1株非釀酒酵母2-苯乙醇合成規(guī)律及相關(guān)特性的初步研究

王琮杰,錢云開,閻賀靜,崔宗巖,石文琪,羅莉莎,肖艷霞,單超,葛超*

1(河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院,河北 秦皇島,066004)2(秦皇島海關(guān)技術(shù)中心,河北 秦皇島,066004)

非釀酒酵母是廣泛存在于葡萄園和釀造環(huán)境中的一類非常規(guī)酵母,常見的非釀酒酵母有美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)、戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)等[1]。大量研究表明,非釀酒酵母具有豐富的胞外酶,能夠產(chǎn)生大量酯類、高級醇和揮發(fā)酸等香氣化合物,也能降低乙醇含量并調(diào)節(jié)酸度及顏色,可為葡萄酒增香、改善品質(zhì)和提升風(fēng)味多樣性拓寬途徑[2-3]。非釀酒酵母通常具有較低的發(fā)酵性能和乙醇耐受性,難以單獨(dú)完成乙醇發(fā)酵。因此,葡萄酒釀造過程中廣泛采用非釀酒酵母和釀酒酵母的混合發(fā)酵用于改善葡萄酒的感官品質(zhì)。在混菌發(fā)酵過程中,非釀酒酵母與釀酒酵母間的交互作用影響代謝產(chǎn)物和微生物的生長,對于獲得葡萄酒所需性狀具有重要作用。因此,為控制和優(yōu)化混菌發(fā)酵,了解和掌握非釀酒酵母和釀酒酵母間的生理和代謝交互作用非常必要。

群體感應(yīng)是微生物界廣泛存在的細(xì)胞-細(xì)胞之間的通訊方式。許多真菌通過群體感應(yīng)的形式進(jìn)行交流,即通過分泌群體感應(yīng)信號分子(quorum sensing molecules,QSM)來溝通和協(xié)調(diào)群體行為[4-5]。很多真菌既可以單細(xì)胞酵母形態(tài)生長,也可以絲狀酵母形態(tài)生長[6-7]。這種二型態(tài)被認(rèn)為是一種古老的真菌特異性適應(yīng)行為[8]。群體感應(yīng)信號介導(dǎo)包括釀酒酵母在內(nèi)的非致病真菌和致病性真菌(如白色念珠菌等)的二型態(tài)轉(zhuǎn)變。作為白色念珠菌的主要QSM,法尼醇抑制酵母形態(tài)到菌絲形態(tài)的轉(zhuǎn)換,而酪醇則促進(jìn)白色念珠菌體由單細(xì)胞向多細(xì)胞菌絲的二型態(tài)轉(zhuǎn)變[9-10]。2-苯乙醇是釀酒酵母重要的QSM之一,由釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中通過Ehrlich途徑合成[11]。2-苯乙醇參與調(diào)節(jié)細(xì)胞密度和刺激假菌絲體的形成,外源添加2-苯乙醇也會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變和單倍體侵入生長[12-15]。2-苯乙醇還參與酵母菌生物被膜的形成[16]。有研究認(rèn)為作為酵母中樞碳代謝產(chǎn)物的2-苯乙醇等QSMs的合成反映了菌體代謝途徑通量,使酵母菌在不同環(huán)境條件下改變路徑優(yōu)化生長[17]。在氮源豐富條件下酵母菌經(jīng)莽草酸途徑合成少量2-苯乙醇,在氮源受限條件下,酵母通過Ehrlich途徑合成2-苯乙醇[18]。

目前發(fā)現(xiàn)有一些非釀酒酵母Hanseniasporauvarum、T.delbrueckii、M.pulcherrima、Starmerellabacillaris也能夠合成2-苯乙醇[19-20]。非釀酒酵母Kloeckeraapiculata不僅自身可以合成2-苯乙醇,而且6個(gè)與菌體成膜相關(guān)基因的表達(dá)也可被2-苯乙醇誘導(dǎo),并產(chǎn)生細(xì)胞間黏附形成生物膜[21]。有些非釀酒酵母如Candidazemplinina和Dekkerabruxellensis,沒有檢測到任何已知的QSM[19]。不同非釀酒酵母菌株合成QSM的種類和能力不同,具有種特異性[22]。目前人們對非釀酒酵母的QSM研究重視不足,對2-苯乙醇在非釀酒酵母中的合成規(guī)律和影響以及其所引發(fā)的群體感應(yīng)機(jī)制還不太清楚。因此,從性狀優(yōu)良的本土非釀酒酵母中篩選出可以合成2-苯乙醇的菌株,并進(jìn)一步研究2-苯乙醇在非釀酒酵母菌中的合成規(guī)律及作用將有助于對未來通過調(diào)節(jié)QSM來控制和優(yōu)化混菌發(fā)酵過程提供理論依據(jù)。

