液態(tài)發(fā)酵工藝對(duì)絲狀真菌脂質(zhì)積累的影響研究進(jìn)展

薛福婷,時(shí)文悅,吳 琛,王秀文,李少琦,逄淑嫻,宋元達(dá)

山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院 (淄博 255000)

產(chǎn)油微生物發(fā)酵生產(chǎn)的油脂稱為微生物油脂,與動(dòng)植物油相似,是生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的重要來(lái)源[1]。微生物油脂在脂肪酸組成上多數(shù)是偶數(shù)碳,特別是棕櫚酸(C16: 0, PA)、油酸(C18: 1, OA)等,有些產(chǎn)油微生物也可以產(chǎn)生γ-亞麻酸(C18: 3, GLA)、花生四烯酸(C20: 4, ARA)、二十碳五烯酸(C20: 5, EPA)和二十二碳六烯酸(C22: 6, DHA)等多不飽和脂肪酸,在緩解關(guān)節(jié)腫痛、減輕炎癥、治療心血管疾病、抗癌等方面具有重要的生理功能[2,3]。

絲狀真菌俗稱霉菌,廣泛存在于土壤、水體、空氣及植物根系[4]。在液態(tài)發(fā)酵中的絲狀真菌形態(tài)通常呈現(xiàn)出絮狀、團(tuán)狀和球狀,其形態(tài)上的多樣性遠(yuǎn)復(fù)雜于單細(xì)胞的細(xì)菌和酵母菌[5]。對(duì)于絲狀真菌而言,液態(tài)發(fā)酵具有周期短、易操作的優(yōu)勢(shì);而且在脂質(zhì)代謝過(guò)程中具有簡(jiǎn)單、易調(diào)控的優(yōu)勢(shì)[6]。由于絲狀真菌的油脂含量高并含有豐富的功能性多不飽和脂肪酸而被廣泛研究。本文主要總結(jié)近年來(lái)絲狀真菌利用液態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)脂質(zhì)的研究進(jìn)展,旨在為絲狀真菌規(guī)?；a(chǎn)脂質(zhì)提供參考和依據(jù)。

1 絲狀真菌脂質(zhì)積累概況

目前,能夠用于生產(chǎn)油脂的微生物種類有藻類、酵母菌、絲狀真菌及細(xì)菌,尤其以酵母菌和絲狀真菌的真核生物居多,且含有豐富的脂肪酸種類[7,8],如表1。一些典型的絲狀真菌,包括地半乳霉菌、毛囊霉菌、被孢霉和環(huán)核霉,其積累脂肪酸的能力已經(jīng)得到了廣泛的研究。卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、雅致枝霉(Thamnidiumelegans)、刺孢小克銀漢霉(Cunninghamellaechinulata)、葡萄酒色被孢霉(Mortierellaviticola)、矮被孢霉(Mortierellahumilis)等絲狀真菌能夠積累GLA[7],如拉曼被孢霉(MortierellaRaman)和深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)以葡萄糖為碳源時(shí)積累的GLA產(chǎn)量為1.0～1.6 g/L[9,10]。最早發(fā)現(xiàn)含有ARA的絲狀真菌為青霉菌(Penicilliumcyanuam),其碳源為烷烴時(shí)積累的ARA含量為0.2 mg/g[11],拉曼被孢霉、深黃被孢霉和高山被孢霉(Mortierellaalpina)也是生產(chǎn)ARA的優(yōu)良菌株。在產(chǎn)油微生物中,藻類和酵母菌含有豐富的EPA,終極腐霉(Pythiumultimum)、高山被孢霉等絲狀真菌也具有積累EPA的能力,且高山被孢霉積累的ARA能夠在常溫下轉(zhuǎn)化為EPA[12]。

表1 絲狀真菌和其他產(chǎn)油微生物在脂質(zhì)含量和產(chǎn)油特征方面的比較

2 絲狀真菌的脂肪酸合成過(guò)程

大部分絲狀真菌主要以葡萄糖為碳源進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,葡萄糖在胞液內(nèi)經(jīng)過(guò)糖酵解途徑生成丙酮酸(Pyr),該途徑中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)為脂質(zhì)積累提供所需的還原力,部分丙酮酸進(jìn)入線粒體(Mitochondrion)合成乙酰輔酶A(AcCoA),由于培養(yǎng)基中氮源耗盡使三羧酸循環(huán)(TCA)中檸檬酸(Cit)過(guò)度積累,從而被大量轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì),經(jīng)檸檬酸裂解酶(ACL)催化后產(chǎn)生乙酰輔酶A,隨后經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的作用生成丙二酰輔酶A(MaCoA),最終在脂肪酸合成酶(FAS)、延長(zhǎng)酶及一系列脫飽和酶的作用下生成飽和或不飽和脂肪酸[25,26]。

