基于文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)的農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中抗生素抗性基因的研究進(jìn)展

趙震雄，張宇軒，王麗平，劉瑞志，湯 利

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201

2. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，國(guó)家環(huán)境保護(hù)河口與海岸帶環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012

近年來(lái)，具有廣泛傳播性的有害生物污染成為全球關(guān)注的焦點(diǎn). 抗生素作為一種新污染物，具有生物毒性、環(huán)境持久性、生物累積性等特征[1-2]. 2022 年5 月，《新污染物治理行動(dòng)方案》將抗生素列為重點(diǎn)管控新污染物，需采取源頭禁限、過(guò)程減排及末端治理的全過(guò)程環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)管控措施. 與抗生素自身危害相比，抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的危害更為嚴(yán)重，能夠通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移打破物種間的限制，實(shí)現(xiàn)跨物種傳播[3]. 研究證實(shí)，若抗生素耐藥性問(wèn)題得不到解決，預(yù)計(jì)到2050 年全球每年因抗生素耐藥性問(wèn)題死亡的人數(shù)將達(dá)到1000 萬(wàn)人，造成經(jīng)濟(jì)損失100 萬(wàn)億美元[4]. 近年來(lái)，因農(nóng)藥、獸藥、化肥等的大量使用，以ARGs 為代表的新型生物性污染呈現(xiàn)出復(fù)雜性和多元化特征，作為新的環(huán)境污染問(wèn)題在農(nóng)業(yè)環(huán)境中日益突出. 諸多研究表明，ARGs 會(huì)隨著農(nóng)產(chǎn)品等通過(guò)食物鏈進(jìn)入畜禽動(dòng)物或人體內(nèi)，引發(fā)的抗生素耐藥性問(wèn)題已發(fā)展成為生態(tài)安全和公共健康的嚴(yán)重威脅，但目前關(guān)于農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 的系統(tǒng)研究報(bào)道仍明顯不足. 因此，亟需深入了解農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 的污染現(xiàn)狀及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，以期為未來(lái)農(nóng)業(yè)環(huán)境中抗生素及ARGs 的管控提供理論依據(jù).

1 基于文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)的農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 的研究熱點(diǎn)分析

采用文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)方法，基于CNKI 和Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)，系統(tǒng)分析了近5 年來(lái)農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 的研究熱點(diǎn). 檢索日期為2022 年7 月22 日，設(shè)定檢索主題為“Agriculture”或“Agricultural”中精煉檢索“Antibiotic Resistance Genes”，去重后分別得到CNKI 的183 篇和Web of Science 的115 篇論文. 利用CiteSpace[5]對(duì)檢索到的文獻(xiàn)關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類統(tǒng)計(jì)，并繪制Timeline 圖譜(見(jiàn)圖1). 基于CNKI〔見(jiàn)圖1(a)〕和Web of Science〔見(jiàn)圖1(b)〕兩種檢索方式，聚類模塊值(Q值)分別為0.8443 和0.7326，聚類平均輪廓值(S值)分別為0.9608 和0.9008，表明CiteSpace 能夠?qū)r(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 的數(shù)據(jù)集準(zhǔn)確歸類. 關(guān)鍵詞的整體網(wǎng)絡(luò)Density 值分別為0.0140 和0.0216，表明目前農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 的研究較少且不聚焦. 進(jìn)一步分析Timeline 圖譜，結(jié)果表明農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 的研究主題隨著時(shí)間發(fā)生明顯變化. 具體而言，2017 年，相關(guān)研究主要集中于抗生素及其ARGs 在水和土壤環(huán)境中的相關(guān)性及時(shí)空變化規(guī)律. 2019 年起，關(guān)于抗生素及ARGs 的研究則更多聚焦于水庫(kù)、河流及海水養(yǎng)殖等人為干擾較多的環(huán)境. 截止到2022 年，農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中ARGs 的研究逐漸發(fā)展為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，主要聚焦于探究有機(jī)肥、畜禽糞污和生產(chǎn)生活廢水對(duì)農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中ARGs 生物積累的影響及其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，但相關(guān)研究報(bào)道仍明顯不足.

圖1 基于CNKI 和Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)的農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 相關(guān)研究文獻(xiàn)的CiteSpace 分析Fig.1 CiteSpace analysis of ARGs research literatures in agricultural environment based on CNKI and Web of Science

進(jìn)一步通過(guò)Bibliometrix[6]基于Louvain 算法得到近5 年農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 的研究主題演化〔見(jiàn)圖2(a)〕，由2017—2019 的7 個(gè)主題演變到2020—2022 年的10 個(gè)主題，表明該領(lǐng)域ARGs 的相關(guān)研究開(kāi)始趨于多元化和深入化. 其中，“Agriculture”和“Diversity”兩個(gè)主題分化為“Biological-control”“Identification” “Agriculture”“Diversity”等多個(gè)研究主題，推測(cè)與近年來(lái)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用生物多樣性和土壤修復(fù)達(dá)到提高產(chǎn)量的目的相關(guān). 然而，當(dāng)前環(huán)境中依然殘留著大量的抗生素，張煥軍等[7]發(fā)現(xiàn)湖泊和河流水體主要以溶解性較強(qiáng)的磺胺類和化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的四環(huán)素類為主，沉積物和土壤中則以性質(zhì)穩(wěn)定的喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素為主[8-9]. 更為重要的是，農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境中ARGs 的多樣性和耐藥性隨著時(shí)間推移仍在不斷發(fā)展，主題“Soil”和“Fate”逐步演化為“Diversity”“Resistome”和“Treatment plant”等. 通過(guò)Vosviwer[10]計(jì)算并繪制農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 研究主題的相關(guān)性熱圖〔見(jiàn)圖2(b)〕，結(jié)果表明，微生物群落、耐藥菌、重金屬、MGEs 和糞肥均與農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中ARGs 的研究緊密相關(guān)，加之“Soil”和“Bacteria”兩個(gè)主題分化出多個(gè)研究主題〔見(jiàn)圖2(a)〕，表明土壤中細(xì)菌是ARGs 的主要載體.農(nóng)業(yè)種植環(huán)境逐漸成為抗生素耐藥性發(fā)展的重要屬地，需要進(jìn)一步深入了解農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中ARGs 的來(lái)源、遷移、影響因素及管控措施等.

