 的LARC 患者是否接受手術(shù)治療提供支持依據(jù)。

2.3 微RNA（microRNA，miRNA）

通過檢索發(fā)現(xiàn)miRNA 在新輔助治療LARC 中的應(yīng)用集中在對nCRT 反應(yīng)狀態(tài)的評估，miRNA檢測中多選用特異的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），研究發(fā)現(xiàn)miRNA 相關(guān)SNP-SMAD3-rs744910、SMAD3-rs745103 和TRBPrs6088619 與nCRT 后pCR 率增加相關(guān)，而DROSHA rs10719 和SMAD3-rs17228212 提示更差的治療反應(yīng)[27]。還有研究比較了LARC 患者中對nCRT 敏感及不敏感的組別中的miRNA，確定miRNA-345 為檢測指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)基線血樣中miRNA-345 低表達與nCRT 高應(yīng)答顯著相關(guān)[28]。另有研究提取LARC 患者外泌體中的miR NA，發(fā)現(xiàn)對新輔助治療不敏感的患者中miR-29a-3p高表達和miR-301a-3p 低表達，此外，miR-141-3p、miR-375、miR-423-5p 和miR-431-3p 在LARC 肝轉(zhuǎn)移患者（4 例）中的表達均較高[29]。

不同的miRNA 及miRNA 突變位點能預(yù)測LARC 患者nCRT 療效，但現(xiàn)有研究缺乏miRNA 評估LARC 患者的長期生存預(yù)后的數(shù)據(jù)，有待進一步探索。

3 總結(jié)與展望

本文綜合闡述液體活檢在LARC 新輔助治療中的現(xiàn)狀及應(yīng)用前景，有關(guān)研究探索集中在ctDNA、cfDNA、CRC 和miRNA。目前與LARC 新輔助治療效果預(yù)測及長期預(yù)后監(jiān)測密切相關(guān)的主要是ctDNA，術(shù)前ctDNA 聯(lián)合影像學(xué)可提升pCR 檢出率[30]，術(shù)后ctDNA 可預(yù)測手術(shù)殘存的MRD，較傳統(tǒng)MRI 及CEA檢測能更及時監(jiān)控并預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)，特別是在達到病理完全緩解從而等待觀察的LARC 患者中，能輔助患者盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤病灶，及時進行補救性手術(shù)。

由于液體活檢中基線和新輔助治療后ctDNA 的狀態(tài)無法預(yù)估pCR，限制了單獨使用ctDNA 選擇器官保留方法。ctDNA 的檢測還未標(biāo)準(zhǔn)化，各項實驗中時間節(jié)點、采集部位、檢測方法等方面存在差異。未來研究可以將液體活檢補充至預(yù)測LARC 新輔助治療反應(yīng)的傳統(tǒng)方法中，判斷結(jié)合傳統(tǒng)指標(biāo)能否更好地預(yù)測患者達到pCR，或在新輔助治療甚至全程治療中，監(jiān)測療效、評估預(yù)后及監(jiān)測復(fù)發(fā)，同時對于術(shù)后及等待觀察的患者，更好地尋找下一步干預(yù)節(jié)點及輔助治療手段，評估液體活檢的應(yīng)用是否能進一步提高接受新輔助治療的LARC 患者生存時間和生存質(zhì)量。