胃癌組織中l(wèi)ncRNA CHRF、miR-489的表達(dá)變化及意義

鄧小婧，辜正策，李璐池，劉欣，楊炎鑫

眉山市中醫(yī)醫(yī)院病理科，四川眉山 620032

胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均位于惡性腫瘤前列［1］。目前胃癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、放化療及靶向治療等，早期胃癌患者經(jīng)治療后預(yù)后良好，但由于胃癌常隱匿發(fā)病，早期臨床癥狀及體征不具備特異性，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，治療后預(yù)后較差［2-3］。研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)于胃癌的診斷及治療具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（lncRNA）是一種非蛋白編碼核糖核酸（RNA），已有多種lncRNA 被證實(shí)與胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)［4-5］，但關(guān)于lncRNA CHRF 與胃癌關(guān)系的研究較少。微小RNA（miRNA）存在于大多數(shù)生物中，其通過(guò)調(diào)控靶基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。miR-489 是miRNA 家族成員之一，已被證實(shí)與乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)［6-8］。研究表明，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體miR-489可通過(guò)靶向抑制Twist1表達(dá)，參與胃癌的病理變化過(guò)程［9］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在一定因素的作用下由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過(guò)程，與胃癌的發(fā)生及病理進(jìn)展相關(guān)［10］。本研究觀察了胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489 的表達(dá)變化，并探討其與患者病情嚴(yán)重程度、EMT 及預(yù)后的關(guān)系，為胃癌的臨床診治及預(yù)后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合胃癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②入組前未接受任何抗腫瘤治療；③符合根治性手術(shù)適應(yīng)證［12］；④臨床病理資料完整；⑤無(wú)精神性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全；②合并其他惡性腫瘤；③合并嚴(yán)重感染、免疫系統(tǒng)疾??；④合并脾功能亢進(jìn)、高尿酸血癥。選擇2018 年1 月—2020 年1月在眉山市中醫(yī)醫(yī)院進(jìn)行根治手術(shù)治療的胃癌患者63 例，男41 例、女22 例，年齡（51.48 ± 8.84）歲。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫審2017 第0631號(hào)），患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 胃癌及癌旁組織lncRNA CHRF、miR-489 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。術(shù)中收集患者的胃癌組織和癌旁組織樣本，癌旁組織樣本采集區(qū)域需距腫瘤組織邊緣≥5 cm；組織樣本采集后分成兩份，一份即刻置于液氮中快速冷凍，-80 ℃保存；另一份經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋后4 μm 厚度連續(xù)切片。取冷凍后的胃癌及癌旁組織，TRIzol 試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。采用2720 型熱循環(huán)PCR 系統(tǒng)和SYBR Green Mix 試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA CHRF、miR-489相對(duì)表達(dá)量。

1.3 胃癌及癌旁組織EMT 相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。取胃癌及癌旁組織切片，進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化處理，置于0.01 mol/L、95 ℃的枸櫞酸緩沖液中浸泡并進(jìn)行熱修復(fù)。加入RIPA buffer裂解液充分裂解后提取總蛋白，采用BCA 法定量蛋白，取20 μg 總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。加入5%脫脂奶粉封閉60 min，依次加入鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentine）、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子（Snail）一抗及二抗，溫室孵育。以GAPDH 為內(nèi)參，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光后采用Image-Pro Plus 軟件分析目的條帶灰度值，計(jì)算E-cadherin、Vimentine、Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 預(yù)后評(píng)價(jià) 患者出院后定期門(mén)診復(fù)查和電話隨訪，隨訪時(shí)間截至2023年1月，隨訪終止事件為患者死亡或隨訪到期，記錄患者的3年生存率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W 正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以表示，結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，結(jié)果比較采用秩和檢驗(yàn)。胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489與E-cadherin、Vimentine、Snail的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析法。根據(jù)lncRNA CHRF、miR-489 的平均值將患者分為lncRNA CHRF 高表達(dá)和低表達(dá)者、miR-489 高表達(dá)和低表達(dá)者，繪制其Kaplan-Meier 生存曲線，并比較其3 年生存率。以胃癌患者的預(yù)后（賦值：1 = 死亡，0 = 生存，t = 生存期）為因變量，以患者臨床特征為自變量，進(jìn)行單因素及多因素COX回歸模型分析；因本研究的樣本量較少會(huì)影響多因素分析，特采取以下兩種措施：一是對(duì)所有自變量指標(biāo)進(jìn)行降維處理（連續(xù)變量均按總均值轉(zhuǎn)化成兩分類變量），二是采用逐步前進(jìn)法（α留=0.05，α剔=0.10），把可能被剔除的指標(biāo)因素（P值偏大的、HR值接近1的）先加入至回歸模型，使其先被剔除而不影響后續(xù)回歸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織lncRNA CHRF、miR-489及E-cadherin、Vimentine、Snail 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織與癌旁組織lncRNA CHRF、miR-489及EMT相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表1 胃癌組織與癌旁組織lncRNA CHRF、miR-489及EMT相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與癌旁組織比較，*P＜0.05。

