磁性聚合物微球固定化發(fā)酵液中脂肪酶

郭俊宏,王添譽(yù),孫西同,李僉*,陳曉藝,李苗,曾祥冰,黃帆,李憲臻*

1(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)2(大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)

脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3)是一類能催化酯分解、酯合成、酯交換等反應(yīng)的酶[1],在食品加工、藥物合成、生物燃料生產(chǎn)、污染物去除等領(lǐng)域都有著重要的作用[2-5]。由于游離酶穩(wěn)定性差,酶活性易受外界環(huán)境和條件影響,難以分離回收再利用,不適合實(shí)際應(yīng)用。酶固定化是克服上述缺點(diǎn)的一種簡(jiǎn)單有效的方法。

目前,酶固定化載體種類多樣,其中磁性材料由于具有獨(dú)特的超順磁性,可以通過外加磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)快速分離,達(dá)到有效回收利用而備受關(guān)注。然而,由于缺乏有效的修飾方法,造成Fe3O4表面的官能團(tuán)數(shù)量有限,直接影響了固定化酶的性能,并且Fe3O4在空氣中容易被氧化[6],應(yīng)用受到限制。樹枝狀大分子是一種有規(guī)則且結(jié)構(gòu)明確的有機(jī)聚合物,具有高度分支的分子結(jié)構(gòu)和豐富的表面基團(tuán),因此樹枝狀大分子修飾是提高表面官能團(tuán)數(shù)量的有效策略。聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)樹枝狀大分子是目前研究最廣泛的樹枝狀大分子之一。PAMAM的外部功能基團(tuán)的密度和剛性取決于它的接枝代數(shù),樹枝狀大分子的接枝代數(shù)越高,靈活性越低,外部官能團(tuán)的數(shù)量則呈指數(shù)增長(zhǎng),可以為酶提供更多的連接位點(diǎn)。因此,PAMAM接枝代數(shù)的增長(zhǎng)在一定程度上是有益的,其良好的生物相容性,使之成為酶固定化的理想載體,但存在難以分離回收等問題[7-9]。

為了解決實(shí)際應(yīng)用中游離脂肪酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性較差的問題,本研究首先使用近平滑假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶,在采用共沉淀法制備油酸修飾的Fe3O4基礎(chǔ)上,使用懸浮聚合法合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球[Fe3O4@Poly(methyl methacrylate),Fe3O4@PMMA]。進(jìn)而通過發(fā)散合成法合成了樹枝狀大分子接枝的磁性聚合物微球(Fe3O4@PMMA/PAMAM),并通過多種方法進(jìn)行表征,進(jìn)一步將Fe3O4@PMMA/PAMAM用于脂肪酶的固定化,并進(jìn)行了固定化工藝的優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis) CICC 33470,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

FeCl3(化學(xué)純)、FeCl2·4H2O、油酸、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)(均為分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二乙烯苯(55%)、PVA-1788、曲拉通X-100、阿拉伯樹膠、棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(p-nitrophenyl palmitate,p-NPP,98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;異丙醇、葡萄糖、可溶性淀粉,均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基,青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Tecan酶標(biāo)儀,勒菲生物科技(上海)有限公司;JSM-7800F熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM),日本電子株式會(huì)社;Zetasizer 3000HSA激光粒度儀(dynamic light scattering,DLS),英國(guó)MALVERN儀器公司;X-Max50能量色散光譜儀(energy dispersive spectrometer,EDS),英國(guó)牛津儀器公司;vario EL cube元素分析儀(element analyzer, EA),德國(guó)Elementar儀器公司;Spectrum two傅立葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR),鉑金埃爾默儀器有限公司;Lake Shore 8600振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(vibrating sample magnetometer,VSM),美國(guó)Lake Shore儀器公司;島津XRD-7000S X射線衍射儀(X-ray diffraction sepectrum,XRD),日本島津株式會(huì)社;DSC Q2000熱重分析儀(thermal gravimetric analyzer,TGA),美國(guó)TA儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備

1.2.1.1 近平滑假絲酵母的傳代

將適量的假絲酵母接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上。30 ℃培養(yǎng)3 d[10],然后重復(fù)此過程,直至假絲酵母?jìng)鞔?次。

1.2.1.2 近平滑假絲酵母的種子培養(yǎng)

按葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、(NH4)2SO41 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO41 g/L配制適量的種子培養(yǎng)基,使用PBS調(diào)其pH值至8.0。再將假絲酵母接種到種子培養(yǎng)基上。于30 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h,制成種子液[11]。

1.2.1.3 近平滑假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)

