谷氨酸棒桿菌人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)文庫的建立與應(yīng)用

張悅,張繼偉,吳碩,徐寧,劉君,魏亮*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)2(中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津,300308)3(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津,300457)

合成生物學(xué)是在工程學(xué)的指導(dǎo)下,通過生物元器件的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)和構(gòu)建,對生物體進(jìn)行有目標(biāo)的重設(shè)計(jì)和改造,以解決醫(yī)藥、環(huán)境、材料和能源等國計(jì)民生的重大問題[1-2]。在生物體重設(shè)計(jì)過程中,基因的精細(xì)表達(dá)調(diào)控是影響合成生物體構(gòu)建的關(guān)鍵因素。因此,開發(fā)設(shè)計(jì)有效的生物控制元件是合成生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site, RBS)是指起始密碼子ATG上游的一段富含嘌呤的非翻譯區(qū)[3],又叫SD(Shine-Dalgarno)序列,是控制翻譯起始和蛋白質(zhì)表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,利用RBS工程對目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控,優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑通量,構(gòu)建具有高效生產(chǎn)能力的細(xì)胞工廠,已經(jīng)逐漸成為合成生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種從土壤中分離的形態(tài)為短桿棒狀,無芽孢的兼性好氧型的革蘭氏陽性細(xì)菌,是公認(rèn)的安全食品級菌株[4]。隨著對谷氨酸棒桿菌研究的不斷深入,谷氨酸棒狀桿菌已經(jīng)發(fā)展成為重要的工業(yè)底盤菌,廣泛用于L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸等氨基酸[5],以及有機(jī)酸[6]、高級醇[7]和多聚物[8]的工業(yè)化生產(chǎn)中,其中L-谷氨酸和L-賴氨酸年產(chǎn)超過200萬t[9]。近年來,谷氨酸棒桿菌也被開發(fā)用于蝦青素等天然產(chǎn)物[10]合成過程中。在構(gòu)建細(xì)胞工廠的過程中,往往需要對代謝途徑進(jìn)行精細(xì)和定量調(diào)控,以提高目的產(chǎn)物的合成效率,因此關(guān)于谷氨酸棒桿菌基因表達(dá)調(diào)控工具的研究也越來越受到關(guān)注。在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室通過設(shè)計(jì)人工隨機(jī)序列,構(gòu)建了合成啟動子文庫,并應(yīng)用于L-蘇氨酸合成途徑的表達(dá)調(diào)控[11]。然而目前,關(guān)于谷氨酸棒桿菌RBS元件文庫的報(bào)道仍然較少。WEI等[12]利用RBS元件文庫優(yōu)化策略,在谷氨酸棒桿菌中重建和優(yōu)化了甘油利用途徑,顯著提升了工程菌株的甘油利用能力。WANG等[13]利用基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的堿基編輯技術(shù),在谷氨酸棒桿菌中建立了RBS原位調(diào)控方法,并先后對木糖代謝途徑和番茄紅素合成途徑的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,大幅提升了木糖的攝取速率和番茄紅素產(chǎn)量。ZHANG等[14]以谷氨酸棒桿菌通用的SD序列構(gòu)建了RBS文庫,優(yōu)化了莽草酸合成途徑aroGBDE基因的表達(dá)水平,提升了莽草酸的產(chǎn)量。然而該研究采用低通量平板篩選方法,構(gòu)建的RBS文庫調(diào)控范圍較窄,調(diào)節(jié)豐度較低,不利于谷氨酸棒桿菌基因的精細(xì)表達(dá)調(diào)控。因此,本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了人工RBS文庫,通過偶聯(lián)流式細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting,FACS)技術(shù)對RBS文庫進(jìn)行高通量篩選,獲得了一個調(diào)控范圍寬,覆蓋范圍均勻的人工RBS文庫。利用人工RBS文庫對L-高絲氨酸合成途徑的基因進(jìn)行精細(xì)調(diào)控,提高了L-高絲氨酸的合成能力,為谷氨酸棒桿菌中基因的表達(dá)調(diào)控提供了重要研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α用于質(zhì)粒構(gòu)建,由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所保藏。C.glutamicumATCC 13032菌株由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所保藏。谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒pEC-XK99E用于RBS評價(jià)和篩選,由本實(shí)驗(yàn)室保藏。本研究所用菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用質(zhì)粒與菌株