本研究從實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定的發(fā)酵性能優(yōu)良的非釀酒酵母中篩選出1株具有明顯二型態(tài)轉(zhuǎn)換的非釀酒酵母Mp-57。采用GC法驗(yàn)證了這株非釀酒酵母合成2-苯乙醇的能力,分析研究該菌株2-苯乙醇合成規(guī)律,并考察了外源添加2-苯乙醇對目標(biāo)菌活性、生物被膜形成及乙醇耐受力的影響。以期為未來研究混菌發(fā)酵中非釀酒酵母和釀酒酵母的交互作用,以及群體感應(yīng)機(jī)制提供菌株來源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為葡萄酒混菌發(fā)酵體系的定向調(diào)控拓展研究思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業(yè)釀酒酵母Ds(原產(chǎn)國:法國)、42株本土非釀酒酵母,河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,pH 6.0,121 ℃高壓滅菌20 min。

營養(yǎng)豐富(nutrient rich, NR)培養(yǎng)基:無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB)1.7 g/L,葡萄糖20 g/L,(NH4)2SO445.4 mmol/L,瓊脂20 g/L。

限制性培養(yǎng)基(minimal medium, MM):YNB 1.7 g/L,葡萄糖20 g/L,5 μmol/LL-脯氨酸。

酵母基礎(chǔ)(synthetic dropout,SD)培養(yǎng)基:YNB 1.7 g/L,(NH4)2SO437.8 mmol/L,葡萄糖20 g/L。

合成低銨葡萄糖(synthetic low-ammonium detrose,SLAD)培養(yǎng)基:4×YNB 6.8 g/L,(NH4)2SO450 μmol/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L。

2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無水乙醇,天津歐博凱化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A 氣相色譜儀,美國Agilent Technologies公司;BioSpec-mini 核酸蛋白分析儀,日本島津公司;EN PH pH計(jì),上海梅特勒-托利多儀器有限公司;BHC-1300IIA2 生物安全柜,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;BL-320S 分析天平,北京賽多利斯天平有限公司;HVE-50 高壓滅菌鍋,上海天呈科技有限公司;BGZ-246 電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;YCP-5 生化培養(yǎng)箱,長沙華曦電子科技有限公司;THZ-82B 氣浴恒溫振蕩器,江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;MultifugeX3R 高速冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技有限公司;QJD0025 酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司北京代表處。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 限氮條件下二型態(tài)轉(zhuǎn)換非釀酒酵母菌株的篩選

實(shí)驗(yàn)室篩選的非釀酒酵母試驗(yàn)菌株在YPD固體培養(yǎng)基上,28 ℃活化培養(yǎng)48 h,挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h,取活化菌懸液1 mL于9 mL蛋白胨生理鹽水中,搖勻,將其作為10-1稀釋濃度,依次稀釋至10-6,然后移取每個(gè)梯度稀釋菌懸液100 μL于SLAD固體平板上,涂布棒均勻涂抹,每組重復(fù)3次,28 ℃倒置培養(yǎng)。分別于7、14、21 d觀察菌落形態(tài)并拍照記錄。

1.3.2 非釀酒酵母Mp-57的2-苯乙醇合成鑒定

采用氣相色譜法進(jìn)行2-苯乙醇的鑒定。

樣品準(zhǔn)備:YPD培養(yǎng)基活化菌株,離心收集菌體,蒸餾水洗滌,MM液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)72 h,收集菌液凍存。

樣品預(yù)處理:取2 mL凍存液,10 000 r/min離心5 min除去菌泥,上清液用純水稀釋至合適倍數(shù),然后用0.22 μm的濾膜過濾即得待測液。

GC-FID色譜條件:色譜柱:Agilent DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm);載氣He(≥99.999%),流速為2 mL/min;H2流速35 mL/min;空氣流速400 mL/min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;檢測器溫度300 ℃;升溫程序:初始溫度80 ℃保持2 min,以20 ℃/min升溫至220 ℃保持3 min;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣,分流比10∶1,進(jìn)樣量1 μL。

