中藥遺傳毒性研究現(xiàn)狀及探討

黃財(cái)順,賴昌威,蕭綺珊,鄭文燕,陸璐璐,王乾蕾*

中藥的歷史悠久,廣泛應(yīng)用于各種疾病。但由于中藥的作用機(jī)理較復(fù)雜,其用藥安全性備受關(guān)注。藥物的安全性評(píng)價(jià),除了大眾熟悉的急性毒性試驗(yàn)和長期毒性試驗(yàn),還包括病理組織學(xué)研究、生殖毒性試驗(yàn)、安全藥理學(xué)研究、遺傳毒性研究等。其中,遺傳毒性研究在近十年發(fā)展迅速,已成為藥物安全性評(píng)價(jià)的重要手段。

遺傳毒是惡性腫瘤發(fā)展過程的重要環(huán)節(jié),以基因突變、染色體損傷、DNA損傷等效應(yīng)為基礎(chǔ)。一般情況下,遺傳毒性試驗(yàn)可用于致癌性預(yù)測,是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容,與其他毒理學(xué)研究有著密切的聯(lián)系,是藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)及上市的重要環(huán)節(jié),對(duì)于致癌性、生殖毒性等研究意義重大。擬用于人體的藥物,上市前,應(yīng)考慮進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn),根據(jù)受試物的適應(yīng)癥和作用特點(diǎn)等因素進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。通過一系列的遺傳毒性試驗(yàn),受試物的致畸、致癌、致突變可得到有效預(yù)測,為藥品、化妝品、醫(yī)療器械及保健食品上市前做安全性評(píng)價(jià)。由于大部分遺傳毒性試驗(yàn)的檢測終點(diǎn)不同,所以在進(jìn)行中藥安全性評(píng)價(jià)時(shí),要根據(jù)中藥藥效物質(zhì)的適用證和作用特點(diǎn)等綜合評(píng)估后進(jìn)行遺傳毒性研究,更客觀地分析評(píng)價(jià)。常用的非臨床遺傳毒性試驗(yàn)組合包括沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames)、小鼠染色體畸變(CA)、小鼠微核試驗(yàn)(MN)及彗星試驗(yàn)等[1-8]。

中藥及其相關(guān)制劑的遺傳毒性研究早有報(bào)道,但至今未進(jìn)行系統(tǒng)的綜述。本文對(duì)近十年來關(guān)于中藥遺傳毒性的研究進(jìn)行綜述,總結(jié)相關(guān)研究進(jìn)展。

1 研究進(jìn)展

目前,Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)及精子畸形試驗(yàn)是中藥遺傳毒性研究的三種主要方法。這三項(xiàng)遺傳試驗(yàn)是國際協(xié)調(diào)組織(international conference on harmonization,ICH)推薦的試驗(yàn)組合之一,于2011年正式推廣使用,此后便成為藥物遺傳毒性試驗(yàn)的“黃金組合”。Ames試驗(yàn)是化學(xué)物質(zhì)基因突變的常用檢測方法,全稱為污染物致突變性檢測;微核試驗(yàn)可檢測染色體的損傷狀況,是一種常用的遺傳毒性試驗(yàn)方法;染色體畸變試驗(yàn)是一項(xiàng)致突變性試驗(yàn),是檢測化學(xué)物質(zhì)影響染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的基本方法,用于評(píng)價(jià)受試物致突變的可能性。

根據(jù)藥物的用途,筆者等將文獻(xiàn)報(bào)道過的中藥分為補(bǔ)益、清熱解毒、活血通絡(luò)及其他四大類。

1.1 補(bǔ)益類中藥的遺傳毒性研究 此類藥物的主要作用為補(bǔ)虛扶弱,補(bǔ)益人體物質(zhì)虧損,具有益氣、養(yǎng)血、滋陰、助陽的作用,多用于增強(qiáng)體質(zhì)和免疫力,是應(yīng)用最為廣泛的中藥,也是遺傳毒性研究的重點(diǎn)。楊秀靜等[9]通過Ames試驗(yàn)、細(xì)胞微核試驗(yàn)及畸變試驗(yàn)對(duì)安神膠囊的遺傳毒性進(jìn)行研究,結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)有遺傳毒性;吉雅琪等[10]采用鼠傷寒沙門氏菌TA1535、TA102、TA100、TA98、TA97a進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變(Ames)試驗(yàn),采用ICR小鼠進(jìn)行骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn),采用倉鼠肺成纖維(CHL)細(xì)胞進(jìn)行染色體畸變試驗(yàn),綜合評(píng)估補(bǔ)血益母丸干膏粉的遺傳毒性。刺五加白茯片、冬蟲夏草西洋參復(fù)合物等藥物也有相關(guān)報(bào)道,但均未發(fā)現(xiàn)有遺傳毒性[11-24]。