按可溶性淀粉20 g/L、蛋白胨10 g/L、(NH4)2SO41 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO41 g/L配制適量的發(fā)酵培養(yǎng)基[12],使用PBS將其pH值調(diào)至8.0。再按5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量,將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。于30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)48 h,即可獲得發(fā)酵液[13]。

1.2.2 材料的合成和固定化酶的制備

首先通過共沉淀法制備油酸修飾的Fe3O4,然后使用懸浮聚合法合成Fe3O4@PMMA,再采用發(fā)散合成法合成Fe3O4@PMMA/PAMAM,最后以戊二醛為交聯(lián)劑制備Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶。制備及固定化脂肪酶的工藝流程見圖1。

圖1 Fe3O4@PMMA/PAMAM的制備及固定化脂肪酶的工藝流程

1.2.2.1 油酸修飾的Fe3O4的制備

將3.33 g FeCl2·4H2O、5.47 g FeCl3和200 mL去離子水加入三頸燒瓶中,在N2保護(hù)下開始攪拌,升溫至85 ℃。然后,向反應(yīng)體系中迅速倒入20 mL NH3·H2O,再向其中滴加7.5 mL油酸。恒溫反應(yīng)30 min后,將產(chǎn)物用磁鐵進(jìn)行分離,再用去離子水洗滌數(shù)次,即可獲得油酸修飾的Fe3O4。經(jīng)真空干燥后,室溫下保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.2.2 Fe3O4@PMMA的合成

采用懸浮聚合法合成Fe3O4@PMMA[14]。

1.2.2.3 Fe3O4@PMMA/PAMAM的合成

酰胺化反應(yīng)。將一定量的Fe3O4@PMMA、150 mL DMF和75 mL乙二胺(ethylenediamine,EDA)加入三頸燒瓶中,在N2保護(hù)下開始攪拌,升溫至80 ℃。恒溫反應(yīng)8 h后,將產(chǎn)物在外加磁場(chǎng)下進(jìn)行磁分離,再用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次。經(jīng)真空冷凍干燥后,室溫下保存。將所得的氨基化的磁性聚合物微球命名為G-0。

邁克爾加成反應(yīng)。將一定量的G-0、150 mL DMF和50 mL丙烯酸甲酯(methyl acrylate,MA)加入三頸燒瓶中并在N2保護(hù)下開始攪拌,升溫至80 ℃,恒溫反應(yīng)8 h后,將產(chǎn)物在外加磁場(chǎng)下進(jìn)行磁分離,再用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次。經(jīng)真空冷凍干燥后,室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

將邁克爾加成反應(yīng)得到的產(chǎn)物再進(jìn)行一次酰胺化反應(yīng),得到的第1代樹枝狀大分子接枝的磁性聚合物微球,命名為G-1。與此類似,制備第2代和第3代微球材料,分別命名為G-2和G-3。

1.2.2.4 Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶

a)載體的活化。將20 mg載體、5 mL pH值為8.0的PBS和0.4 mL戊二醛加入錐形瓶中。在30 ℃,180 r/min培養(yǎng)10 h后,將活化的載體在外加磁場(chǎng)下進(jìn)行磁分離并用去離子水洗滌數(shù)次后保存。

b)脂肪酶的固定化。將10 mL發(fā)酵液、5 mL pH值為8.0的PBS及活化的載體加入錐形瓶中。在25 ℃,180 r/min培養(yǎng)4 h后,將固定化脂肪酶在外加磁場(chǎng)下進(jìn)行磁分離并用去離子水洗滌數(shù)次后保存在4 ℃冰箱中。

1.2.3 脂肪酶活力和酶活力回收率的測(cè)定

使用p-NPP水解產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)的反應(yīng)測(cè)定脂肪酶活力。檢測(cè)405 nm處的吸光度,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定p-NP的濃度[15]。酶活力單位(U)定義:在一定條件下每分鐘水解p-NPP產(chǎn)生1 μmolp-NP所需的酶量。具體過程如下:

將0.8 g曲拉通X-100、0.2 g阿拉伯樹膠和100 mL pH值為8.0的PBS加入燒杯中,攪拌至完全溶解,即為A液。將p-NPP溶解到異丙醇中,配制成均勻的溶液,即為B液。將A液和B液按體積比3∶1混合均勻,配制成p-NPP質(zhì)量濃度為5 mg/mL的底物溶液。

將一定量的脂肪酶與3 mL底物溶液共同加入離心管中,50 ℃下水浴反應(yīng)10 min后,加入2 mL 0.25 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng),離心取上清液,在405 nm下測(cè)定吸光度。脂肪酶活力、酶活力回收率分別按公式(1)、公式(2)計(jì)算:

(1)

式中:c,p-NP的濃度,μmol/mL;V,溶液的總體積,mL;t,反應(yīng)時(shí)間,min;m,載體質(zhì)量,g。

(2)

式中:X,固定化脂肪酶的酶活力,U/g;Y,固定化前游離脂肪酶的酶活力,U/g;Z,固定化后上清液中的酶活力,U/g。

1.2.4 材料的表征

使用SEM、DLS、EDS、EA、FT-IR、VSM、XRD、TGA對(duì)材料進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe3O4@PMMA/PAMAM的表征

Fe3O4@PMMA/PAMAM的SEM圖像如圖2-a所示,G-3大致具有球形形貌,平均直徑在2～3 μm,這可以為固定化脂肪酶提供較大的比表面積。Fe3O4@PMMA/PAMAM的粒徑分布如圖2-b所示,G-3的平均粒徑為2.6 μm,這與SEM觀測(cè)的結(jié)果一致。

a-掃描電鏡圖像;b-粒徑分布

Fe3O4@PMMA/PAMAM的EDS分析結(jié)果如圖3所示,G-1、G-2和G-3的N元素含量百分比分別為0.995%、1.175%和1.360%。Fe3O4@PMMA/PAMAM上的N元素的主要來源是酰胺和氨基。N元素的含量隨著接枝代數(shù)的增加而增加,說明G-1、G-2和G-3均被成功合成。

圖3 Fe3O4@PMMA/PAMAM的N元素能譜結(jié)果

Fe3O4@PMMA/PAMAM的EA分析如表1所示,G-1、G-2和G-3的C元素、N元素和H元素的比例均隨著接枝代數(shù)的增加而增加,說明了Fe3O4@PMMA/PAMAM被成功制備。同時(shí),G-1、G-2和G-3的N元素含量分別為0.99%、1.13%和1.26%,這與EDS分析的結(jié)果相似。

表1 Fe3O4@PMMA/PAMAM的元素分析結(jié)果 單位:%

Fe3O4@PMMA/PAMAM的FT-IR圖如圖4所示,G-1、G-2和G-3均在590 cm-1處有著Fe—O鍵伸縮振動(dòng)的特征吸收峰[16]。

圖4 Fe3O4@PMMA/PAMAM的紅外光譜圖

G-1、G-2和G-3還在1 690、1 565、1 410 cm-1處具有特征吸收峰,這與—CO—NH—鍵的伸縮振動(dòng)有關(guān)[8,16-17]。G-1、G-2和G-3的C—H鍵和N—H鍵的伸縮振動(dòng)特征吸收峰則分別出現(xiàn)在2 950、3 430 cm-1處[8,16]。從FT-IR圖中可以看出,G-1、G-2和G-3均被成功合成。

Fe3O4@PMMA/PAMAM的磁化曲線如圖5所示,G-3具有極低的剩磁和矯頑力,呈現(xiàn)典型的s型磁滯回線,證明了其擁有超順磁性[18]。G-3的最大飽和磁化強(qiáng)度值為24.65 emu/g。結(jié)果表明Fe3O4@PMMA/PAMAM不僅具有超順磁性和較高的最大飽和磁化強(qiáng)度值,還有著良好的磁響應(yīng)性。

圖5 Fe3O4@PMMA/PAMAM的磁滯回線

Fe3O4@PMMA/PAMAM的XRD譜圖如圖6所示,G-1、G-2和G-3都在2θ=30.25°,35.55°,43.10°,53.88°,57.24°和62.93°處有6個(gè)衍射峰,與標(biāo)準(zhǔn)Fe3O4的(220,311,400,422,511和440)XRD峰相比(JCPDS card No.65-3107),峰的位置基本相同[19]。結(jié)果表明Fe3O4@PMMA/PAMAM的晶體結(jié)構(gòu)在修飾過程中沒有發(fā)生明顯變化。

圖6 Fe3O4@PMMA/PAMAM的X射線衍射譜圖

G-3和使用G-3作為載體的固定化脂肪酶(G-3-lipase)的熱重分析曲線如圖7所示,G-3和G-3-lipase的質(zhì)量在300 ℃以下發(fā)生了輕微地下降,分別為6.53%和6.26%,這主要?dú)w因于結(jié)合的水的蒸發(fā)[16]。而G-3和G-3-lipase的質(zhì)量在300 ℃以上則迅速損失,分別為47.48%和56.79%,這主要是由有機(jī)層的熱分解引起的[20]。相較于G-3,G-3-lipase的重量損失更多,這與固定在載體上的脂肪酶的部分分解有關(guān),證明了脂肪酶被成功固定化到載體上。