圖2 基于Bibliometrix 主題演化和Vosviwer 主題密度的農(nóng)業(yè)環(huán)境ARGs 的研究概況Fig.2 The general research overview of ARGs in agricultural environment based on Bibliometrix theme evolution and Vosviwer theme density

2 農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中ARGs 的污染來(lái)源及賦存特征

2.1 ARGs 的污染來(lái)源

ARGs 一般是由于細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性所致，主要分為內(nèi)源抗性、適應(yīng)性抗性和獲得性抗性.內(nèi)源抗性是指細(xì)菌本身的固有屬性，Chen 等[3]在人為干擾較少的土壤中檢測(cè)到完全不同于現(xiàn)代抗性組的β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類ARGs，劉燕等[11]在貢嘎山受人為干擾較小的極高海拔區(qū)(2948～3651 m)土壤中發(fā)現(xiàn)了132 種ARGs 和10 種MGEs. 然而，內(nèi)源性抗性產(chǎn)生的ARGs 豐度顯著低于受人為干擾較多的土壤環(huán)境，細(xì)菌的適應(yīng)性抗性和獲得性抗性是ARGs 在環(huán)境中持續(xù)富集的主要原因.

適應(yīng)性抗性是指環(huán)境背景值變化或抗生素亞抑制水平導(dǎo)致基因和或蛋白質(zhì)表達(dá)水平暫時(shí)改變，促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥性. 獲得性耐藥性是指在細(xì)菌的繁殖生長(zhǎng)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)環(huán)境中外源遺傳物質(zhì)行整合產(chǎn)生獲得性耐藥性. 據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013 年我國(guó)36 種化學(xué)類抗生素使用總量約162000 t[2]，其中四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和β-內(nèi)酰胺類抗生素使用范圍廣且用量大，分別占使用總量的5%、7%、17%、26%和21%，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥行業(yè). 基于Vosviwer 的主題密度分析表明ARGs 與抗生素和微生物群落密切相關(guān)〔見(jiàn)圖2(b)〕，因此，農(nóng)業(yè)環(huán)境中抗生素耐藥性的發(fā)展并不僅是微生物自身所分泌物質(zhì)導(dǎo)致，而是在農(nóng)業(yè)環(huán)境中抗生素增加的背景條件下，細(xì)菌更容易產(chǎn)生適應(yīng)性抗性和獲得性抗性，導(dǎo)致ARGs 持續(xù)累積并多元化發(fā)展.

農(nóng)業(yè)種植活動(dòng)中施肥、施藥、灌溉等生產(chǎn)方式[12]極大促進(jìn)了ARGs 的富集及耐藥微生物的發(fā)展[2,13]，農(nóng)業(yè)種植環(huán)境面臨著嚴(yán)峻的ARGs 挑戰(zhàn). 在我國(guó)主要農(nóng)業(yè)產(chǎn)區(qū)(見(jiàn)表1)，土壤種植環(huán)境中ARGs 平均豐度為2.49×1010～3.09×1010copies/g(絕對(duì)豐度)和5.7×10—3～2.39×10—1(相對(duì)豐度)[14-20]，遠(yuǎn)高于水環(huán)境中ARGs 的豐度[21]. 通過(guò)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析(見(jiàn)圖3)發(fā)現(xiàn)，農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中ARGs 與獸用抗生素密切相關(guān)，“Bacteria”和“Abundance”是ARGs、抗生素耐藥性和獸用抗生素間的重要樞紐.

表1 不同農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中的ARGs 豐度Table 1 Abundance of ARGs in different agricultural planting environment

圖3 農(nóng)業(yè)環(huán)境中ARGs 相關(guān)研究的關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Co-occurrence network of keywords in ARGs related research in agricultural environment