1.2 清熱解毒類中藥的遺傳毒性研究 清熱解毒藥是指以解熱毒、火毒、疫毒等為主要作用的一類藥物,多用于溫毒、瘟疫及熱毒病證或瘡瘍疔毒的治療。曲見松等[25]通過Ames試驗(yàn)、細(xì)胞微核試驗(yàn)及畸變試驗(yàn)對(duì)小兒牛黃清心散的遺傳毒性進(jìn)行研究,結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)有遺傳毒性;馮丁山等[26]和滕云霞等[27]以同樣的試驗(yàn)方法,未發(fā)現(xiàn)木棉花和宮炎平片有遺傳毒性;但研究牛黃解毒片對(duì)CHL細(xì)胞的DNA損傷作用時(shí),發(fā)現(xiàn)其高濃度水溶液會(huì)引起體外培養(yǎng)的CHL細(xì)胞DNA損傷[28];胡燕平等[29]在基因突變試驗(yàn)(MLA)中發(fā)現(xiàn)兩色金雞菊具有致突變性;宋俊齋等[30]應(yīng)用小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和精子畸形實(shí)驗(yàn)研究中藥細(xì)辛的遺傳毒性,發(fā)現(xiàn)細(xì)辛的水煎液具有致突變作用。

1.3 活血通絡(luò)類中藥的遺傳毒性研究 活血通絡(luò)藥多為苦溫辛散之品,臨床上主要用于氣滯血瘀、經(jīng)脈瘀阻等引起的一些病癥,比如腦血栓、腦梗塞、頭痛、胸痛及風(fēng)濕痹痛等。侯艷等[31]選用ICR小鼠,通過一次性給予丹參注射液方法觀察其毒性反應(yīng),結(jié)合Ames試驗(yàn)和染色體畸變實(shí)驗(yàn),對(duì)丹參注射液做了遺傳毒性研究;馬會(huì)等[32]通過細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))、小鼠睪丸染色體畸變試驗(yàn)和小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的組合方式評(píng)價(jià)三七紅曲復(fù)方制劑的遺傳毒性,結(jié)果未見遺傳毒性作用;浮海石、注射用三七素、銀杏內(nèi)酯B注射液等藥物均未發(fā)現(xiàn)有遺傳毒性[33-37]。田逸君[38]發(fā)現(xiàn),雷公藤內(nèi)酯醇在720 g/kg劑量下可增加骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率,具有潛在的遺傳毒性。

1.4 其他類中藥的遺傳毒性研究 除了上述三大類,其他進(jìn)行了遺傳毒性研究的藥物還包括祛斑藥-當(dāng)歸雙參蛤蟆油片[39]、止咳化痰藥-枇杷葉[40]、清熱除濕藥-三葉白術(shù)湯口服液[41]、開竅藥-通關(guān)散[42]及健胃消食藥-小兒消食片[43]。生附子毒性較強(qiáng),經(jīng)炮制后,毒性大大降低,故鹽附子遺傳毒性試驗(yàn)呈陰性[44]。此外,研究[45]發(fā)現(xiàn),馬兜鈴具有細(xì)胞毒性和較強(qiáng)的致突變性,以誘導(dǎo)大范圍損傷為主;大黃素可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞DNA損傷[46],在S9代謝活化條件下可引起TA1537菌株的突變[47]。二者均具有潛在的遺傳毒性。

2 分析與討論

筆者等在中國知網(wǎng)、萬方及維普數(shù)據(jù)庫分別以“中藥”“遺傳毒性”“基因毒性”等關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,篩選并研讀近15年的相關(guān)文獻(xiàn),重點(diǎn)將藥物品種和結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析匯總于表1。

表1 中藥遺傳毒性研究概況統(tǒng)計(jì)表

從表1可總結(jié)以下幾點(diǎn)信息:(1)中藥遺傳毒性研究結(jié)果大部分為陰性,約占總數(shù)的90%;(2)研究方法主要以FDA推薦的三項(xiàng)遺傳試驗(yàn)組合為主;(3)出現(xiàn)潛在遺傳毒性的藥物多是藥物組方中具有藥性劇烈的藥物,如馬兜鈴、大黃、牛黃等;(4)遺傳毒性評(píng)價(jià)對(duì)象多以成藥制劑為主。中藥制劑成分較多,因配伍不當(dāng)而產(chǎn)生有毒物質(zhì)的事情時(shí)有發(fā)生,所以有必要進(jìn)行配伍藥的遺傳毒性測試。