1.3.3 非釀酒酵母菌Mp-57的2-苯乙醇合成規(guī)律研究

28 ℃,YPD培養(yǎng)基活化非釀酒酵母Mp-57和釀酒酵母Ds(對照),6 500 r/min離心收集菌泥,蒸餾水清洗后接種于MM培養(yǎng)基中,初始接種密度分別調(diào)整至4×103、4×105、4×107CFU/mL。然后28 ℃、120 r/min培養(yǎng)78 h,每隔6 h取樣,一部分樣品6 500 r/min離心10 min,上清液-20 ℃凍存,用于GC測定2-苯乙醇含量;另一部分樣品用血球計(jì)數(shù)板及美蘭染色法測定活細(xì)胞數(shù)。

樣品預(yù)處理:取2 mL凍存上清液,10 000 r/min離心5 min棄沉淀,上清液用純水稀釋至合適倍數(shù),然后用0.22 μm濾膜過濾即得GC法2-苯乙醇定量分析待測液。

GC法測定2-苯乙醇含量,測定條件同GC-FID條件。以標(biāo)準(zhǔn)2-苯乙醇溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。2-苯乙醇合成速率計(jì)算如公式(1)所示[20]:

(1)

式中:R2-苯乙醇,2-苯乙醇合成速率,fg/(cell·h);C2-苯乙醇,2-苯乙醇質(zhì)量濃度,mg/L;c,細(xì)胞濃度,cell/mL;t,時(shí)間,h。

1.3.4 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57及釀酒酵母Ds生長的影響

將Mp-57和Ds(對照)在YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃、120 r/min預(yù)培養(yǎng)24 h,分別以106CFU/mL的量接種至2組10 mL SD培養(yǎng)基中,一組添加2-苯乙醇至終濃度(質(zhì)量濃度)分別為5 μmol/L(0.6 mg/L)、50 μmol/L(6 mg/L)及500 μmol/L(60 mg/L),另一組添加相同體積水作對照,置于120 r/min的搖床中28 ℃培養(yǎng)72 h,通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)、測定OD600nm評價(jià)細(xì)胞生長情況。

1.3.5 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57及釀酒酵母Ds生物被膜形成能力的影響

為檢測2-苯乙醇對Mp-57和Ds生物被膜形成能力的影響,將Mp-57和Ds(對照)在YPD培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h,收集和清洗后用YPD重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為107CFU/mL,取20 μL 107CFU/mL的培養(yǎng)物,加入到每孔含有180 μL YPD培養(yǎng)基的96孔板中,處理孔中分別加入2-苯乙醇至終濃度5、50、500 μmol/L,空白對照組加入相同體積水,于28 ℃保溫培養(yǎng)72 h,每個(gè)處理重復(fù)4次。用200 μL PBS清洗2次去除游離細(xì)胞,之后用200 μL 0.4%(體積分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫(crystal violet,CV)溶液在室溫下染色45 min,PBS重復(fù)清洗4次后,每孔加入95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇200 μL,室溫處理45 min,輕微搖晃以洗脫CV。移取100 μL脫色液到另一塊96孔板中,使用酶標(biāo)儀測量OD630nm值。

1.3.6 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母菌Mp-57及釀酒酵母Ds乙醇耐受性的影響

將Mp-57和Ds(對照)在YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h,離心收集菌泥,蒸餾水洗滌2次后用YPD重懸,將菌體密度均調(diào)整至107CFU/mL,取相同濃度菌液1 mL離心,菌泥用YPD重懸,加入無水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為15%,混勻后再加入2-苯乙醇至終濃度分別為5、50、500 μmol/L,對照加入水,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于30、60、90 min取樣20 μL,稀釋相同倍數(shù)后,點(diǎn)接至YPD平板上,培養(yǎng)24 h后拍照記錄生長情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行基本數(shù)據(jù)處理,SPSS 26進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,Origin 2022進(jìn)行相關(guān)圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 限氮條件下二型態(tài)轉(zhuǎn)換非釀酒酵母菌株的篩選

