hsa_circ_0131457 在胰腺癌組織中的表達變化及其過表達對癌細胞生物學(xué)行為的影響

孔盼盼，董永良，劉慧芳，晏冬

1 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科一病區(qū)，烏魯木齊 830000；2 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究生科

胰腺癌惡性程度高，預(yù)后極差，總體5 年生存率僅9%左右，是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一［1］。胰腺癌發(fā)病隱匿，大部分患者早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，就診時已處于中晚期，導(dǎo)致手術(shù)切除率不足20%［2-3］。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類不具有5′末端帽子和3′末端polyA 尾巴，并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的RNA 分子。circRNA 穩(wěn)定性高，不易被降解，大量存在于唾液、外泌體及血液中，可作為腫瘤診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物［3］。近年來研究證實，circRNA 異常表達參與了胰腺癌、食管鱗癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4-6］。過表達hsa_circ_0000662、has_circ_0086375 可抑制胰腺癌細胞增殖、侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡，進而抑制腫瘤生長［7-8］。hsa_circ_0006988 在胰腺癌組織和血漿中的表達升高，且與臨床分期、淋巴結(jié)浸潤和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，有可能成為胰腺癌預(yù)后評估的新型分子標(biāo)志物［9］。研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0131457 定位于第6 號染色體，是SOX4 基因外顯子編碼的circRNA，對非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用［10］。然而hsa_circ_0131457 在胰腺癌中的作用及功能鮮見報道。2021年6月—2023年6月，本研究觀察了hsa_circ_0131457在胰腺癌組織及細胞中的表達變化及其對胰腺癌細胞生物學(xué)行為的影響，為胰腺癌的臨床診治及預(yù)后評估提供潛在生物標(biāo)志物?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 組織：選取2020年1月—12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科收治的胰腺癌患者7 例，術(shù)中收集其胰腺癌組織及配對癌旁正常組織各7 例份。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次就診，術(shù)前未行化療或放療等抗腫瘤治療；②行胰腺手術(shù)，術(shù)后病理診斷為胰腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)檢查或術(shù)中發(fā)現(xiàn)有遠處轉(zhuǎn)移的晚期胰腺癌患者；②伴有其他惡性腫瘤或其他相關(guān)嚴重疾病。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核（K-2020023），患者均簽署知情同意書。細胞：胰腺癌細胞PANC-1、SW1990、CFPAC-1 及正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7 均購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。主要試劑：RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑盒購自美國Applied Biosystems 公司，CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒均購自日本同仁公司，細胞凋亡、周期試劑盒均購自上海吉凱科技股份有限公司，凋亡相關(guān)蛋白細胞周期素D2（CCND2）和周期素依賴性激酶4（CDK4）重組蛋白檢測試劑盒均購自上海鈺博生物科技有限責(zé)任公司，hsa_circ_0131457 過表達載體pHBLV-ciR購自廣州吉賽生物科技股份有限公司。

1.2 胰腺癌組織和細胞hsa_circ_0131457檢測 采用實時熒光定量PCR 法。收集對數(shù)生長期的胰腺癌細胞PANC-1、SW1990、CFPAC-1 和正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE6-C7。采用TRIzol 法提取胰腺癌組織、癌旁正常組織及上述細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 反應(yīng)體系10 μL：cDNA 樣本1 μL，2 × SYBR Green Select Mix 5 μL，上、下游引物各0.7 μL，ROX 0.05 μL，使用RNase-free Water 補充至10 μL。引物序列：hsa_circ_0131457 上游引物5′-GCCCGACAUGCACAACGCCGAGA-3′，下游引物5′-GGAGCGGCUGCGC CUAAGCAUCA-3′。采用2-ΔΔCt法計算hsa_circ_0131457相對表達量。

1.3 細胞分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

1.3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證 采用Fast pfu 擴增hsa_circ_0131457 過表達載體 pHBLV-ciR 的hsa_circ_0131457 序列，構(gòu)建過表達質(zhì)粒pHBLVcirc_0131457，將pHBLV- circ_0131457 采用慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到hsa_circ_0131457 表達最低的胰腺癌細胞中，48 h 后使用1 μg/mL 嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。將過表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)入胰腺癌細胞中，通過GFP熒光檢測轉(zhuǎn)染效率合格。

1.3.2 細胞分組處理 取hsa_circ_0131457表達最低胰腺癌細胞進行后續(xù)實驗，在細胞融合率80%左右且生長狀態(tài)良好時，使用完全培養(yǎng)基制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5 × 105/mL。將細胞接種至96孔板，分為過表達組和對照組，分別采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染“1.3.1”中構(gòu)建的過表達質(zhì)粒及對照質(zhì)粒。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法。取兩組轉(zhuǎn)染后的細胞，37 ℃條件下進行細胞培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，加入配置好的10% CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的OD值，以此表示細胞增殖能力。

