circRNA_0031269調(diào)控miR-127-3p影響宮頸癌細(xì)胞的增殖及遷移

譙敏 黃樹峰 武艷玲

【摘要】 目的 探討circRNA_0031269調(diào)控miR-127-3p影響宮頸癌細(xì)胞的增殖及遷移。方法 選取深圳市南山區(qū)前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院2020年3月—2021年4月婦科腫瘤?？剖罩蔚?0例宮頸癌患者，經(jīng)手術(shù)治療切除的癌組織和癌旁組織。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)不同組織中circRNA_0031269和miR-127-3p的相對(duì)表達(dá)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)觀察circRNA_0031269和miR-127-3p的靶向關(guān)系。采用MTT、Transwell細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移能力。結(jié)果 癌組織中circRNA_0031269表達(dá)高于癌旁組織，miR-127-3p表達(dá)低于癌旁組織（P<0.05）；miR-127-3p過表達(dá)可降低WT-circRNA0031269的熒光酶活性，與anti-miR-NC組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；anti-miR-127-3p過表達(dá)可抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移，與anti-miR-NC組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；抑制circRNA_0031269表達(dá)可抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移，上調(diào)miR-127-3p表達(dá)，與si-NC組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 circRNA0031269可通過上調(diào)miR-127-3p表達(dá)降低宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和遷移。

【關(guān)鍵詞】 宮頸癌；CircRNA_0031269；MiR-127-3p；遷移

Effect of circRNA_0031269 by regulating miR-127-3p on the proliferation and migration of cervical cancer cells

Qiao Min，Huang Shufeng，Wu Yanling. Department of Gynecology，Qianhai Shelcon Free Trabe Zone Hospital，Nanshan District，Shenzhen，Guangdong 518000

【Abstract】 Objective To investigate the effect of miR-127-3p regulated by circRNA_0031269 on the proliferation and migration of cervical cancer cells. Methods From March 2020 to April 2021，40 patients with cervical cancer who were admitted to the Department of gynecological oncology in Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital of Nanshan District， Shenzhen were selected for surgical resection of cancer tissues and adjacent tissues. Real time fluorescence qRT-PCR was used to detect circrna in different organizations circRNA_0031269 and miR-127-3. Bouble luciferase reporter gene assay circRNA_0031269 and miR-127-3p. MTT and Transwell cell assay were used to detect the proliferation and migration of cervical cancer cells. Results The expression of circRNA_0031269 was higher and the expression of miR-127-3p was lower in cancer tissues than in adjacent tissues（P<0.05）. MiR-127-3p overexpression decreased the luciferase activity of WT-circRNA_0031269， which was significantly different from the anti-miR-NC group（P<0.05）. Anti-miR-127-3p overexpression inhibited HeLa cell proliferation and migration；compared with the anti-miR-NC group，the difference was statistically significant（P<0.05）. Inhibition of circRNA_0031269 expression inhibited HeLa cell proliferation， migration，and up-regulated miR-127-3p expression；compared with the si-NC group，the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion CircRNA_0031269 can reduce the proliferation and migration of HeLa cells by up-regulating the expression of miR-127-3p.

【Key Words】 Cervical cancer； CircRNA_0031269； MiR-127-3p； Migration

中圖分類號(hào)：R737.33? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1672-1721（2023）32-0061-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.32.021

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)女性死亡的重要原因，嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量及生命安全[1]。癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲是導(dǎo)致死亡的重要因素，因此尋找影響宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的相關(guān)機(jī)制有助于提高臨床診斷及療效。環(huán)狀RNA（circRNA）屬于閉合環(huán)狀類RNA分子，具有較好的穩(wěn)定性，可充當(dāng)miRNA海綿分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用，從而調(diào)控miRNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡等過程[2-3]。既往研究顯示circRNA表達(dá)參與宮頸癌疾病的發(fā)生及發(fā)展，可作為宮頸癌治療靶點(diǎn)及潛在標(biāo)志物[4]。本研究旨在為宮頸癌發(fā)病機(jī)制與臨床治療提供新思路，觀察circRNA_003126和miR-127-3p在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，探索circRNA_003126對(duì)miR-127-3p的調(diào)控作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取深圳市南山區(qū)前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院2020年3月—2021年4月婦科腫瘤?？剖罩蔚?0例宮頸癌患者經(jīng)手術(shù)治療切除的癌組織和癌旁組織（距病灶>3 cm），-80 ℃保存?；颊吣挲g44～68歲，平均年齡（57.19±8.32）歲，均為宮頸鱗癌。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)及組織病理學(xué)確診，符合《宮頸癌診療規(guī)范》[5]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；入組前均為初次手術(shù)治療者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：入組前已進(jìn)行放化療、免疫治療及藥物等治療者；伴有其他宮頸病變及婦科疾病患者；合并其他腫瘤患者。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（qRT-PCR） 檢測(cè)宮頸癌患者癌組織及癌旁組織中circRNA_0031269和miR-127-3p的表達(dá)。取患者癌組織及癌旁組織樣本，采用TRIzol試劑盒提取總RNA，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。以SYBR Green PCR試劑盒說明書對(duì)目標(biāo)基因擴(kuò)增，使用 2-ΔΔCT方法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。試劑盒均購于賽默飛世爾科技有限公司[6]。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 通過circRNA_0031269和miR-127-3p的靶基因構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體WT-circRNA_0031269、MUT-circRNA_0031269、miR-127-3p-mimics、miR-NC-mimics，每組設(shè)置9孔，按照3×104 個(gè)/孔的密度將HeLa細(xì)胞接種于96孔板（100 μL/孔），24 h后轉(zhuǎn)染miR-127-3p-mimics或miR-NC-mimics和WT-circRNA_0031269或MUT-circRNA_0031269，48 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性[7]。