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5.0,胰蛋白胨10.0,NaCl 10.0[固體培養(yǎng)基加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的瓊脂粉];硫酸卡那霉素(kanamycin)終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。主要用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

LBHIS培養(yǎng)基(g/L):酵母粉2.5,胰蛋白胨5.0,NaCl 5.0,腦心浸液1.85,山梨醇9.1(固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂粉);Kanamycin終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。主要用于谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)基(g/L):玉米漿30,尿素5,(NH4)2SO45,KH2PO41,MgSO40.5,葡萄糖25,蘇氨酸0.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米漿60,FeSO4-檸檬酸鹽溶液0.55 mL/L(FeSO4·7H2O 20 g/L,檸檬酸18.14 g/L),(NH4)2SO440,KH2PO40.25,MgSO40.5,H3PO4(85%) 0.225 mL/L,維生素溶液7 mL/L(生物素300 mg/L,維生素B1500 mg/L,泛酸鈣鹽2 g/L,煙酰胺600 mg/L),乙酸鉀0.5,葡萄糖70,蘇氨酸0.4,CaCO320。

1.1.3 試劑

Phusion DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶DpnI、限制性內(nèi)切酶FastDigestEco31 I、T4 DNA連接酶、蛋白Marker,Thermo Fisher公司;0.1% BSA,NEB公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒,天根生物公司;卡那霉素,索萊寶生物科技有限公司;其他試劑如3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、可溶性淀粉、NaOH、苯酚、Na2SO3、葡萄糖、冰醋酸、鹽酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

Synergy NEO2多功能酶標(biāo)儀,美國Biotek公司;搖床,美國精騏公司;Scientz-IID超聲破碎儀,寧波新芝公司;高速冷凍離心機(jī),德國Eppendoff公司;MoFlo XDP貝克曼分選型流式細(xì)胞儀,美國Beckman公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 谷氨酸棒桿菌人工RBS文庫的構(gòu)建

本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的谷氨酸棒桿菌通用的SD序列AAAGGA,設(shè)計(jì)了AAAGGA(N)7-8的RBS隨機(jī)序列,使SD序列距離起始密碼子7或8 bp。設(shè)計(jì)隨機(jī)引物,該引物包含BsaI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)、RBS隨機(jī)序列以及報(bào)告基因gfp(green fluorescent protein, GFP)上游引物序列。引物序列具體為CCAGGTCTCAGAGCAAAGGANNNNNNN(N)ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAG。采用Phusion DNA聚合酶,以gfp基因?yàn)槟０?通過PCR方法獲得含有人工RBS序列的gfp基因片段,利用Golden Gate DNA組裝方法,將gfp基因片段整合連接至質(zhì)粒pEC-XK99E上,轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)中,涂布于含100 μg/mL kanamycin的LB平板上,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。收集平板上的所有菌落,提取質(zhì)粒,構(gòu)建谷氨酸棒桿菌人工RBS序列文庫。

1.2.2 RBS文庫的高通量篩選

將構(gòu)建的RBS文庫質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到C.glutamicumATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞中,涂布到含50 μg/mL kanamycin LBHIS的平板上,在30 ℃下培養(yǎng)24 h。用PBS(pH 7.5)沖洗平板上的細(xì)胞,取2 mL的菌液,按照1%(體積分?jǐn)?shù),下同)的接種量轉(zhuǎn)接到LBHIS液體培養(yǎng)基中,30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。隨后收取2 mL菌液,用PBS洗滌菌體,重復(fù)2次,將菌液濃度稀釋至OD600=0.1。將制備的樣品振蕩混勻5 min,使用MoFlo XDP流式細(xì)胞儀對樣品細(xì)胞進(jìn)行篩選,激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm,檢測GFP熒光變化強(qiáng)度。為保證細(xì)胞陽性率,本研究采用純化模式對RBS文庫細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選。將FACS技術(shù)分選出的細(xì)胞置于LBHIS的平板上,30 ℃搖床培養(yǎng)24 h。挑取平板上的細(xì)胞到含有600 μL LBHIS培養(yǎng)基的96深孔板中,采用多功能酶標(biāo)儀檢測GFP熒光強(qiáng)度變化,激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長520 nm。相對熒光強(qiáng)度(relative fluorescence unit, RFU)的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