氮是自發(fā)酵葡萄醪中微生物生長的主要限制性營養(yǎng)元素。釀酒酵母能根據(jù)環(huán)境營養(yǎng)供應(yīng)情況調(diào)整自身生長形態(tài)以適應(yīng)環(huán)境變化。在氮源受限時(shí),2-苯乙醇等QSM介導(dǎo)釀酒酵母由單細(xì)胞酵母形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻z狀形態(tài)生長。為研究非釀酒酵母的群體感應(yīng)機(jī)制,將前期實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定過的性狀優(yōu)良的非釀酒酵母菌株,分別接種到SLAD(限制氮源)和NR(豐富氮源)2種培養(yǎng)基上。觀察21 d培養(yǎng)期間平板菌落形態(tài)變化,篩選發(fā)現(xiàn)一株非釀酒酵母Mp-57(Mp-57 ID NO Z1392-30Metschnikowiaaff)為美極梅奇酵母,僅在SLAD平板上分化形成假菌絲。從圖1可以看到該菌株在NR平板上菌落邊緣一直保持光滑,無明顯變化;SLAD平板上7 d已分化形成明顯假菌絲,并隨時(shí)間延長形成向各個(gè)方向輻射的絨毛狀菌絲。

圖1 限制氮源平板篩選二型態(tài)轉(zhuǎn)換菌株

2.2 非釀酒酵母Mp-57的2-苯乙醇合成規(guī)律研究

2-苯乙醇在釀酒酵母菌二態(tài)型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。2-苯乙醇合成基因突變后,菌體不能形成假菌絲。添加2-苯乙醇,釀酒酵母重新分化形成假菌絲,恢復(fù)部分野生型表型[12]。利用SLAD平板篩選獲得一株具有二型態(tài)轉(zhuǎn)換的Mp-57。推測在相同自然環(huán)境中生存的Mp-57菌株也能合成2-苯乙醇,并誘導(dǎo)菌絲基因表達(dá),使菌體在氮源受限時(shí)發(fā)生二型態(tài)轉(zhuǎn)換[8]。采用GC法,以二型態(tài)轉(zhuǎn)換明顯的商業(yè)釀酒酵母菌株Ds為陽性對照,驗(yàn)證了非釀酒酵母Mp-57在限氮培養(yǎng)基中存在2-苯乙醇。

釀酒酵母2-苯乙醇合成與細(xì)胞密度相關(guān)[12, 23],高群體密度刺激芳香醇合成。由圖2結(jié)果可知,盡管生長曲線不同,Mp-57菌株2-苯乙醇合成的起始具有細(xì)胞密度依賴性。與Ds(對照)均在細(xì)胞密度達(dá)到107CFU/mL時(shí),開始檢測到2-苯乙醇。Ds菌株2-苯乙醇合成的細(xì)胞密度閾值與已報(bào)道的研究結(jié)果基本一致[23]。其次Mp-57上清液中2-苯乙醇含量隨細(xì)胞密度增加而增加,靜止期達(dá)到最大值,之后保持在較高水平。另外不同初始接種密度下,Mp-57菌株2-苯乙醇合成量始終顯著高于對照(圖3)。如高接種密度(4×107細(xì)胞/mL)下Mp-57菌株2-苯乙醇含量最大值為146 mg/L,是Ds菌株的4倍。表明Mp-57在限氮條件下,Ehrlich途徑非?；钴S,超過Ds。與GONZLEZ等[20]的研究認(rèn)為非釀酒酵母2-苯乙醇合成能力普遍低于釀酒酵母的結(jié)論不同。我們篩選的另一株庫德畢赤酵母H1的2-苯乙醇合成量也顯著低于Mp-57。即非釀酒酵母2-苯乙醇的合成有種屬特異性。

a-釀酒酵母Ds(對照);b-非釀酒酵母Mp-57

圖3 不同初始接種密度下Mp-57及Ds不同生長階段上清液2-苯乙醇含量

釀酒酵母菌體2-苯乙醇合成除受細(xì)胞密度影響以外,還受環(huán)境氮源水平影響。在菌體不同生長階段,隨著培養(yǎng)基氮源消耗,2-苯乙醇合成相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化,合成速率不斷改變[23]。為研究Mp-57菌株細(xì)胞內(nèi)2-苯乙醇合成能力變化規(guī)律,利用已測得的78 h培養(yǎng)過程中,不同取樣點(diǎn)活細(xì)胞數(shù)和2-苯乙醇含量,換算成2-苯乙醇合成速率并繪制變化曲線(圖4)。發(fā)現(xiàn)Mp-57的2-苯乙醇合成速率,在對數(shù)期不斷增加,對數(shù)期末期增至峰值,在進(jìn)入靜止期后迅速降低(圖4),盡管合成速率在不斷降低,但從總體上看靜止期培養(yǎng)液中2-苯乙醇累積含量持續(xù)保持在較高水平。菌體在靜止期2-苯乙醇合成速率的迅速降低,可能由于生長環(huán)境中營養(yǎng)缺乏,細(xì)胞整體代謝水平下降導(dǎo)致2-苯乙醇合成前體物苯丙氨酸不足所致[20]。