1.5 細胞凋亡能力觀察 采用TUNEL 染色。取兩組轉(zhuǎn)染后的細胞，使用二甲苯脫蠟5～10 min，換用新鮮的二甲苯再次脫蠟5～10 min，無水乙醇作用5 min，90%乙醇作用2 min、70%乙醇作用2 min、蒸餾水作用2 min，20～37 ℃條件下滴加不含DNase 的蛋白酶K 20 μg/mL 作用15～30 min；使用PBS 或HBSS 洗滌3 次，在樣品上滴加TUNEL 檢測液50 μL，37 ℃避光孵育60 min。最后用抗熒光淬滅封片液封片，激發(fā)波長450～500 nm、發(fā)射波長515～565 nm，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況，以熒光信號的強度表示凋亡能力的強弱，計算細胞凋亡率。

1.6 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。用marker 筆在6 孔板背后作均勻的橫線，每隔0.5～1 cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。取對數(shù)生長期的胰腺癌細胞，以5 × 105/孔接種于6 孔板，參照“1.3.2”進行分組處理，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。第二天在孔板上作一垂直于背后橫線的劃痕，PBS沖洗3 次，去除劃下的細胞。加入無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)0、24 h進行拍照，測量劃痕距離，其差值即為細胞遷移距離。

1.7 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell 小室實驗。在Transwell 小室的下室（即24 孔板底部）加入含10% FBS 的培養(yǎng)基600～800 μL，上室加入兩組轉(zhuǎn)染后的細胞懸液100 μL（細胞密度為2 × 105/mL），孵箱培養(yǎng)24 h，用鑷子小心取出chamber，PBS 沖洗2 次。移到預(yù)先加入4%甲醛的孔中，室溫固定20 min，取出chamber，PBS 沖洗2 次。移到預(yù)先加入甲醇的孔中，室溫透化20 min，取出chamber，PBS 沖洗2 次。移到預(yù)先加入Giemsa 染液的孔中，室溫避光染色5 min，取出chamber，PBS 洗2 次。用濕棉棒擦去上室底部膜表面細胞，底面朝上晾干，移至載玻片，顯微鏡下對穿膜細胞進行計數(shù)。

1.8 細胞CCND2、CDK4 蛋白檢測 采用Western blotting法。取兩組轉(zhuǎn)染后的細胞，加入含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。裂解后用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，將細胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中。將樣品加入等量的2 × SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱3～5 min，12 000 r/min 離心1 min。取上清行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），在電泳槽中加入1 × 電泳緩沖液，連接電源。轉(zhuǎn)膜完成后，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入CCND2、CDK4及內(nèi)參GAPDH一抗、二抗，顯影液避光顯色和顯影。使用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影成像，Image J軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用S-W 正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織和癌旁正常組織hsa_circ_0131457相對表達量比較 胰腺癌組織和癌旁正常組織hsa_circ_0131457 相對表達量分別為0.011 ±0.017、2.084 ± 2.287，二者比較P＜0.05。

2.2 胰腺癌細胞與正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞hsa_circ_0131457 相對表達量比較 胰腺癌PANC-1、SW1990、CFPAC-1 細胞hsa_circ_ 0131457 相對表達量分別為0.123 ± 0.110、0.159 ± 0.082、0.141 ±0.129，均低于正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞的1.174 ±0.839（P均＜0.05）。選取hsa_circ_0131457 表達最低的胰腺癌PANC-1 細胞用于后續(xù)細胞學(xué)研究。

2.3 兩組不同時間點細胞增殖能力比較 見表1。

表1 兩組不同時間點細胞增殖能力比較（）

表1 兩組不同時間點細胞增殖能力比較（）

注：與對照組同時間點比較，*P＜0.05。

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2.4 兩組細胞凋亡率、遷移距離及穿膜細胞數(shù)比較 見表2及OSID碼圖1。

表2 兩組細胞凋亡率、細胞遷移距離及穿膜細胞數(shù)比較（）

表2 兩組細胞凋亡率、細胞遷移距離及穿膜細胞數(shù)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

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2.5 兩組細胞CCND2、CDK4 蛋白相對表達量比較 見表3及OSID碼圖2。