研究表明，40%～90%的抗生素不能被生物完全吸收[22-24]，僅2013 年被人類和動(dòng)物排泄的抗生素就高達(dá)54000 t[2]. 糞肥糞水或農(nóng)家肥等的施用導(dǎo)致大量生物殘?bào)w和代謝產(chǎn)物進(jìn)入種植環(huán)境，抗生素及其ARGs 會(huì)伴隨該過(guò)程同步進(jìn)入土壤，細(xì)菌隨即對(duì)其產(chǎn)生適應(yīng)性抗性和獲得性抗性，從而加速ARGs 的發(fā)展. 施用糞肥[25]和長(zhǎng)期堆放糞肥[26]土壤中的ARGs相對(duì)豐度分別為5.02×10—4～3.00×10—3和2.94×10—2～1.55×10—1，施用有機(jī)肥土壤中的噬菌體攜帶的ARGs總豐度顯著高于不施肥和施用化肥的土壤[27]，連續(xù)施用兩年糞水的土壤中ermF和ermB的污染指數(shù)顯著增加[28]. 石禮虎等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，施用抗生素菌渣(高/低施用量實(shí)驗(yàn)組) 能夠顯著提高ARGs 的檢出率和檢出豐度. 殺菌劑添加也會(huì)促進(jìn)土壤中ARGs 豐度的升高. 張厚樸等[30]利用三唑酮、百菌清、嘧菌酯和多菌靈四種殺菌劑處理設(shè)施土壤60 天后，ARGs 總豐度是未添加殺菌劑土壤的1.02～1.98 倍，是森林土壤的1.12～2.16 倍. 此外，人類生產(chǎn)生活廢水，尤其是畜禽養(yǎng)殖、醫(yī)藥行業(yè)廢水等通常會(huì)經(jīng)污水處理廠處理后排放到自然環(huán)境或再生利用，但現(xiàn)有污水處理設(shè)施對(duì)抗生素及ARGs 的去除效果極其有限. 農(nóng)業(yè)種植灌溉對(duì)水資源需求量很大，抗生素及其ARGs 會(huì)隨河湖水體、地下水、再生水灌溉等進(jìn)入農(nóng)田土壤，極大程度上促進(jìn)了農(nóng)業(yè)種植土壤環(huán)境中ARGs 的富集和發(fā)展(見(jiàn)圖4).

2.2 ARGs 的賦存特征

細(xì)菌受到抗生素脅迫時(shí)，會(huì)啟動(dòng)主動(dòng)防御機(jī)制增強(qiáng)抗生素耐藥性[31]，增加細(xì)胞分泌物和代謝水平，表達(dá)更多的外排泵基因，促進(jìn)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等可移動(dòng)遺傳元件(Mobile Genetic Elements，MGEs)的產(chǎn)生和釋放[32]. ARGs 在環(huán)境中可分為胞內(nèi)ARGs(Intracellular ARGs，iARGs)和胞外ARGs(Extracellular ARGs，eARGs). 研究表明，約有60%和40%的ARGs分別存在于DNA[25]和MGEs 中[33-34]，Zou 等[25]研究發(fā)現(xiàn)MGEs 和iARGs 的相對(duì)豐度存在強(qiáng)相關(guān)性. 由此推知，iARGs 容易被細(xì)菌體內(nèi)的遺傳物質(zhì)(Intracellular DNA，iDNA)和MGEs 吸收和轉(zhuǎn)導(dǎo)，而eARGs 則容易隨著細(xì)菌在構(gòu)建生物膜的過(guò)程中排出體外，進(jìn)而被環(huán)境中游離的DNA(Extracellular DNA，eDNA)和MGEs捕獲[35].

農(nóng)業(yè)種植土壤中的微生物能夠通過(guò)分泌核酸、多糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸等胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS) 以適應(yīng)環(huán)境中的抗生素、除草劑和重金屬等帶來(lái)的壓力[36]. EPS 中富含大量的DNase 酶，能夠水解ARGs[31]和eDNA[37]，因此在理論上土壤中EPS 對(duì)于ARGs 的發(fā)展是阻礙的. 然而，在人為影響較大的土壤中，抗生素、重金屬等污染物大量存在，這些污染物能夠被EPS 吸收并與DNase 酶的特征位點(diǎn)結(jié)合[37]，導(dǎo)致DNase 酶的活性降低，從而使得ARGs 免受DNase 酶的降解并長(zhǎng)期存在. Fan 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化過(guò)程中產(chǎn)生的EPS 中的蛋白會(huì)分別在GLU-307、hs-191、ASP-318和tr-32 等多個(gè)位點(diǎn)與紅霉素和磺胺甲惡唑結(jié)合，在EPS 對(duì)抗生素的長(zhǎng)期馴化過(guò)程中致使ARGs 產(chǎn)生和累積.

此外，EPS 能夠吸收環(huán)境中的eDNA、eARGs 和MGEs，且土壤環(huán)境中的EPS 比水環(huán)境中更穩(wěn)定.Pathan 等[39]研究發(fā)現(xiàn)土壤中eDNA 含量是水體中的3～4 倍，Wang 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，EPS 內(nèi)部ARGs 絕對(duì)豐度比相應(yīng)的游離ARGs 高0.2～4.6 個(gè)數(shù)量級(jí)，且DNA轉(zhuǎn)化體含量證明與EPS 相關(guān)的ARGs 轉(zhuǎn)化效率比游離ARGs 高3.3～236.3 倍. 由此表明，農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中EPS 和eDNA 能夠充當(dāng)ARGs 增殖的潛在遺傳物質(zhì)來(lái)源和載體[33]，導(dǎo)致ARGs 在農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中廣泛分布并持續(xù)累積[41].

3 農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中ARGs 的遷移及風(fēng)險(xiǎn)

與常規(guī)的化學(xué)污染物不同，ARGs 是具有遺傳信息的DNA 片段，位于染色體上的ARGs 能通過(guò)染色體的自我復(fù)制遺傳在細(xì)菌親代之間垂直傳播，發(fā)生垂直基因轉(zhuǎn)移(vertical gene transfer, VGT). 更多研究表明，ARGs 的潛在生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)普遍是由跨物種的基因水平遷移(horizontal gene transfer，HGT) 造成的.ARGs 相關(guān)的基因盒、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等MGEs廣泛存在于細(xì)菌中，基因盒和整合子捕獲ARGs，質(zhì)粒進(jìn)行接合和轉(zhuǎn)移ARGs，轉(zhuǎn)座子和插入序列轉(zhuǎn)移ARGs，不同生物間可以利用這些MGEs 作載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化(細(xì)菌-環(huán)境介質(zhì)-吸收遺傳物質(zhì))、接合(細(xì)菌-菌毛介質(zhì)-傳遞遺傳物質(zhì))、轉(zhuǎn)導(dǎo)(細(xì)菌-噬菌體-傳遞遺傳物質(zhì))等方式使ARGs 在細(xì)菌間相互傳播，最終導(dǎo)致抗生素耐藥性通過(guò)基因水平遷移的方式廣泛傳播.所以，ARGs 在細(xì)菌群落間的基因水平遷移和垂直基因轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致ARGs 造成環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)的兩個(gè)重要驅(qū)動(dòng)力.