隨后將分離的含有不同強(qiáng)度的GFP熒光的菌株,置于含有5 mL LBHIS培養(yǎng)基的試管中,進(jìn)一步評價(jià)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.2.3 人工RBS文庫調(diào)控強(qiáng)度表征

1.2.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建

本研究利用α-淀粉酶(1,4-α-D-glucan-glucanohydrolase, α-amyE)進(jìn)一步測試人工RBS文庫的調(diào)控強(qiáng)度。從人工RBS文庫中挑選不同強(qiáng)度的RBS元件,嵌入到α-淀粉酶基因amyE上游引物上,采用Phusion DNA聚合酶,以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)基因組為模板,通過PCR方法獲得包含不同RBS元件的amyE基因片段。利用Golden Gate方法,將含有不同RBS序列的amyE基因片段連接至載體pEC-XK99E上。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入C.glutamicumATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞中,構(gòu)建含有不同強(qiáng)度的RBS序列的α-淀粉酶菌株。

1.2.3.2 α-淀粉酶的酶活測定

本研究采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitro-2-hydroxybenzoic acid, DNS)比色法測定還原糖含量來反映α-淀粉酶的酶活力[15]。挑取上述構(gòu)建的含有不同強(qiáng)度的RBS序列的α-淀粉酶菌株,接種到含有50 μg/mL kanamycin的5 mL的LBHIS液體培養(yǎng)基中,過夜活化培養(yǎng)。按照1%的接種量轉(zhuǎn)接到LBHIS液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集菌液,加入裂解緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4,200 mmol/L NaCl,pH 7.5)重懸,調(diào)節(jié)OD600至10,冰水浴超聲破碎處理20 min,隨后在4 ℃、6 000 r/min離心10 min,收集上清液。

反應(yīng)混合液包括:50 μL粗酶液,450 μL 20 mmol/L醋酸鈉Buffer B(0.02 mol/L NaAC固體,0.2 mL/L冰醋酸,pH 5.5),500 μL 10 g/L可溶性淀粉(溶于醋酸鈉Buffer B,現(xiàn)配現(xiàn)用)。將裝有反應(yīng)混合液的試管放置在60 ℃的水浴鍋,準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后,加入3滴0.5 mol/L HCl,中斷反應(yīng),然后加入1.0 mL DNS試劑(0.87 mol/L酒石酸鉀鈉,0.03 mol/L DNS,0.52 mol/L NaOH,0.06 mol/L苯酚,0.04 mol/L Na2SO3),在90 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min,冰浴后冷卻至室溫,測定540 nm處的吸光值。α-淀粉酶的酶活單位定義為:在60 ℃條件下,1 min釋放1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

1.2.4 利用人工RBS文庫精細(xì)調(diào)控L-高絲氨酸生物合成途徑

本研究基于人工RBS文庫對L-高絲氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵模塊進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。天冬氨酸激酶(aspartate kinase, LysC)和高絲氨酸脫氫酶(homoserine dehydrogenase, Hom)是L-高絲氨酸生物合成途徑的2個關(guān)鍵酶。為移除關(guān)鍵酶LysC和Hom的反饋抑制,本研究分別引入點(diǎn)突變LysCT311I和HomG378E,并從人工RBS文庫中挑選3個不同強(qiáng)度的RBS元件,分別調(diào)控LysCr和Homr的表達(dá)。將RBS元件序列分別嵌合到lysC和hom基因上游引物上,以C.glutamicum基因組為模板,通過PCR方法獲得含有不同RBS元件序列的lysC和hom基因DNA片段。通過用Golden Gate方法,將lysC和hom基因片段兩兩組合,連接到載體pEC-XK99E上,將上述構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至菌株CgH1中,構(gòu)建L-高絲氨酸合成菌株。