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2.2 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489表達(dá)比較（）

表2 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489表達(dá)比較（）

注：不同臨床特征之間比較，*P＜0.05。

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2.3 胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489與E-cadherin、Vimentine、Snail 表達(dá)的關(guān)系 胃癌組織lncRNA CHRF與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r= -0.539），與Vimentine、Snail 表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.497、0.522），P均＜0.05。胃癌組織miR-489 與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r= 0.512），與Vimentine、Snail 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r分別為-0.506、-0.508，P均＜0.05）。

2.4 胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489 高低表達(dá)者的預(yù)后比較 63 例患者均獲得隨訪，無(wú)失訪病例，隨訪3 年共生存46 例，3 年生存率為73.02%。胃癌組織lncRNA CHRF 高表達(dá)者3 年生存率為55.56%（15/27），低表達(dá)者為86.11%（31/36），兩者比較P＜0.05；胃癌組織miR-489 高表達(dá)者3 年生存率為93.33%（28/30），低表達(dá)者為54.55%（18/33），兩者比較P＜0.05。見(jiàn)OSID碼圖1、2。

2.5 胃癌組織lncRNA CHRF、miR-489 表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 影響胃癌患者預(yù)后的單因素COX 分析結(jié)果見(jiàn)表3，多因素COX分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 影響胃癌患者預(yù)后的單因素COX分析結(jié)果

表4 影響胃癌患者預(yù)后的多因素COX分析結(jié)果

3 討論

胃癌的發(fā)生與發(fā)展是多因素、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，對(duì)患者的身體健康及生命安全具有巨大威脅。目前，手術(shù)是胃癌的主要手治療段，但一些中晚期胃癌患者存在術(shù)后復(fù)發(fā)率高、生存率低的問(wèn)題。lncRNA作為一種非蛋白編碼RNA，其異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有特殊的調(diào)控機(jī)制，多種lncRNA（如HOTAIR、ANRIL、GAPLINC 等）參與了胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為（如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移）的調(diào)控，且與腫瘤進(jìn)展過(guò)程密切相關(guān)［13］。miRNA通過(guò)作用于靶信使RNA 參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡過(guò)程，人類miR-489 定位于7 號(hào)染色體，主要表現(xiàn)為抑癌功能，在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷徙及轉(zhuǎn)移過(guò)程［14］。研究顯示，lncRNA CHRF 作為miR-489 的天然“海綿”，通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Myd88表達(dá)，抑制血管緊張素Ⅱ生成，在肥大心肌細(xì)胞中表達(dá)特異性升高，并誘導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生［15］。研究顯示，lncRNA CHRF可吸附miR-489，解除其對(duì)靶基因MyD88 和Smad3的抑制作用，從而激活炎癥和纖維化信號(hào)通路，在肺纖維化的發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［16］。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織lncRNA CHRF 表達(dá)高于癌旁組織、miR-489 表達(dá)低于癌旁組織，并與胃癌患者的臨床分期和分化程度有關(guān)，TNM 分期越高、分化程度越低的胃癌組織表達(dá)變化越明顯，提示二者與胃癌的發(fā)生及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。