研究表明，iARGs 和eARGs 的HGT 過(guò)程并不相同. Zou 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，iARGs 與質(zhì)粒上的整合子(R=0.981，P＜0.001)與轉(zhuǎn)座子(R=0.908，P＜0.001)的相關(guān)性遠(yuǎn)高于eARGs 與質(zhì)粒上的整合子(R=0.591，P＜0.05)與轉(zhuǎn)座子(R=0.779，P＜0.05) 的相關(guān)性，表明iARGs 主要通過(guò)細(xì)菌間iDNA 的接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)及MGEs發(fā)生水平遷移，而eARGs 則主要通過(guò)eDNA 的自然轉(zhuǎn)化[34]和MGEs 進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移[35]，進(jìn)而證明ARGs的HGT 主要依賴于DNA 的遺傳特性和MGEs 的跨物種遷移能力. 然而，并非所有的DNA 都能成功插入細(xì)菌的基因中，這主要取決于外源DNA 鏈和染色體DNA 之間是否存在同源區(qū)域. 例如，將DNA 整合到革蘭氏陰性桿菌基因組的過(guò)程中，相較于其他DNA，同源DNA 更容易被轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化率高達(dá)109倍[42]. 研究表明，eDNA 的長(zhǎng)度為20～200 bp，更容易插入細(xì)菌中進(jìn)一步表達(dá)[35]，當(dāng)eDNA 與受體基因組同源的DNA 相連時(shí)，整合轉(zhuǎn)化的概率能夠增加105倍[42]. Ye 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，eDNA 的自然轉(zhuǎn)化不需要特定的蛋白質(zhì)，能夠通過(guò)維持銅綠假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)[43]誘導(dǎo)細(xì)菌富集氨基糖苷類ARGs[44]，影響攜帶ARGs 的質(zhì)粒在不同細(xì)菌間的自然轉(zhuǎn)化頻率[45]，從而加速M(fèi)GEs 和ARGs 被其他細(xì)菌轉(zhuǎn)化的進(jìn)程. 此外，土壤中穩(wěn)定的EPS 不僅可以長(zhǎng)時(shí)間保持微生物間的物質(zhì)交換相對(duì)靜止，還能通過(guò)自身組分連接兩個(gè)細(xì)胞的菌毛，從而更加有利于細(xì)菌之間的單向質(zhì)粒交換和基因交換過(guò)程[40]. 這些結(jié)果意味著土壤環(huán)境中EPS的穩(wěn)定存在、eDNA 的自然轉(zhuǎn)化和MGEs 的遷移可能是農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中ARGs 進(jìn)行HGT 的主要方式之一.

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)導(dǎo)致抗生素及ARGs 通過(guò)糞肥、糞水、灌溉污水等多種方式進(jìn)入農(nóng)田土壤環(huán)境，人類可以通過(guò)多種途徑接觸農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中的ARGs 并在體內(nèi)蓄積，細(xì)菌群落及基因的水平和垂直轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致ARGs 造成環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)的兩個(gè)重要驅(qū)動(dòng)力. 抗生素及ARGs 進(jìn)入土壤會(huì)直接影響土壤微生物和酶活性，導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生和增殖，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡. 一旦土著微生物獲得ARGs，因其具有良好的環(huán)境適應(yīng)性，會(huì)以超過(guò)親代菌株的效率擴(kuò)散，給土壤種植環(huán)境的生態(tài)安全帶來(lái)更大威脅. 隨著施肥施藥時(shí)間不斷延長(zhǎng)，ARGs 不斷累積并在土壤不同層級(jí)遷移[26]. 農(nóng)田土壤中的抗生素及ARGs 能夠通過(guò)淋溶[46]、滲透等方式進(jìn)入到地下水環(huán)境[47]，并通過(guò)地表或地下徑流等方式進(jìn)入河流、湖泊等水環(huán)境中，導(dǎo)致ARGs 在不同環(huán)境中交叉污染，從而促進(jìn)多重耐藥基因的產(chǎn)生(見(jiàn)圖4)，造成更為嚴(yán)重的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).

植物的莖葉、果實(shí)等可食用部分是抗生素耐藥性從農(nóng)業(yè)種植環(huán)境向人類傳播擴(kuò)散的主要途徑[16]，植物根際土壤中的ARGs 可以向植物體內(nèi)組織遷移[48].研究表明，施用有機(jī)肥導(dǎo)致生菜葉際ARGs 豐度是傳統(tǒng)生菜中的8 倍[49]，長(zhǎng)期施用雞糞會(huì)顯著增加玉米葉表ARGs 豐度，ARGs 種類多達(dá)124 種[1]，超市購(gòu)買的蔬菜(沙拉、芝麻菜、香菜等)中同樣檢出了攜帶四環(huán)素類ARGs 的可進(jìn)行自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒[50]. 由此表明，土壤中的ARGs 能夠通過(guò)農(nóng)作物從農(nóng)業(yè)種植環(huán)境向人類傳播擴(kuò)散[49]，對(duì)人類健康造成較大風(fēng)險(xiǎn).