表3 兩組細胞CCND2、CDK4蛋白相對表達量比較（）

表3 兩組細胞CCND2、CDK4蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

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3 討論

胰腺癌是實體腫瘤中致死率最高的腫瘤之一，可通過神經(jīng)、血管和淋巴等途徑進行遠處轉(zhuǎn)移，極大地降低了患者的生存率，已成為全球腫瘤相關(guān)死亡的第三大主要原因［1］。目前有關(guān)胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的具體機制尚不明確，探索其侵襲轉(zhuǎn)移的機制對于尋找新的胰腺癌診治靶點具有重要意義。已有研究表明，circRNA 與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病等多種疾病密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可以起到抑制或促進兩種不同的作用［11］。circRNA 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表達豐度高且具有組織特異性、高度保守等特性，逐漸成為目前RNA 領(lǐng)域研究的最新熱點［12］。

circRNA 主要通過以下機制發(fā)揮作用：①微小RNA（miRNA）的海綿作用。circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點，在細胞中起到miRNA 海綿的作用，進而解除miRNA 對其靶基因的抑制作用，升高靶基因表達，這一作用機制被稱為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機制。②順式調(diào)控親本基因表達。大多數(shù)circRNA主要位于細胞質(zhì)，circRNA 可能作為ceRNA，通過競爭miRNA 結(jié)合位點來調(diào)節(jié)其活性。③調(diào)節(jié)RNA 結(jié)合蛋白。RNA 結(jié)合蛋白在轉(zhuǎn)錄后過程中對RNA 的調(diào)控至關(guān)重要，參與了RNA 的成熟、運輸、定位和翻譯；RNA 聚合酶等RNA 結(jié)合蛋白可以與circRNA 結(jié)合，從而影響circRNA 的剪接、折疊、穩(wěn)定、加工和定位。④蛋白翻譯功能。circRNA 以往因為沒有5′末端帽子和3′末端polyA 尾巴，被認為是不能被翻譯的，研究顯示僅有少部分的circRNA 具有蛋白翻譯功能，其中與多聚體相關(guān)的circ-ZNF609可以被翻譯成蛋白［13］。ZHANG 等［14］研究顯示，circLARP4 可通過調(diào)節(jié)miR-424/LATS1/YAP信號通路，抑制胃癌細胞的增殖和侵襲。CHEN 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，has_circ_0000190 在胃癌患者的血漿及組織中表達均下調(diào)，可以作為診斷胃癌的潛在生物標(biāo)志物，且相對于癌胚抗原（CEA）和糖類抗原199（CA199）這兩種經(jīng)典的胃癌標(biāo)記物，has_circ_0000190的診斷敏感度及特異度更高。HAN 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，circMTO1 可以作為miR-9 的海綿體而抑制肝細胞癌的進展［17］。在膽囊癌中，circTCF25 過表達可以下調(diào)miR-103a-3p/miR-107，導(dǎo)致包括CDK6 在內(nèi)的13 項靶基因上調(diào)，從而在體外和體內(nèi)促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲［18］。然而目前尚缺乏關(guān)于circRNA 在胰腺癌中的研究報道。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織hsa_circ_0131457表達降低，且胰腺癌PANC-1、SW1990、CFPAC-1 細胞hsa_circ_ 0131457相對表達量均低于正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞，提示胰腺癌的發(fā)生發(fā)展可能與hsa_circ_0131457 低表達有關(guān)。為了探討hsa_circ_0131457 對胰腺癌細胞生物學(xué)行為的影響，本研究以hsa_circ_0131457 表達降低最明顯的胰腺癌PANC-1 細胞為研究對象，并進行hsa_circ_0131457過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；結(jié)果顯示，過表達hsa_circ_0131457 后的胰腺癌細胞增殖能力、細胞遷移距離及穿膜細胞數(shù)均降低，細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白CCND2、CDK4 表達均升高。CCND2 編碼的蛋白質(zhì)屬于高度保守的細胞周期蛋白家族，其成員在細胞周期內(nèi)具有顯著的蛋白質(zhì)豐度周期性。CDK4 在細胞周期的G1期發(fā)揮重要作用，其與配體蛋白D 型結(jié)合形成復(fù)合物，能夠磷酸化細胞周期蛋白抑制因子，從而促進細胞周期的進展。以上結(jié)果證實，hsa_circ_0131457 過表達對胰腺癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移具有抑制作用，是重要的抑癌因子。

綜上所述，hsa_circ_0131457在胰腺癌組織和細胞中表達均降低，過表達hsa_circ_0131457 可抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并通過上調(diào)CCND2、CDK4 表達促進細胞凋亡。本研究闡述了hsa_circ_0131457對胰腺癌進展的影響，為胰腺癌的治療提供了新靶點。