圖7 G-3和G-3-lipase的熱重分析曲線

2.2 固定化脂肪酶的工藝優(yōu)化

不同固定化條件對(duì)固定化脂肪酶相對(duì)酶活力的影響如圖8所示。當(dāng)戊二醛用量為0.6 mL時(shí),固定化脂肪酶有著最高的酶活力(圖8-a)。當(dāng)戊二醛用量小于或大于0.6 mL時(shí),固定化脂肪酶活力均降低。這是因?yàn)楫?dāng)戊二醛用量較少時(shí),僅有一小部分脂肪酶可以被連接到載體上[21],而當(dāng)戊二醛用量較多時(shí),會(huì)導(dǎo)致部分活化的載體發(fā)生過度偶聯(lián),使其連接脂肪酶的能力降低,并且引起脂肪酶活力的損失[22]。因此,選擇0.6 mL作為最優(yōu)的戊二醛用量。

a-戊二醛體積;b-固定化時(shí)間;c-緩沖液pH值;d-固定化溫度

如圖8-b所示,當(dāng)固定化時(shí)間為5 h時(shí),固定化脂肪酶的活力達(dá)到最大值。在較短或較長(zhǎng)的固定化時(shí)間下,固定化脂肪酶活力均降低。主要原因是較短的固定化時(shí)間導(dǎo)致載體與脂肪酶無法充分接觸,載體上固定化的脂肪酶量較少,而脂肪酶與活化的載體的長(zhǎng)時(shí)間接觸引起了脂肪酶活力的損失[23]。因此,選擇5 h作為最優(yōu)的固定化時(shí)間。

如圖8-c所示,當(dāng)固定化pH值為8.0時(shí),固定化脂肪酶具有最高的活力。當(dāng)固定化pH值小于或大于8.0時(shí),固定化脂肪酶活力均降低。由于脂肪酶的構(gòu)象特性,固定化脂肪酶在固定化pH較低或較高的情況下活力較差[24]。因此,選擇8.0作為最優(yōu)的固定化pH值。

如圖8-d所示,當(dāng)固定化溫度為35 ℃時(shí),固定化脂肪酶活力最高。在較低或較高的固定化溫度下,固定化脂肪酶活力均降低。這是因?yàn)?在較低的固定化溫度下,固定化溫度的升高促進(jìn)了脂肪酶與載體的接觸[21]。在較高的固定化溫度下,由于熱變性,脂肪酶的構(gòu)象發(fā)生改變[25]。因此,選擇35 ℃作為最優(yōu)的固定化溫度。

2.3 發(fā)酵生產(chǎn)的游離脂肪酶和固定化脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

不同反應(yīng)條件下發(fā)酵生產(chǎn)的游離脂肪酶和固定化脂肪酶的相對(duì)酶活力如圖9所示。發(fā)酵液中的游離脂肪酶和固定化脂肪酶的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃(圖9-a)。當(dāng)反應(yīng)溫度小于或大于50 ℃時(shí),游離脂肪酶和固定化脂肪酶活力均降低,但固定化脂肪酶的下降幅度較小。

a-溫度;b-pH值

如圖9-b所示,發(fā)酵液中的游離脂肪酶的最適反應(yīng)pH值為8.0,而固定化脂肪酶的最適反應(yīng)pH值為9.0。脂肪酶固定化到Fe3O4@PMMA/PAMAM上后,最適反應(yīng)pH發(fā)生了明顯變化,主要原因是脂肪酶所處的微環(huán)境發(fā)生了改變[26]。當(dāng)反應(yīng)pH小于或大于最適條件時(shí),游離脂肪酶和固定化脂肪酶活力均降低,但固定化脂肪酶的下降幅度較小。

結(jié)果表明發(fā)酵液中的游離脂肪酶對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH敏感,僅能在50 ℃和8.0左右的較小的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH范圍內(nèi)具有較高的酶活力,而固定化脂肪酶可以在更大的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH范圍內(nèi)保持較高的酶活力。這是因?yàn)橥ㄟ^在固定化過程中形成大量的共價(jià)鍵,增加了脂肪酶構(gòu)象的剛性,降低了脂肪酶活力損失[27]。