3 培養(yǎng)基組分對(duì)絲狀真菌脂質(zhì)積累的影響

3.1 碳源

碳源在發(fā)酵過(guò)程中不僅為絲狀真菌提供細(xì)胞骨架以及生長(zhǎng)繁殖所需要的能量,還會(huì)影響其油脂積累能力,以葡萄糖為碳源使絲狀真菌獲得較高的油脂含量,且不同濃度的葡萄糖對(duì)油脂積累具有明顯作用[27]。唐鑫等[28]研究20～80 g/L葡萄糖濃度對(duì)高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)脂質(zhì)的影響,在20～50 g/L濃度的菌體生物量和脂質(zhì)含量逐漸增加,50 g/L的葡萄糖是其發(fā)酵的最佳碳源濃度,高于該濃度時(shí)脂質(zhì)含量逐漸減少。同樣地,嚴(yán)建平等[29]以不同濃度的葡萄糖為單一碳源探究卷枝毛霉EIM-10積累GLA的作用,發(fā)現(xiàn)卷枝毛霉在葡萄糖濃度為60 g/L時(shí)的生物量下降, GLA含量較低。以上研究說(shuō)明,適宜的葡萄糖濃度有利于絲狀真菌生長(zhǎng)和提高脂質(zhì)含量,但濃度過(guò)高可能使發(fā)酵液變得粘稠,導(dǎo)致菌絲體不能均勻生長(zhǎng),最后不利于脂質(zhì)積累。

除葡萄糖外,許多其他碳源可用于絲狀真菌的液態(tài)發(fā)酵。Li等[30]用海藻糖發(fā)酵刺孢小克銀漢霉,GLA占總脂質(zhì)含量為21%,高于使用葡萄糖作為碳源時(shí)的13%。劉尚杰等[31]采用5種碳源(果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖)研究深黃被孢霉突變株A35-4的油脂含量,以果糖為碳源的油脂含量較高,達(dá)到73.84%。因此,不同碳源對(duì)絲狀真菌的生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累方面有重要作用,而木質(zhì)纖維素、非谷物糖原料和商業(yè)廢物等廉價(jià)底物也可以作為碳源,能夠減少大量使用葡萄糖造成的高昂發(fā)酵成本,便于日后擴(kuò)大生產(chǎn)脂質(zhì)[32]。

3.2 氮源

氮源作為絲狀真菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),能夠提供生長(zhǎng)過(guò)程中所需的核苷酸、氨基酸和含氮代謝物等物質(zhì),氮水平的變化可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝的巨大變化。顧曉穎等[33]研究有機(jī)氮源尿素和無(wú)機(jī)氮源硝酸鈉對(duì)高山被孢霉的產(chǎn)脂的影響,該研究表明尿素更適合高山被孢霉生長(zhǎng)和積累ARA。張?zhí)烊坏萚34]采用蛋白胨、硫酸銨、酵母膏、尿素及硝酸銨這5種氮源發(fā)酵深黃被孢霉YZ-124,其中有機(jī)氮源酵母膏最適合菌體的生長(zhǎng)和油脂積累。綜合來(lái)看,有機(jī)氮源更利于絲狀真菌積累脂質(zhì)。

許多研究表明,氮限制和高碳氮比的培養(yǎng)基組分是脂質(zhì)積累的有利條件,可以誘導(dǎo)絲狀真菌產(chǎn)生脂質(zhì),抑制蛋白質(zhì)和核酸合成[35]。Zhao等[36]改變卷枝毛霉發(fā)酵時(shí)的氮源含量,發(fā)酵50 h后發(fā)現(xiàn)卷枝毛霉在高氮培養(yǎng)基中的細(xì)胞干重明顯高于低氮,但低氮中總脂肪酸含量是高氮的1倍多。常璐璐等[37]在高山被孢霉中也探究了碳氮比對(duì)脂質(zhì)積累的影響,同樣發(fā)現(xiàn)低氮內(nèi)脂肪酸含量較高。因此,低氮有利于菌體積累油脂,而高氮?jiǎng)t有利于菌體生長(zhǎng)。

各種氨基酸作為氮源對(duì)絲狀真菌的生長(zhǎng)也具有差異影響,Tang等[38]用20種氨基酸為單一碳源研究卷枝毛霉的脂質(zhì)變化,發(fā)現(xiàn)以酪氨酸為氮源發(fā)酵后的生物量和脂質(zhì)含量最高,GLA含量較高,分別比酒石酸銨為氮源時(shí)高出36%、25%和72%。因此,氨基酸也成為理想的氮源。此外,一些含氮原料黃豆餅粉、玉米漿、花生餅粉等也可替代昂貴的氮源[39]。這些原料不僅成本較低,而且還能促進(jìn)生物量積累和脂質(zhì)產(chǎn)量,大大提高了絲狀真菌生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的經(jīng)濟(jì)效益。