4 農(nóng)業(yè)種植土壤中ARGs 的影響因素

4.1 不同農(nóng)用地利用模式及土壤性質(zhì)對(duì)ARGs 的影響

農(nóng)作物種植模式和種植作物類型均會(huì)影響ARGs的賦存狀況[19]. 例如，在設(shè)施菜地、大田和糧田等不同的農(nóng)地利用方式下，設(shè)施菜地ARGs 豐度顯著高于大田及糧田. 王佳佳等[51-52]研究發(fā)現(xiàn)，溫室土壤中tet類抗性基因和intI-1基因的豐度及菜地中ARGs 豐度均顯著高于大田土壤(P＜0.05)，推測(cè)與有機(jī)肥施用量高、環(huán)境密閉、環(huán)境溫度高等因素相關(guān)，最終導(dǎo)致ARGs 在不同種植模式下的累積差異. 此外，黃福義等[19]研究不同種植作物時(shí)發(fā)現(xiàn)，同樣施肥方式下種植不同作物會(huì)導(dǎo)致ARGs 豐度呈現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，其中香蕉種植土壤環(huán)境中ARGs 的絕對(duì)豐度(1.41×1010copies/g)最高，其次為花生(1.28×1010copies/g)、水稻(1.10×1010copies/g)、甘蔗(7.96×109copies/g) 和柑橘(6.47×109copies/g)，推測(cè)由于不同作物通過(guò)根系生長(zhǎng)和滲出過(guò)程改變土壤理化性質(zhì)，并富集不同類型細(xì)菌群落，從而直接或間接改變ARGs 的賦存和演變特征[53-54]. 此外，秸稈還田同樣與ARGs 的發(fā)展存在一定關(guān)系. Zhang 等[55]研究了秸稈還田對(duì)稻田土壤中磺胺類抗生素(SMX)及其ARGs 的影響，結(jié)果表明，對(duì)于抗生素，秸稈還田可以通過(guò)共代謝作用加速SMX的降解；對(duì)于ARGs，秸稈還田作用10 天時(shí)，intI-1和sul1基因豐度顯著高于空白對(duì)照組，但當(dāng)作用60 天后，intI-1和sul1基因豐度則顯著低于空白對(duì)照組，其中溶解性有機(jī)碳及變形菌門和放線菌門細(xì)菌在ARGs 消除中發(fā)揮了積極作用.

土壤自身性質(zhì)對(duì)ARGs 有重要影響，如土壤類型、土壤pH、水分等. Wang 等[56]研究發(fā)現(xiàn)，潮土和鹽堿土ARGs 的多樣性和相對(duì)豐度比褐土更高，且潮土中ARGs 的相對(duì)豐度與MGEs 的相對(duì)豐度具有很強(qiáng)的相關(guān)性. 土壤pH 的升高會(huì)增加抗生素在土壤中的移動(dòng)性，從而增加抗生素耐藥遷移風(fēng)險(xiǎn). 土壤水分則能影響土壤間隙度、吸附系數(shù)和離子電位等. 有機(jī)質(zhì)分解的中間產(chǎn)物[41](如鏈球霉素和青霉素)則會(huì)對(duì)微生物群落和ARGs 的賦存產(chǎn)生影響，如碳、氮、磷作為生物合成DNA 及生長(zhǎng)代謝的基本營(yíng)養(yǎng)元素，其含量與土壤中的ARGs 密切相關(guān). Qian 等[57]研究表明，土壤中的氮會(huì)導(dǎo)致部分酶的功能富集和ARGs 的轉(zhuǎn)移；Sun 等[58]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)施加植物和微生物所需的氮會(huì)增加土壤和蔬菜中blaTEM、cmlA、sul1和tnpA-4的豐度，表明氮形態(tài)的改變及其含量的增加能夠促進(jìn)ARGs 的富集和轉(zhuǎn)移[57-60]. Meta 分析證實(shí)，ARGs豐度與土壤碳和磷濃度呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)[61]，且ARGs 豐度與有效磷濃度的相關(guān)性強(qiáng)于ARGs 豐度與總磷濃度的相關(guān)性. 另一項(xiàng)研究[62]指出，當(dāng)土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素含量發(fā)生變化時(shí)，會(huì)產(chǎn)生暫時(shí)性的營(yíng)養(yǎng)饑餓效應(yīng)，細(xì)菌通過(guò)養(yǎng)分的饑餓來(lái)感受環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)的豐富度，從而調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)，但饑餓反應(yīng)受到干擾會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌DNA 損傷誘導(dǎo)反應(yīng)(SOS 反應(yīng))發(fā)生，促進(jìn)細(xì)菌耐藥性和ARGs 產(chǎn)生(見(jiàn)圖4). 例如，當(dāng)細(xì)菌受到氨基酸饑餓信號(hào)刺激時(shí)會(huì)誘導(dǎo)relA 和spoT 基因的表達(dá)，增加了鳥(niǎo)苷四磷酸分子(ppGpp)的含量，從而抑制肽聚糖、DNA 等相關(guān)物質(zhì)合成[63]. 有研究[64]指出，在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，ppGpp 通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯水平和細(xì)胞周期，改變細(xì)胞的新陳代謝和生理狀態(tài)，有利于增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性. Rodionov 等[65]研究發(fā)現(xiàn)，ppGpp 的積累可以使得大腸桿菌對(duì)青霉素的敏感性降低. 因此，農(nóng)業(yè)種植土壤環(huán)境中，不合理施肥及養(yǎng)分變化均會(huì)對(duì)細(xì)菌造成選擇壓力[66]，增加細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性或脅迫效應(yīng)，促進(jìn)ARGs 的產(chǎn)生、累積和擴(kuò)散.