1.2.5L-高絲氨酸的發(fā)酵

挑取上述構(gòu)建的高絲氨酸合成菌株,于LBHIS液體培養(yǎng)基中,30 ℃過夜活化培養(yǎng)。按照1%的接種量,接種到種子培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。隨后以初始OD600=10,接種到含有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,30 ℃、200 r/min進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),每24 h取樣,使用分光光度計(jì)測定菌株的生長情況OD600,使用HPLC測定發(fā)酵液中L-高絲氨酸的含量[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酸棒桿菌人工RBS文庫的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

研究表明,谷氨酸棒桿菌16S rRNA 3′末端的anti-Shine-Dalgarno序列為AAAGGAGG,被認(rèn)為是通用RBS的保守序列。在谷氨酸棒桿菌中,RBS元件和起始密碼子之間的距離大概是5～10 bp[17]。而ZHANG等[14]通過對RBS序列隨機(jī)篩選,發(fā)現(xiàn)有效RBS元件的保守序列AAAGG與起始密碼子之間的距離大多數(shù)為7～8 bp。基于上述結(jié)果,本研究設(shè)計(jì)了谷氨酸棒桿菌人工RBS隨機(jī)序列為AAAGGA(N)7-8,其中AAAGGA為RBS元件的保守序列,為保證篩選效率,AAAGGA與起始密碼子的距離設(shè)定為7～8 bp,如圖1-a所示。將設(shè)計(jì)的人工RBS序列嵌合到報(bào)告基因gfp上游引物上,設(shè)計(jì)隨機(jī)引物。以gfp基因?yàn)槟０?通過使用設(shè)計(jì)的隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得含有隨機(jī)RBS元件的gfp序列,采用Golden Gate的方法,將gfp片段插入到載體pEC-XK99E上,構(gòu)建質(zhì)粒文庫(圖1-b)。將質(zhì)粒文庫電轉(zhuǎn)至C.glutamicumATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞中,建立谷氨酸棒桿菌人工RBS文庫。通過隨機(jī)引物設(shè)計(jì),人工RBS文庫的理論庫容量為6.6×104。因此,本研究共挑選了大約105個克隆,保證RBS文庫的100%覆蓋。

a-人工RBS文庫設(shè)計(jì)策略;b-人工RBS文庫的構(gòu)建;c-高通量篩選方法的建立

2.2 人工RBS文庫的高通量篩選

本研究利用兩步篩選法對人工RBS文庫進(jìn)行高通量篩選(圖1-c)。流式細(xì)胞技術(shù)是比較先進(jìn)的單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù),能夠根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和熒光信號,快速準(zhǔn)確地完成細(xì)胞性狀分析和分選工作,大大加快了菌株篩選進(jìn)程。因此,本研究為加快篩選效率,首先利用流式細(xì)胞技術(shù)對人工RBS文庫進(jìn)行評價(jià)和分選。以谷氨酸棒桿菌常用的RBS元件AAAGGAGGTTGTC(CK1)和AAAGGAGGACAACC(CK2)為陽性對照,分別選擇RBS文庫中細(xì)胞熒光強(qiáng)度前1%和前0.04%的細(xì)胞(圖2-a)。經(jīng)過多輪篩選,共篩選獲得10 000個克隆,置于LBHIS瓊脂平板上30 ℃培養(yǎng)48 h。為了驗(yàn)證高通量篩選效率,從平板上挑選3個具有不同熒光強(qiáng)度的菌株,利用流式細(xì)胞儀對菌株熒光強(qiáng)度進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果如圖2-b所示,篩選的菌株熒光強(qiáng)度均顯著高于對照組CK1,說明基于流式細(xì)胞技術(shù)的高通量篩選方法具有較好的篩選效率。隨后本研究利用96孔板篩選法對RBS文庫進(jìn)行再次篩選和評價(jià)。挑取篩選的平板菌落,置于含有LBHIS培養(yǎng)基的96孔板中,30 ℃培養(yǎng)18 h,采用多功能酶標(biāo)儀對培養(yǎng)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。結(jié)果表明,通過兩步篩選方法構(gòu)建的人工RBS文庫,調(diào)控范圍廣,調(diào)控強(qiáng)度分布均勻,熒光強(qiáng)度從3×103～105a.u.,具有較好的調(diào)節(jié)強(qiáng)度多樣性(圖2-c)。

a-利用流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選人工RBS文庫(R1為流式細(xì)胞分選框);b-流式細(xì)胞分析驗(yàn)證高通量篩選結(jié)果的可靠性;c-利用96孔篩選技術(shù)對人工RBS文庫進(jìn)行復(fù)篩