上述文獻(xiàn)研究中,不同試驗(yàn)的方法學(xué)特點(diǎn)如下:(1)Ames試驗(yàn):大部分中藥制劑采用了50、150、500、1 500、5 000 μg/皿的劑量,但某些中藥提取物會(huì)降低受試物濃度,如雷公藤內(nèi)酯醇[38]受試物設(shè)每皿1.6、8、40、200及1 000 ug共5個(gè)濃度。銀杏內(nèi)酯B注射液[35]則采用2 810、562、112.4、22.5及4.5 ug/皿的劑量;(2)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn):一般采用3d內(nèi)24 h間隔給藥的方法,但可視具體情況調(diào)整。如有研究[46]將大黃素連續(xù)4 d給予KM小鼠1 000 mg/kg后出現(xiàn)6只動(dòng)物死亡,故將劑量調(diào)整為600 mg/kg,給藥時(shí)間調(diào)整為28 d。至于給藥劑量,一般會(huì)以1/2半數(shù)致死量(LD50)為最高劑量,設(shè)低、中、高三個(gè)劑量組;(3)畸變試驗(yàn):一般分為體內(nèi)小鼠精子畸變試驗(yàn)和體外哺乳細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)一般采用環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)作為陽性對(duì)照組,體外試驗(yàn)一般采用0.5 ～ 5 mg/mL濃度的受試物及不含血清的培養(yǎng)液。綜上所述,文獻(xiàn)研究中,大部分學(xué)者會(huì)根據(jù)實(shí)際情況設(shè)置受試物濃度、給藥時(shí)間、給藥劑量等,盡量降低“假陽性”的概率。

3 發(fā)展趨勢及研究策略

遺傳終點(diǎn)具有多樣化特性,導(dǎo)致單個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)不可能涵蓋多個(gè)遺傳終點(diǎn)的檢測,因此探查這些終點(diǎn)需進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)及畸變試驗(yàn)作為最常用的檢測組合,已廣泛應(yīng)用于藥物的遺傳毒性評(píng)價(jià)上。但上述遺傳毒性試驗(yàn)組合的準(zhǔn)確性越來越受到質(zhì)疑,原因在于該試驗(yàn)組合常出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果。藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制復(fù)雜,在體內(nèi)預(yù)期的陽性暴露量下,未必能觀察到該陽性結(jié)果。因此,當(dāng)中藥的遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果為陽性時(shí),首先應(yīng)考慮結(jié)果的特異性,是否存在“假陽性”可能。中藥的作用機(jī)制復(fù)雜,涉及性味歸經(jīng)、組方配伍、整體效應(yīng)等因素,應(yīng)結(jié)合體內(nèi)和體外的遺傳毒性試驗(yàn),謹(jǐn)慎下結(jié)論。

除了“假陽性”,目前,中藥的遺傳毒性研究雖進(jìn)行大量的藥理毒理試驗(yàn),但對(duì)導(dǎo)致遺傳毒性產(chǎn)生的物質(zhì)缺乏研究。此類物質(zhì)包括藥物本身及其雜質(zhì),其中雜質(zhì)的影響最為嚴(yán)重。雜質(zhì)一般在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生,可從原料工藝路線的選擇、質(zhì)控、工藝條件的優(yōu)化等方面避免。雜質(zhì)是引起藥品不良反應(yīng)的重要因素,基因毒性雜質(zhì)(genotoxic impurity,GTI)是導(dǎo)致基因癌癥的一類物質(zhì),能引起DNA突變和重組,也稱遺傳毒性雜質(zhì)。

目前,關(guān)于中藥基因毒性雜質(zhì)檢測的研究并不多,但對(duì)于人體而言,基因毒性雜質(zhì)的可接受限度較小,痕量水平即可產(chǎn)生較大危害,可將雜質(zhì)研究與毒性試驗(yàn)相結(jié)合。圖1為本文提出的研究策略。

圖1 中藥遺傳毒性研究策略圖

國家藥監(jiān)局在2023年發(fā)布了促進(jìn)中藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的若干意見和措施,其中明確規(guī)定要進(jìn)一步加強(qiáng)中藥不良反應(yīng)監(jiān)測,研究開發(fā)符合中藥特點(diǎn)的不良反應(yīng)信號(hào)監(jiān)測工具,對(duì)發(fā)現(xiàn)的安全性風(fēng)險(xiǎn)及時(shí)防控。若能明確引起中藥遺傳毒性的物質(zhì)或雜質(zhì),便可借助儀器設(shè)備進(jìn)行快速篩查,免去傳統(tǒng)的遺傳毒性試驗(yàn)組合所花費(fèi)的時(shí)間,達(dá)到及時(shí)防控的目的。然而,中藥有別于化學(xué)藥物,其成分復(fù)雜,各組分相互作用,藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚且難以明確,更何況是痕量水平的基因毒性雜質(zhì)。盡管化學(xué)藥物已形成一套完整的基于LC/MS和GC/MS的基因毒性雜質(zhì)檢測方法，可快速識(shí)別指針性雜質(zhì)，如亞硝胺類物質(zhì)，但中藥在這方面還是“空白”一片。