4.2 抗生素及其他污染物對(duì)ARGs 的影響

抗生素可以通過(guò)有機(jī)肥、糞肥和糞水施用等方式進(jìn)入土壤環(huán)境，隨即發(fā)生吸附、解析、轉(zhuǎn)化、固定等環(huán)境過(guò)程，從而長(zhǎng)期存在于土壤中. 當(dāng)土壤中抗生素殘留達(dá)到了細(xì)菌的亞抑制水平，會(huì)產(chǎn)生兩種反應(yīng)：①它能夠激活細(xì)菌的雙組分信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)[62](twocomponent regulatory systems，TCSs)和抗毒素系統(tǒng)[67](toxin-antitoxin system，TAs)，提高抗生素耐藥性. TCSs通過(guò)磷酸化介導(dǎo)調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，作用于細(xì)菌細(xì)胞膜的表面修飾、通透性改變和生物膜形成[62]；而TAs能夠通過(guò)抑制多聚磷酸酶(PPX)增強(qiáng)鳥(niǎo)苷酸分子累積和偶聯(lián)，誘導(dǎo)細(xì)菌生長(zhǎng)停滯促進(jìn)耐藥性形成[64].②抗生素殘留會(huì)直接抑制細(xì)菌的DNA 復(fù)制和修復(fù)、蛋白質(zhì)及生物膜的合成，從而引發(fā)細(xì)菌SOS 反應(yīng)，如喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和氯霉素類抗生素都可以誘導(dǎo)大腸桿菌和霍亂弧菌中細(xì)胞內(nèi)的SOS 反應(yīng)[68]. 正常情況下，SOS 反應(yīng)由recA和lexA基因調(diào)節(jié)，lexA基因表達(dá)的LexA 蛋白會(huì)以二聚體形式阻礙RNA 聚合酶與DNA 啟動(dòng)子結(jié)合，抑制SOS 相關(guān)基因的表達(dá)，使得基因隨機(jī)突變率降低，每條染色體每代突變率僅為10—8～10—6[69]. 但是環(huán)境或菌群的不穩(wěn)定可能引發(fā)細(xì)菌的DNA 損傷，進(jìn)而產(chǎn)生更多單鏈DNA(ssDNA)；recA基因表達(dá)的RecA 蛋白會(huì)在ATP存在下與ssDNA 結(jié)合形成復(fù)合物[70]，并作為信號(hào)分子作用于LexA 蛋白，使之發(fā)生自催化水解，降低對(duì)DNA 修復(fù)、突變以及細(xì)胞分裂等相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制作用. 細(xì)菌便會(huì)發(fā)生易出錯(cuò)的DNA 跨損傷合成，導(dǎo)致細(xì)菌基因的突變頻率提高10～10000 倍，并誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性表型的相關(guān)基因[71-72]. 例如，Escherichia coli的DNA 修復(fù)機(jī)制中sulA基因暴露于抗生素等殺菌性物質(zhì)時(shí)，阻礙DNA 損傷修復(fù)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生ARGs[73].

另有研究[37]顯示，在有機(jī)污染物和重金屬等污染物共存的條件下，亞抑制濃度的抗生素更容易誘導(dǎo)細(xì)菌的SOS 反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，從而促進(jìn)多重耐藥ARGs 富集. 有機(jī)污染物和重金屬對(duì)ARGs 的促進(jìn)作用主要表現(xiàn)在以下幾方面：①有機(jī)污染物和金屬離子都能促進(jìn)細(xì)菌的MGEs 產(chǎn)生. 例如，細(xì)菌對(duì)微塑料的降解中MGEs 會(huì)伴隨著大量有機(jī)物降解基因表達(dá)而增加[74]；重金屬使得細(xì)菌胞內(nèi)胞外滲透壓增加，MGEs 會(huì)伴隨著外排泵系統(tǒng)大量表達(dá)而增加[75]. ②有機(jī)污染物(如十二烷基磺酸鈉[37]和取代芳香烴[31])和重金屬離子(Cu、Ag、Cr 和Zn)[75]都能夠與生物膜中的一些物質(zhì)結(jié)合改變細(xì)菌生物膜的通透性，在細(xì)菌體內(nèi)誘導(dǎo)協(xié)同抗性[66]. ③部分有機(jī)污染物能夠促進(jìn)ARGs 在細(xì)菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化. 例如，0.5 μmol/L 的取代芳香族化合物會(huì)促使ARGs 到大腸桿菌COLIK-12 的轉(zhuǎn)化效率增加1.57～2.29 倍[31]. 此外，環(huán)境中重金屬和有機(jī)污染物還會(huì)降低EPS 的滲透性和DNase 酶的活性[76]，阻礙DNase 酶對(duì)ARGs 降解，促進(jìn)ARGs 跨越EPS 滲透性屏障進(jìn)入土壤中[77]，從而促進(jìn)ARGs 的富集和遷移. 因此，伴隨著施肥、用藥、灌溉等進(jìn)入到農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中的多種污染物均會(huì)促進(jìn)ARGs 的富集和遷移.