3.3 外源添加物

由于脂肪酶的存在,一些外源油脂也可以促進(jìn)絲狀真菌脂質(zhì)積累,如大豆油、大豆磷脂、植物甾醇、橄欖油等。李利軍等[40]在發(fā)酵液中外源添加大豆油、菜籽油、亞麻籽油培養(yǎng)終極腐霉生產(chǎn)EPA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加大豆油效果最佳,積累的EPA產(chǎn)量為429.89 mg/L;王艷霞等[41]研究了橄欖油添加量對(duì)卷枝毛霉油脂含量的變化,當(dāng)發(fā)酵液中橄欖油濃度為15 g/L時(shí),其生物量和油脂含量達(dá)到最高,因此外源油脂可以促進(jìn)多不飽和脂肪酸的合成。

此外,添加外源底物也可以對(duì)脂質(zhì)積累產(chǎn)生影響。Zhang等[42]在卷枝毛霉Mc-MT-2的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蘋果酸后獲得的脂質(zhì)產(chǎn)率為5.12 g/L,與未添加蘋果酸的對(duì)照菌株相比,提高了2.56倍。另外,在培養(yǎng)基中添加酶類激活劑也能刺激菌體內(nèi)細(xì)胞大量合成油脂。所以,絲狀真菌能夠吸收不同的外源物質(zhì),其中外源油脂能夠有效提高其脂質(zhì)含量并增加脂肪酸種類。

4 液態(tài)發(fā)酵條件對(duì)絲狀真菌脂質(zhì)積累的影響

4.1 pH值

pH值是影響絲狀真菌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞內(nèi)代謝物穩(wěn)定性的最重要參數(shù)之一。細(xì)胞膜的電荷隨著培養(yǎng)基中pH水平的變化而變化,進(jìn)一步影響脂肪酸延長(zhǎng)酶和脫飽和酶的活性,從而改變絲狀真菌吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力[43]。Mohamed等[44]研究pH值為4～8范圍內(nèi)對(duì)卷枝毛霉的影響,在次優(yōu)級(jí)pH環(huán)境中卷枝毛霉生長(zhǎng)較差,pH值為6更適合其生長(zhǎng)和產(chǎn)脂,此時(shí)總脂肪酸含量和GLA含量分別為23%和15%。宋遙遙等[45]研究不同發(fā)酵條件對(duì)深黃被孢霉積累多不飽和脂肪酸的作用,其中pH值的增加使菌體生物量和油脂含量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì),pH為6的發(fā)酵環(huán)境更適合深黃被孢霉的生長(zhǎng)以及油脂的合成。梁凇等[46]探索了pH對(duì)刺孢小克銀霉積累GLA的影響,當(dāng)pH為5時(shí),菌絲分散性較好且均勻分布,此時(shí) GLA含量達(dá)到最高,為16.05%?？傮w來(lái)看,絲狀真菌適合于偏酸性環(huán)境生長(zhǎng),pH值和培養(yǎng)基組分之間的相互作用可以影響絲狀真菌利用有效營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)脂能力。

4.2 溫度

許多研究表明,溫度是影響絲狀真菌脂肪酸組成的主要因素,低溫發(fā)酵可能提高脂肪酸的不飽和度,如合成ARA,EPA,DHA等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸[47]。Zhang等[48]在深黃被孢霉M6-22中研究低溫對(duì)其生產(chǎn)PUFAs的影響,溫度從30 ℃降到15 ℃時(shí),PUFAs含量從20.85%增加到31.04%,維持低溫能有效促進(jìn)PUFAs合成。夏繼蓉等[49]也發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)高山被孢霉的菌體生物量及對(duì)菌體中PUFAs合成具有顯著影響,25 ℃發(fā)酵獲得的生物量最高,但15 ℃發(fā)酵獲得的脂質(zhì)含量最高。張玲等[50]對(duì)雅致枝霉發(fā)酵生產(chǎn)GLA進(jìn)行探究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)12 ℃有利于菌體的生長(zhǎng)和GLA的積累。所以,不同菌株有著不同的最適生長(zhǎng)溫度,培養(yǎng)溫度會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性,低溫促進(jìn)大部分絲狀真菌積累多不飽和脂肪酸,并影響脂肪酸不飽和雙鍵的生成。

4.3 溶氧(DO)

溶氧是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵因素之一,改善發(fā)酵過(guò)程中的溶氧環(huán)境會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物代謝水平造成極大的影響。 Hussain等[51]以150～300 r/min的攪拌速度控制卷枝毛霉發(fā)酵時(shí)的溶氧,在150～220 r/min的總脂質(zhì)含量逐漸增加,而在220 r/min時(shí)的總脂質(zhì)含量最高,超過(guò)該攪拌速度時(shí)的總脂質(zhì)含量降低。因此,適宜的溶氧濃度將促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)油脂積累,在提高溶氧的同時(shí)需避免剪切力作用,防止菌絲損傷。