a-4×103細(xì)胞/mL;b-4×105細(xì)胞/mL;c-4×107細(xì)胞/mL

2.3 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57及釀酒酵母Ds菌株的影響

釀酒酵母合成分泌2-苯乙醇參與自身細(xì)胞生長、形態(tài)變化、生物被膜形成等生理過程[4]。進(jìn)化上同源的非釀酒酵母在混菌發(fā)酵體系中,是否也是利用2-苯乙醇調(diào)控上述生理過程尚不清楚,因此根據(jù)2.2節(jié)中Mp-57及Ds的2-苯乙醇含量測定結(jié)果,并參考以往2-苯乙醇對菌體影響的相關(guān)文獻(xiàn)[12,16],研究不同濃度2-苯乙醇對Mp-57及Ds發(fā)酵相關(guān)特性的影響。

2.3.1 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57菌株生長的影響

選用可以抑制內(nèi)源性2-苯乙醇合成的含有高濃度(NH4)2SO4的SD培養(yǎng)基[12],以各自未處理菌株為對照,用5、50、500 μmol/L 3種不同濃度2-苯乙醇分別處理Mp-57和Ds培養(yǎng)液,然后測定相同培養(yǎng)時(shí)長后菌體細(xì)胞量,以評價(jià)該化合物對Mp-57及Ds菌株生長的影響。從圖5可以看出,當(dāng)2-苯乙醇處理濃度為5 μmol/L時(shí),Mp-57和Ds菌體生長量與各自對照相比無明顯變化;當(dāng)處理濃度提高至50 μmol/L,Mp-57和Ds菌體量與各自對照相比分別增加了80%和62.5%;繼續(xù)增加2-苯乙醇濃度至500 μmol/L時(shí),Mp-57和Ds菌體量與各自對照相比分別下降了20%和25%,與國內(nèi)研究報(bào)道高濃度2-苯乙醇有細(xì)胞毒性的結(jié)論相符[24]。2-苯乙醇對2株菌生長的影響呈現(xiàn)相同的規(guī)律,即在50 μmol/L濃度時(shí)促進(jìn)菌體生長,500 μmol/L濃度時(shí)有細(xì)胞毒性,抑制菌體生長。此結(jié)果表明2-苯乙醇以劑量依賴方式影響Mp-57菌株和Ds菌株的生長,暗示作為已知釀酒酵母QSM的2-苯乙醇,也可能是Mp-57的信號分子,而且在菌體不同生長階段下發(fā)揮不同的生理效應(yīng)。目前已有研究利用2-苯乙醇對釀酒酵母菌生長的抑制作用,通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2-苯乙醇降低菌體生物量來提高目的物乙醇產(chǎn)量[25]。

圖5 外源添加2-苯乙醇對Mp-57及Ds生長的影響

2.3.2 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57生物被膜形成能力的影響

生物被膜是一種微生物群落形式,微生物通過形成生物被膜這種群落結(jié)構(gòu),可以更好地適應(yīng)高滲透壓、熱休克、氧化應(yīng)激和營養(yǎng)缺乏等不利環(huán)境條件[26]。群體感應(yīng)參與調(diào)節(jié)真菌的許多種群水平行為,如致病/毒力和生物被膜形成[5,10,27-28]。研究顯示酵母細(xì)胞形成生物被膜,有助于提高固定化發(fā)酵產(chǎn)品乙醇含量[29],也有利于生物膜反應(yīng)器中進(jìn)行的工業(yè)發(fā)酵[30]。如圖6所示,5 μmol/L的2-苯乙醇對2株菌生物被膜形成均無顯著影響;50 μmol/L的2-苯乙醇促進(jìn)Mp-57菌株形成生物被膜,與自身未處理菌株相比,Mp-57在處理后,成膜能力提高28.7%。測定Ds成膜情況時(shí)發(fā)現(xiàn)50 μmol/L的2-苯乙醇顯著抑制Ds成膜。當(dāng)處理濃度提高至500 μmol/L時(shí),2-苯乙醇對Mp-57和Ds兩株菌生物被膜的形成抑制率分別為38%和44.3%。從圖6中明顯也可以看出,即使在未添加2-苯乙醇的條件下,Mp-57成膜能力也顯著高于Ds。表明Mp-57未來在生物膜固定化混菌發(fā)酵中可能有著良好的應(yīng)用前景。