4.3 農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中鹽漬化對(duì)ARGs 的影響

農(nóng)業(yè)種植過(guò)程中，人們時(shí)常會(huì)忽略不同作物生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分條件及土壤環(huán)境背景現(xiàn)狀，盲目施肥施藥以達(dá)到作物高產(chǎn)的目的，使得農(nóng)田土壤中積累了大量無(wú)機(jī)和有機(jī)污染物等，加劇了土壤鹽漬化，限制了養(yǎng)分利用，從而可能加劇ARGs 污染及水平遷移的風(fēng)險(xiǎn). Xu 等[76]研究表明，在含Al 的高鹽土壤和含Ne的中性鹽土中ARGs 和MGEs 的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度均顯著增加，且鹽脅迫條件下利于刺激細(xì)菌合成蛋白質(zhì)，增加EPS 的分泌，促進(jìn)ARGs 在土壤環(huán)境中的持久性[78]. 例如，泛生菌(Pantoeasp.)、芽孢桿菌(Bacillussp.)、放線菌(Actinomycetessp.)、根瘤菌(Rhizobiumsp.)、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)和假單胞菌(Pseudomonassp.) 等均會(huì)在鹽脅迫下增加EPS 的分泌[79]. 鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌分泌的EPS 中的多糖含量增加，不僅會(huì)促進(jìn)EPS 對(duì)ARGs 和MGEs 的吸附能力[80]，還會(huì)抑制細(xì)菌對(duì)ARGs 的降解.

雖然研究表明EPS 中的DNase 酶能夠與ARGs[31]和eDNA[37]相互作用將其水解破壞，但農(nóng)業(yè)種植土壤中由于過(guò)量施肥施藥帶來(lái)的有機(jī)污染物和金屬離子會(huì)與EPS 相互纏繞，導(dǎo)致DNase 酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)發(fā)生改變[37]，最終導(dǎo)致DNase 酶對(duì)ARGs 的降解受阻. 例如，EPS 中攜帶的eDNA 能夠與無(wú)機(jī)陽(yáng)離子和磷酸鹽形成緊密的結(jié)合鍵能[33]，十二烷基磺酸鈉[37]、取代芳香烴[31]和抗生素[38]等物質(zhì)均能與EPS、eDNA 和質(zhì)粒結(jié)合.

另有研究指出，鹽漬化會(huì)抑制尿素水解和硝化過(guò)程，限制土壤生物和微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的利用效率，導(dǎo)致土壤中游離氨積累[81]. 土壤中游離氨能夠進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，與磷脂雙分子層中的脂肪酸殘基發(fā)生反應(yīng)形成氨酸鹽，促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞膜上的脂質(zhì)雙層蛋白質(zhì)通道更易于開(kāi)放[82-83]，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換增加，這一過(guò)程可能促進(jìn)細(xì)菌釋放iARGs 和MGEs 或從環(huán)境中吸收eARGs 和MGEs，從而加速農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中的ARGs 的水平遷移過(guò)程.綜上所述，農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中的土壤鹽漬化問(wèn)題可能促進(jìn)著ARGs 在農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中水平遷移和環(huán)境持久性[43]，進(jìn)一步加劇了ARGs 的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).

5 ARGs 的削減與管控

目前，ARGs 管控策略主要集中在減少和限制抗生素的使用. 例如，臨床上積極推廣和應(yīng)用疫苗，在劑量和療程上優(yōu)化抗生素的使用，畜禽養(yǎng)殖中通過(guò)強(qiáng)化養(yǎng)殖管理、優(yōu)化飼料配方及疫苗接種減少抗生素的使用. 由于抗生素類藥物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且溶解性強(qiáng)，導(dǎo)致其在環(huán)境中持久性及遷移性強(qiáng). 對(duì)于早已面臨較高水平ARGs 污染且長(zhǎng)期種植的土壤，源頭管控措施已難以滿足ARGs 的削減需求. 畜禽養(yǎng)殖中，大量抗生素會(huì)隨畜禽糞便進(jìn)入環(huán)境，堆肥及高溫發(fā)酵可以有效減少糞便中的抗生素，Yue 等[54]研究發(fā)現(xiàn)，高溫堆肥主要通過(guò)降解抗生素促進(jìn)ARGs 的削減. ARGs 的控制與抗生素有所不同，李厚禹等[84]研究發(fā)現(xiàn)，雖然好氧-厭氧兩相堆肥能有效去除ARGs，但strB、ermB、sul1和sul2等ARGs 和潛在耐藥致病菌仍存在增殖現(xiàn)象. 姜欣然等[85]發(fā)現(xiàn)，在高溫堆肥過(guò)程中aadA、sul2、mcr-1和oqxB的消減率分別為89.39%、97.99%、99.89%和99.81%，intI-1基因的消減率高于80%，但大多數(shù)ARGs 的相對(duì)豐度表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì). 另有研究[48,86]指出，豬糞生物脫氮堆肥處理后，產(chǎn)物中部分抗生素、ARGs 及人畜共患病病原菌的濃度/豐度均會(huì)有所降低. 綜上，雖然堆肥工藝能夠減少部分ARGs 的豐度，但并不能將ARGs 降低到零風(fēng)險(xiǎn)水平，甚至導(dǎo)致部分ARGs 在堆肥區(qū)發(fā)生多樣性變化并長(zhǎng)期存在[26].