氧氣供應(yīng)對(duì)于富含多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)積累至關(guān)重要,多不飽和脂肪酸合成過(guò)程是由需氧脂肪酸脫飽和酶及延長(zhǎng)酶途徑催化而成,該過(guò)程中氧消耗極高, 過(guò)量DO濃度已被證明在提高其脂肪酸不飽和程度方面發(fā)揮重要作用[52]。此外,增加輸入氣體混合物中的氧氣分壓也可以提高PUFAs的產(chǎn)量,Higashiyama等[53]通過(guò)增壓和增氧控制高山被孢霉發(fā)酵中的溶氧濃度,結(jié)果表明,最佳DO濃度范圍為10～15 mg/L,與在7 mg/L DO下獲得的結(jié)果相比,該濃度范圍內(nèi)的ARA產(chǎn)率提高了約1.6倍。

4.4 液態(tài)發(fā)酵模式

絲狀真菌的液態(tài)發(fā)酵模式主要有連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵和重復(fù)分批發(fā)酵等,不同發(fā)酵模式為絲狀真菌積累脂質(zhì)提供了優(yōu)化策略。分批發(fā)酵可以獲得大量菌體細(xì)胞、延長(zhǎng)穩(wěn)定期和提高脂質(zhì)含量,研究者通過(guò)建立發(fā)酵參數(shù)的數(shù)學(xué)模型驗(yàn)證分批培養(yǎng)的發(fā)酵方式適合深黃被孢霉生產(chǎn)脂質(zhì)[54]。而補(bǔ)料發(fā)酵可以再次激活產(chǎn)脂代謝,Shuib等[55]發(fā)現(xiàn)班尼小克銀漢霉發(fā)酵48 h后的培養(yǎng)基中酶活性的降低以及金屬離子的消耗導(dǎo)致其脂質(zhì)積累停止,經(jīng)過(guò)補(bǔ)料酒石酸銨、葡萄糖及金屬離子后,酶活性成功恢復(fù),其脂質(zhì)含量從32%增加到50%,并增強(qiáng)了GLA的積累。另外,重復(fù)分批發(fā)酵能夠良好的利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),Dashti等[56]使用不同濃度的氮(1～4 g/L)和葡萄糖(20～40 g/L)對(duì)班尼小克銀漢霉2A1進(jìn)行重復(fù)分批發(fā)酵,結(jié)果表明:在20.2 g/L葡萄糖、2.12 g/L酒石酸銨和收獲時(shí)間48 h的最佳條件下,脂質(zhì)含量和GLA含量達(dá)到最高,分別為6.2 g/L和0.4 g/L,該模式在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中可以重復(fù)使用微生物細(xì)胞,也是脂質(zhì)液態(tài)發(fā)酵中應(yīng)用最廣泛的一種。

5 展望

絲狀真菌作為一類生產(chǎn)脂質(zhì)的微生物,在脂質(zhì)生產(chǎn)中具有較大的潛力,而且富含的多不飽和脂肪酸對(duì)人體健康具有重要意義。為了充分利用這一功能,本文總結(jié)了培養(yǎng)基組分對(duì)絲狀真菌積累脂質(zhì)的影響,其中改變碳源和氮源的種類或比例對(duì)脂質(zhì)積累產(chǎn)生明顯作用,但昂貴的發(fā)酵成本減緩了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程,因此在保持較高的生物量和脂質(zhì)含量下使用廉價(jià)底物替代碳氮源被認(rèn)為是一種可行的策略?？刂埔簯B(tài)發(fā)酵條件在脂質(zhì)積累方面也尤為重要,使得絲狀真菌不僅擁有適宜的生長(zhǎng)環(huán)境,還改善了脂質(zhì)積累量,但通過(guò)改變發(fā)酵條件不能定向生產(chǎn)多不飽和脂肪酸,因此需要借助誘變或基因工程等手段實(shí)現(xiàn)定向生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)。在未來(lái)的發(fā)展中,需要加強(qiáng)絲狀真菌的基礎(chǔ)研究,清晰認(rèn)識(shí)不同絲狀真菌脂質(zhì)合成所涉及的代謝網(wǎng)絡(luò)以及液態(tài)發(fā)酵調(diào)控機(jī)制,特別是,對(duì)菌株進(jìn)行改造并耦合液態(tài)發(fā)酵過(guò)程以強(qiáng)化脂肪酸的生產(chǎn)效率,進(jìn)一步探究液態(tài)發(fā)酵與絲狀真菌之間的聯(lián)系,為絲狀真菌工業(yè)化生產(chǎn)脂質(zhì)創(chuàng)造更廣闊的前景。