EMT 存在于多種惡性腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中，表現(xiàn)為腫瘤上皮細(xì)胞受到細(xì)胞外因子刺激后失去極性，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞遷徙和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力升高。研究表明，EMT活性與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［17］。雖然發(fā)生EMT 的細(xì)胞類型和組織環(huán)境會(huì)有差異，但發(fā)生EMT的過(guò)程會(huì)存在一些共同特征，通過(guò)檢測(cè)EMT 相關(guān)蛋白可反映上皮細(xì)胞的EMT 狀態(tài)。E-cadherin 作為細(xì)胞黏附連接的關(guān)鍵分子，是EMT 的重要標(biāo)志物，其表達(dá)下降時(shí)常伴有Wnt 通路激活，減弱了GSK3β 對(duì)Snail 的抑制作用，從而促進(jìn)EMT 的發(fā)生。Snail、Vimentine 與啟動(dòng)因子結(jié)合后引起轉(zhuǎn)錄抑制，可降低E-cadherin 表達(dá)，促進(jìn)EMT 過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織Vimentine 和Snail 蛋白表達(dá)高于癌旁組織，E-cadherin 蛋白表達(dá)低于癌旁組織，提示胃癌細(xì)胞存在EMT 過(guò)程。分析其機(jī)制，可能是當(dāng)胃癌發(fā)生后，黏附分子及基因表達(dá)發(fā)生病理性改變，啟動(dòng)因子胞嘧啶—磷酸—鳥(niǎo)嘌呤基序島區(qū)過(guò)度甲基化，活性過(guò)氧化物、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）及凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)升高，造成腫瘤組織E-cadherin表達(dá)降低，而E-cadherin 表達(dá)降低可使腫瘤細(xì)胞間黏附作用降低或喪失，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易遷徙和轉(zhuǎn)移；Vimentine 表達(dá)升高可激活C-src 原癌基因，進(jìn)一步使限速酶己糖激酶磷酸化，為腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移提供有利條件；Snail 可通過(guò)與E-cadherin 啟動(dòng)子區(qū)的作用元件E-box 結(jié)合，從而抑制E-cadherin 轉(zhuǎn)錄，參與胃癌的發(fā)生及病理進(jìn)展過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，miR-489 表達(dá)與E-cadherin 呈正相關(guān)關(guān)系，與Vimentine 和Snail 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；而lncRNA CHRF 表達(dá)與E-cadherin 蛋白呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Vimentine、Snail 呈正相關(guān)關(guān)系。研究顯示，miR-489 通過(guò)靶向抑制Twistl 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲過(guò)程，同時(shí)miR-489 可通過(guò)抑制EMT 過(guò)程，參與抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與病理進(jìn)展；此外，miR-489 可直接調(diào)控靶基因（如Akt3、PTPN11、MyD88 等）及相關(guān)通路，影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為［18］。因此，miR-489 可通過(guò)多種途徑對(duì)胃癌細(xì)胞形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終影響胃癌的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程。而當(dāng)miR-489 表達(dá)降低時(shí)，其對(duì)胃癌細(xì)胞及EMT 過(guò)程的抑制作用減弱，更有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及病理進(jìn)展。lncRNA CHRF 可能通過(guò)調(diào)控EMT 相關(guān)蛋白和miR-489 表達(dá)，參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程，然而其具體的信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA CHRF 高表達(dá)者3 年生存率低于lncRNA CHRF 低表達(dá)者，miR-489 高表達(dá)者3年生存率高于miR-489低表達(dá)者，進(jìn)一步分析顯示胃癌組織lncRNA CHRF 表達(dá)升高及miR-489表達(dá)降低是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。推測(cè)lncRNA CHRF 表達(dá)上調(diào)、miR-489 表達(dá)下調(diào)更有利于胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移灶隱匿性發(fā)展，從而使手術(shù)難以切除所有的病灶，增加了患者復(fù)發(fā)及術(shù)后死亡的風(fēng)險(xiǎn)。另外，癌組織lncRNA CHRF 表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT，促進(jìn)腫瘤分化、轉(zhuǎn)移的同時(shí)，增加了輔助治療藥物的耐藥性，從而影響患者預(yù)后［19］。

綜上所述，胃癌組織lncRNA CHRF 表達(dá)升高、miR-489表達(dá)降低，二者參與了EMT 的發(fā)生，并與患者的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)。lncRNA CHRF 高表達(dá)和miR-489 低表達(dá)是胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為胃癌診療的特異性生物標(biāo)志物。