另有研究利用外源添加生物炭降低土壤中ARGs的污染水平. Wan 等[87]研究發(fā)現(xiàn)，ARGs 豐度與有機(jī)碳含量間呈顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步研究表明生物碳能夠吸附并促進(jìn)土壤中抗生素的降解，從而減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生機(jī)率和遷移效率. 段曼莉等[88]研究表明，蘋果樹(shù)枝制備的生物炭可以增加土壤對(duì)土霉素的吸附能力，降低土壤、生菜葉和根系中土霉素和ARGs 的累積和遷移[49]. 需要注意的是，生物碳并不能有效控制所有的ARGs，Shi 等[89]發(fā)現(xiàn)生物炭雖然能夠降低土壤中tetW、sul2和ermB的豐度，但它顯著增加了tetX和intI-1的豐度. Zhang 等[55]發(fā)現(xiàn)秸稈還田可以通過(guò)增加土壤有機(jī)碳促進(jìn)微生物群落的共代謝作用加速磺胺類抗生素的降解，但第90 天土壤中sul1、intI-1和sul3的豐度為第10 天的1～1.5 倍. 此外，噬菌體療法也是控制抗生素耐藥性的新方法，生物炭-噬菌體協(xié)同作用可以提高土壤和生菜內(nèi)生細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)多樣性和功能穩(wěn)定性，阻控ARGs 或耐藥菌的遷移，促進(jìn)微生物對(duì)有機(jī)污染物的生物強(qiáng)化降解[90].

綜上，目前農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中控制ARGs 的方法主要包括兩個(gè)方面：一是通過(guò)堆肥發(fā)酵等高溫?zé)峤夥绞綔p少抗生素和耐藥菌，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ARGs 的初步削減；二是通過(guò)活性炭等外源物質(zhì)添加降低污染物有效性，增強(qiáng)土壤微生物穩(wěn)定性，以此達(dá)到對(duì)土壤中ARGs 的進(jìn)一步控制[91-92]，但兩種方式均不能實(shí)現(xiàn)所有ARGs的有效去除，且去除效果并不顯著，甚至造成部分ARGs 的累積. 因此，對(duì)于控制農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中的ARGs 管控可以從以下幾方面著手：一是優(yōu)化有機(jī)肥的生產(chǎn)工藝，控制其中的抗生素及ARGs 殘留；二是優(yōu)化養(yǎng)分和肥料配方，減少重金屬及其他污染物進(jìn)入土壤環(huán)境；三是針對(duì)ARGs 特性，開(kāi)發(fā)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行高效吸附和降解的新材料.

6 結(jié)論與展望

6.1 結(jié)論

a) 2017—2022 年的文獻(xiàn)計(jì)量結(jié)果表明，農(nóng)業(yè)種植環(huán)境已發(fā)展成為抗生素耐藥性發(fā)展的新興歸屬地，面臨較為嚴(yán)重的ARGs 污染問(wèn)題，但相關(guān)研究卻相對(duì)較少且不聚焦.

b) 施肥、施藥、灌溉等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式極大促進(jìn)了抗生素耐藥性的發(fā)展，細(xì)菌的適應(yīng)性和獲得性抗性是ARGs 在環(huán)境中持續(xù)富集的主要原因，ARGs 的遷移主要?dú)w因于MGEs 的水平轉(zhuǎn)移、細(xì)菌間iDNA 的轉(zhuǎn)導(dǎo)、eDNA 的自然轉(zhuǎn)化和EPS 的物質(zhì)交換等過(guò)程，導(dǎo)致ARGs 在農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中廣泛分布.

c) 不同農(nóng)地利用模式下，土壤理化性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)元素、抗生素及重金屬等均會(huì)影響ARGs 的賦存特征，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)引發(fā)的土壤鹽漬化和污染物富集問(wèn)題會(huì)增加細(xì)菌對(duì)抗生素的脅迫效應(yīng)和敏感性，加速ARGs 在環(huán)境中的累積和遷移.

d) 農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中的ARGs 可以通過(guò)食物鏈等多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)并不斷蓄積，細(xì)菌群落及基因的水平和垂直轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致ARGs 風(fēng)險(xiǎn)累積的重要驅(qū)動(dòng)力，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重威脅.

e) 堆肥發(fā)酵和外源有機(jī)碳添加是控制農(nóng)業(yè)種植環(huán)境中抗生素耐藥性的主要方式，但其作用效果有限，仍需進(jìn)一步研究新技術(shù)新方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)種植環(huán)境中早已大量累積的ARGs 的有效控制.

6.2 展望

農(nóng)田土壤是農(nóng)業(yè)環(huán)境中抗生素耐藥性傳播和擴(kuò)散的重要載體，存在較高的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和人體健康風(fēng)險(xiǎn)，必須采取有效措施降低ARGs 和耐藥菌污染風(fēng)險(xiǎn). 要實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)，建議從以下方面著手：

a) 重視抗生素的源頭削減和控制，加強(qiáng)生產(chǎn)管理及對(duì)生產(chǎn)廢水和廢棄物的管理.

b) 深入探討不同種植環(huán)境中MGEs、iARGs 和eARGs 的賦存特征，并探究其組成成分對(duì)ARGs 積累和遷移風(fēng)險(xiǎn)的影響機(jī)制.

c) 利用科學(xué)方法進(jìn)一步優(yōu)化養(yǎng)分及肥料配比，削弱污染物和養(yǎng)分變化對(duì)微生物的脅迫效應(yīng)，降低微生物適應(yīng)過(guò)程中ARGs 產(chǎn)生和累積的概率.

d) 進(jìn)一步開(kāi)展農(nóng)業(yè)環(huán)境中的ARGs 的演變特征研究，構(gòu)建其在環(huán)境介質(zhì)中轉(zhuǎn)移的數(shù)學(xué)模型，進(jìn)一步制定并完善ARGs 從土壤環(huán)境到人類病原體細(xì)菌傳播的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估準(zhǔn)則.