發(fā)酵生產(chǎn)的游離脂肪酶和固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性如圖10所示。隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng),發(fā)酵液中的游離脂肪酶和固定化脂肪酶活力均逐漸降低,但固定化脂肪酶的下降幅度較低(圖10-a)。在50 ℃下熱處理5 h后,發(fā)酵液中的游離脂肪酶的剩余酶活力僅為15.48%,相比之下,固定化脂肪酶的相對(duì)酶活力明顯高于游離脂肪酶,為50.97%。

a-脂肪酶在50 ℃下的熱穩(wěn)定性;b-脂肪酶在pH 9.0下的熱穩(wěn)定性

如圖10-b所示,隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng),發(fā)酵液中的游離脂肪酶和固定化脂肪酶活力均逐漸降低,但固定化脂肪酶的下降幅度較低。在pH值為9.0的PBS中處理5 h后,發(fā)酵液中的游離脂肪酶的剩余酶活力僅為34.25%,與之相比,固定化脂肪酶的相對(duì)酶活力明顯高于游離脂肪酶,為81.74%。

結(jié)果表明脂肪酶固定化到Fe3O4@PMMA/PAMAM上后,熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均明顯增強(qiáng)。穩(wěn)定性增強(qiáng)的主要原因是脂肪酶與Fe3O4@PMMA/PAMAM間形成的共價(jià)鍵限制了脂肪酶構(gòu)象的變化,使其在較為惡劣的條件下保持穩(wěn)定[28]。

固定化脂肪酶的重復(fù)使用性和貯存穩(wěn)定性如圖11所示。隨著循環(huán)次數(shù)的增加,固定化脂肪酶活力逐漸降低,重復(fù)使用10次后,固定化脂肪酶仍能維持72.23%的酶活性(圖11-a)。結(jié)果表明固定化脂肪酶具有良好的重復(fù)使用性,這是因?yàn)镕e3O4@PMMA/PAMAM與脂肪酶的相互作用減少了脂肪酶從載體上的脫落,也降低了脂肪酶在重復(fù)使用的過程中因構(gòu)象變化而引起的酶活性損失[29]。

a-重復(fù)使用性;b-貯存穩(wěn)定性

如圖11-b所示,隨著貯存時(shí)間的增長(zhǎng),固定化脂肪酶活力逐漸降低。在4 ℃下貯存30 d后,固定化脂肪酶仍能保留71.44%的酶活力。結(jié)果表明固定化脂肪酶有著良好的貯存穩(wěn)定性,主要原因是Fe3O4@PMMA/PAMAM與脂肪酶的相互作用增強(qiáng)了脂肪酶對(duì)構(gòu)象變化的抵抗能力,降低了脂肪酶因長(zhǎng)時(shí)間貯存而引起的酶活性損失[30]。

Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶活力為864 U/g,酶活力回收率為74.29%。將Fe3O4@PMMA/PAMAM用于固定化假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)的游離脂肪酶,所得的固定化脂肪酶具有良好的酶活力、穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶的這些優(yōu)點(diǎn)對(duì)于脂肪酶的廣泛實(shí)際應(yīng)用具有非常重要的意義,可以滿足各種行業(yè)的需求,如染料的去除、生物柴油的生產(chǎn)、動(dòng)力學(xué)拆分、酯類的合成等。

3 結(jié)論與討論

本文合成了樹枝狀大分子接枝的磁性聚合物微球Fe3O4@PMMA/PAMAM并用多種方式對(duì)其進(jìn)行表征,然后將Fe3O4@PMMA/PAMAM用于固定化發(fā)酵液中脂肪酶的研究,確定了最佳固定化工藝條件,即戊二醛用量為0.6 mL、固定化時(shí)間為5 h、固定化pH值為8.0、固定化溫度為35 ℃,固定化脂肪酶活力為864 U/g,酶活力回收率為74.29%。發(fā)酵液中的游離脂肪酶和固定化脂肪酶的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃,最適反應(yīng)pH值則分別為8.0和9.0,Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶能在更寬的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH范圍內(nèi)保持較高的酶活性。在50 ℃下熱處理5 h后,發(fā)酵液中的游離脂肪酶的剩余酶活力僅為15.48%,而固定化脂肪酶則保持了50.97%的酶活力。在pH值為9.0的PBS中處理5 h后,發(fā)酵液中的游離脂肪酶的剩余酶活性僅為34.25%,而固定化脂肪酶則保持了81.74%的酶活性。脂肪酶固定化到Fe3O4@PMMA/PAMAM上后,熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均顯著提高。重復(fù)使用10次后,固定化脂肪酶仍能維持72.23%的酶活力。在4 ℃下貯存30 d后,固定化脂肪酶仍能保留71.44%的酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶有著較高的酶活性、良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。因此,Fe3O4@PMMA/PAMAM將在未來生物催化領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景和巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>