圖6 外源添加2-苯乙醇對Mp-57及Ds生物被膜形成能力的影響

2.3.3 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57乙醇耐受性的影響

在前面研究中發(fā)現(xiàn),不同濃度2-苯乙醇對Mp-57和Ds生長及生物被膜形成產(chǎn)生不同影響,這些性狀變化與菌體對抗不良環(huán)境耐受力相關(guān)。因此為評價(jià)2-苯乙醇是否會提高M(jìn)p-57和Ds對乙醇的耐受性。參照文獻(xiàn)[31]中的方法,采用5、50、500 μmol/L 3種不同濃度的2-苯乙醇處理含有15%(體積分?jǐn)?shù))乙醇的Mp-57及Ds菌體培養(yǎng)液,對照與處理組完全相同,僅未添加2-苯乙醇。結(jié)果見圖7。

圖7 外源添加2-苯乙醇對Mp-57及Ds乙醇耐受性的影響

從2-苯乙醇添加量為0的對照平板菌落可以看出,15%(體積分?jǐn)?shù))乙醇處理不同時(shí)間,釀酒酵母Ds殘余菌落密度無明顯變化,表現(xiàn)出很高的乙醇耐受性;與釀酒酵母Ds相比,Mp-57在乙醇脅迫90 min后,菌落密度明顯降低,表明Mp-57的乙醇耐受性低于釀酒酵母Ds,這與美極梅奇酵母具有較低乙醇耐受性的研究報(bào)道相符[32]。觀察Mp-57和Ds在添加50 μmol/L的2-苯乙醇后,乙醇脅迫30、60、90 min后取樣涂板培養(yǎng)相同時(shí)間,平板上殘余菌落密度與各自對照相比均明顯增加。表明50 μmol/L的2-苯乙醇可以提高M(jìn)p-57和Ds菌株對15%(體積分?jǐn)?shù))乙醇耐受性。這可能是由于該濃度的2-苯乙醇能顯著促進(jìn)2株菌生長的原因。5 μmol/L的2-苯乙醇對2株菌生長沒有顯著影響,所以添加此濃度的2-苯乙醇后殘余菌落密度,與相應(yīng)對照比較無明顯變化。500 μmol/L的2-苯乙醇顯著抑制Mp-57和Ds的生長,但添加此濃度2-苯乙醇后,2株菌與同樣受乙醇脅迫的相應(yīng)對照相比,菌落密度變化不明顯,可能由于實(shí)驗(yàn)初始菌體濃度較高,因而一定程度上會削弱2-苯乙醇抑制效果。

3 結(jié)論

本研究從實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定的非釀酒酵母中,篩選出1株具有二型態(tài)轉(zhuǎn)換的非釀酒酵母Mp-57。GC法鑒定出Mp-57能合成2-苯乙醇。測定并分析Mp-57菌株2-苯乙醇合成規(guī)律,發(fā)現(xiàn)2-苯乙醇合成起始具有細(xì)胞密度依賴性。其次,發(fā)現(xiàn)2-苯乙醇合成速率變化曲線呈鐘形,即開始時(shí)合成速率隨著培養(yǎng)時(shí)間延長不斷增加,對數(shù)期末期達(dá)到最大值,然后迅速降低。這種合成速率變化導(dǎo)致上清液中2-苯乙醇合成量從開始不斷增加,到靜止期末期達(dá)到高峰并維持在高含量水平。不同于以往研究認(rèn)為釀酒酵母2-苯乙醇合成能力更強(qiáng),篩選到的二型態(tài)轉(zhuǎn)換明顯的Mp-57菌株,其2-苯乙醇合成能力更強(qiáng),其總合成量顯著高于釀酒酵母Ds。最后,我們還考察了外源添加2-苯乙醇對Mp-57及Ds菌株發(fā)酵相關(guān)性狀的影響,發(fā)現(xiàn)2-苯乙醇類似信號分子,以劑量依賴方式影響菌體生長、成膜及乙醇耐受性。本文對混菌發(fā)酵體系中由2-苯乙醇引發(fā)的酵母間代謝交互作用和風(fēng)味物質(zhì)的修飾研究具有重要理論意義,并為定向調(diào)控混菌發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。