1.4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按照3×104個(gè)/孔的密度將HeLa細(xì)胞接種于96 孔板（100 μL/孔）中，每組設(shè)置9孔，anti-miR-NC、anti-miR-127-3p、si-NC、si-circRNA_0031269加入200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基混合均勻，加入16 μL Lipofectamine 2000 后室溫靜置5 min，HeLa細(xì)胞與各轉(zhuǎn)染物5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)48 h。取生長良好的細(xì)胞于96孔板中加入20 μL/孔的MTT溶液，CO2培育箱，37 ℃孵育4 h棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光室溫孵育90 min后置于490 nm酶標(biāo)儀讀取吸光度（optical density，OD）值。

1.5 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取生長良好的細(xì)胞于96孔板中轉(zhuǎn)染36 h，200 μL/孔胰酶消化，培養(yǎng)基終止消化后行離心操作，棄培養(yǎng)液，PBS清晰5 min×2。采用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞混懸液，接種至Transwell小室膜上室每孔細(xì)胞數(shù)（2～5）×104個(gè)，小室膜下室加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h后采用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以x±s表示，2組間差異比較采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者circRNA_0031269和miR-127-3p的表達(dá) 癌組織中circRNA_0031269表達(dá)高于癌旁組織，miR-127-3p表達(dá)低于癌旁組織（P<0.05），見表1。

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果 miR-127- 3p過表達(dá)可降低WT-circRNA_0031269的熒光酶活性，與anti-miR-NC組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 miR-127-3p過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移的影響 anti-miR-127-3p過表達(dá)可抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移，與anti-miR-NC組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4 抑制circRNA_0031269對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移的影響 抑制circRNA_0031269可上調(diào)miR-127- 3p表達(dá)，抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移，與si- NC組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3 討論

宮頸癌作為原發(fā)子宮頸部位惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染可引起病情發(fā)展。近年來廣泛的宮頸癌篩查使宮頸癌早期發(fā)現(xiàn)率提高，發(fā)病率和病死率逐漸下降，同時(shí)呈現(xiàn)發(fā)病年輕化趨勢(shì)。癌細(xì)胞的增殖和遷移是宮頸癌患者治療的重要障礙，使晚期宮頸癌患者5年生存率僅為10%左右[8-10]。有研究表明，circRNA和miRNA的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，且存在circRNA靶向調(diào)控miRNA機(jī)制[11]。在多項(xiàng)研究中，circRNA_0011021、circRNA_100269在宮頸癌組織中的表達(dá)，以及對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及細(xì)胞生物學(xué)特征等均具有影響，說明circRNA可參與宮頸癌病理、生理過程，并在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12-13]。miRNA是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與包括細(xì)胞生長、增殖、分化等生物進(jìn)程，其中miR-127-3p在多種癌癥中發(fā)揮重要作用，可通過調(diào)控靶基因結(jié)合使靶蛋白水平降低，從而發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖、遷移等作用[14]。

本研究通過對(duì)40例宮頸癌患者癌組織及癌旁組織取樣，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中circRNA_0031269表達(dá)高于癌旁組織。同時(shí)結(jié)果顯示，miR-127-3p在癌旁組織中表達(dá)水平較在宮頸癌組織中的表達(dá)水平高，提示miR-127-3p在抑制腫瘤的發(fā)生中具有重要意義，或可能作為臨床宮頸癌治療的新靶點(diǎn)，為宮頸癌診斷提供重要的生物標(biāo)志和新思路。本研究結(jié)果證實(shí)，在宮頸癌疾病中circRNA_0031269存在靶向調(diào)控miR- 127-3p機(jī)制，且miR-127-3p過表達(dá)可降低WT-circRNA_0031269的熒光酶活性。通過MTT、Transwell細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本研究結(jié)果顯示，miR-127-3p過表達(dá)可降低HeLa細(xì)胞OD值及遷移細(xì)胞數(shù)量，提示miR-127-3p過表達(dá)可抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移。抑制circRNA_0031269表達(dá)可上調(diào)miR-127-3p表達(dá)，并抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移。上述結(jié)果提示，circRNA_0031269和miR-127-3p參與宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移，宮頸癌細(xì)胞與其表達(dá)水平密切相關(guān)。

綜上所述，circRNA_0031269和miR-127-3p表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移中具有重要意義，circRNA_0031269可通過調(diào)控miR-127-3p升高，而降低宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖、遷移。但仍需完善circRNA_0031269調(diào)控miR-127-3p的關(guān)系對(duì)宮頸癌細(xì)胞發(fā)展的影響，以及通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circRNA_0031269與miR-127-3p分子軸在宮頸癌疾病中的作用機(jī)制。

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