2.3 人工RBS文庫的評估與表征

為評估人工RBS元件的穩(wěn)定性,本研究根據(jù)熒光強(qiáng)度,從構(gòu)建的人工RBS文庫中挑選了37個RBS元件進(jìn)行放大驗(yàn)證。所選37個RBS序列見表2。將選擇的含有不同RBS元件的菌株,接種于含有5 mLLBHIS培養(yǎng)基的試管中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。隨后采用多功能酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖3-a所示,選擇的RBS元件在放大培養(yǎng)條件下,其熒光強(qiáng)度變化趨勢與96孔板的測定結(jié)果基本一致,說明構(gòu)建的人工RBS元件文庫具有較高的穩(wěn)定性。選擇的RBS元件調(diào)控范圍廣,最高熒光強(qiáng)度為105 508 a.u.,是對照的8.55倍,最低熒光強(qiáng)度為3 633 a.u.,是對照的0.29倍,調(diào)控幅度為29.04倍。根據(jù)熒光強(qiáng)度不同,將RBS文庫分為3類,高強(qiáng)度RBS(熒光強(qiáng)度>80 000),中強(qiáng)度RBS(熒光強(qiáng)度為80 000～40 000),低強(qiáng)度RBS(熒光強(qiáng)度<40 000)。

a-人工RBS文庫穩(wěn)定性測試;b-α-淀粉酶表達(dá)系統(tǒng)的建立;c-利用α-淀粉酶表達(dá)系統(tǒng)評估人工RBS文庫的通用性

表2 37個RBS序列及相對強(qiáng)度

為進(jìn)一步驗(yàn)證人工RBS文庫的通用性,本研究利用α-淀粉酶表達(dá)系統(tǒng)對RBS元件文庫進(jìn)行評估(圖3-b)。分別從3個不同強(qiáng)度的RBS文庫中各挑選2個序列,連接至α-淀粉酶上游,調(diào)控α-淀粉酶的表達(dá)。將上述構(gòu)建的不同RBS序列和α-淀粉酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中,于LBHIS培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,測定α-淀粉酶的酶活性。結(jié)果如圖3-c所示,含有高強(qiáng)度RBS元件菌株表現(xiàn)出較高的α-淀粉酶活性,含有低強(qiáng)度RBS元件菌株表現(xiàn)出較低的α-淀粉酶活性,與GFP熒光強(qiáng)度具有較高的一致性。其中含有高強(qiáng)度RBS元件37-amyE菌株的α-淀粉酶活性為3.00 U/mg,是對照的4.43倍,含有低強(qiáng)度RBS元件4-amyE菌株的α-淀粉酶活性為0.70 U/mg,是對照的1.04倍。上述結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的人工RBS元件文庫具有較寬的調(diào)控范圍,較好的穩(wěn)定性和通用性,為谷氨酸棒桿菌代謝改造和基因表達(dá)調(diào)控提供了多樣性的系列調(diào)控元件。

2.4 利用人工RBS文庫調(diào)控L-高絲氨酸的生物合成途徑

L-高絲氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸[17],在食品、飼料、化工和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。L-高絲氨酸是合成蘇氨酸等天冬氨酸家族氨基酸的重要前體物質(zhì),具有重要的生理功能,也是一種重要的化工原料,用于L-草銨膦[18]和γ-丁內(nèi)酯[19]的生產(chǎn)。近年來,隨著L-高絲氨酸需求量的逐漸增大,利用環(huán)境友好的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-高絲氨酸受到廣泛關(guān)注。在構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的過程中,對代謝途徑通量的平衡調(diào)控是影響目標(biāo)產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因素。研究表明,天冬氨酸激酶(aspartate kinase, LysC)和高絲氨酸脫氫酶(homoserine dehydrogenase, Hom)是谷氨酸棒桿菌中L-高絲氨酸生物合成途徑的2個關(guān)鍵酶。因此,本研究利用人工RBS文庫精細(xì)調(diào)控L-高絲氨酸生物合成途徑中關(guān)鍵酶LysCr和Homr的表達(dá),平衡代謝途徑通量,提高L-高絲氨酸合成能力。

本研究從構(gòu)建的人工RBS元件文庫選擇了3個具有不同強(qiáng)度的RBS序列,即高強(qiáng)度RBS-37、中強(qiáng)度RBS-20、低強(qiáng)度RBS-4。將3個具有不同強(qiáng)度的RBS元件分別置于基因lysC和hom的上游,構(gòu)建含有不同強(qiáng)度RBS的基因表達(dá)元件。將獲得的lysC和hom基因表達(dá)元件通過Golden Gate方法,連接至pEC-XK99E上。通過排列組合方法,構(gòu)建了9個含有l(wèi)ysC和hom基因的表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌CgH1菌株中,構(gòu)建系列L-高絲氨酸合成菌株(圖4-b)。

a-L-高絲氨酸生物合成途徑;b-利用人工RBS文庫精細(xì)調(diào)控關(guān)鍵酶LysC和Hom表達(dá)示意圖

按照1.2.6節(jié)所述方法,以CgH1包含空質(zhì)粒為對照,對構(gòu)建的L-高絲氨酸合成菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,測定LysCr和Homr組合表達(dá)對L-高絲氨酸產(chǎn)量的影響。如圖5所示,與對照菌株相比,1號菌株生長略低于對照菌株,而其他菌株生長與對照基本相當(dāng)。相比之下,各菌株的L-高絲氨酸合成能力存在明顯差異,其中4號菌株表現(xiàn)出最高的L-高絲氨酸合成能力,L-高絲氨酸產(chǎn)量到達(dá)12.7 g/L,比野生型菌株高絲氨酸含量(3.5 g/L)提高了3.6倍。而低表達(dá)LysCr和Homr的菌株,其高絲氨酸含量最低,僅為5.7 g/L。結(jié)果表明,精細(xì)調(diào)控關(guān)鍵酶LysCr和Homr的表達(dá),能有效平衡代謝途徑通量,提升L-高絲氨酸的合成能力。而本研究構(gòu)建的人工RBS文庫為谷氨酸棒桿菌中基因的表達(dá)調(diào)控提供了有力工具。

a-L-高絲氨酸合成菌株的生長情況;b-L-高絲氨酸產(chǎn)量

3 結(jié)論

本研究基于谷氨酸棒桿菌RBS序列的基本特征,設(shè)計(jì)構(gòu)建了一個隨機(jī)RBS文庫。以GFP為報(bào)告基因,偶聯(lián)FACS技術(shù)和96孔板篩選技術(shù),對隨機(jī)RBS文庫進(jìn)行高通量篩選,成功構(gòu)建了調(diào)控范圍廣,覆蓋范圍均勻的人工RBS元件文庫,調(diào)控范圍達(dá)到29.04倍。通過α-淀粉酶活力測試和表征,驗(yàn)證了人工RBS文庫具有較高的穩(wěn)定性和通用性。隨后本研究將人工RBS文庫應(yīng)用于L-高絲氨酸代謝途徑的調(diào)控優(yōu)化。利用具有不同強(qiáng)度的RBS元件對L-高絲氨酸合成途徑關(guān)鍵酶LysCr和Homr進(jìn)行精細(xì)表達(dá)調(diào)控,獲得了具有高效L-高絲氨酸合成能力的最佳組合,平衡了代謝途徑通量,提高了L-高絲氨酸產(chǎn)量。與之前的研究相比,本研究建立的RBS文庫調(diào)節(jié)寬度大,調(diào)控強(qiáng)度范圍廣,具有較好的普適性,能夠“即插即用”,可直接對代謝途徑中各個基因進(jìn)行精細(xì)表達(dá)調(diào)控,為谷氨酸棒桿菌代謝改造和基因精細(xì)表達(dá)調(diào)控提供了有力工具。在下一步研究中,我們將利用不同強(qiáng)度的啟動子庫與RBS元件文庫進(jìn)行組合,建立具有不同強(qiáng)度的精細(xì)調(diào)控工具,并應(yīng)用于其他生物合成代謝途徑的精細(xì)調(diào)控研究。