枯草芽胞桿菌重組表達(dá)的Pantoea dispersa UQ68J蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的研究

趙文沖,吳敬,張康*,陳晟*

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

異麥芽酮糖(isomaltulose),俗稱帕拉金糖,分子式為C12H22O11,由葡萄糖分子和果糖分子以α-1,6鍵連接而成,是蔗糖(α-1,2鍵)的同分異構(gòu)體[1]。異麥芽酮糖有著與蔗糖相似的外觀和口感,甜度只有蔗糖的一半[2]。異麥芽酮糖不被大多數(shù)微生物分解利用,因此它能夠防治齲齒;異麥芽酮糖被食用后,不會(huì)在口腔和胃中被分解消化,而是在小腸內(nèi)被蔗糖酶和異麥芽糖酶緩慢水解為單糖,然后被吸收利用,因而它具有提神抗疲勞、不致腹瀉、不刺激血糖迅速升高、加速脂肪代謝等優(yōu)點(diǎn)[3]。美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)將異麥芽酮糖列為公認(rèn)安全食品(generally recognized as safe,GRAS),在歐洲日本等地區(qū)異麥芽酮糖也已被用作蔗糖代替品而廣泛使用[4]。作為一種新型的功能糖,異麥芽酮糖在食品領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

異麥芽酮糖天然存在于蜂蜜、甘蔗等食物中,但含量較低,提取困難,不能滿足異麥芽酮糖龐大的市場(chǎng)需求量。因此,如何高效制備異麥芽酮糖成為了研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。目前異麥芽酮糖的制備方法有化學(xué)合成法、植物轉(zhuǎn)基因法、微生物轉(zhuǎn)化法、酶轉(zhuǎn)化法。化學(xué)合成法制備異麥芽酮糖反應(yīng)困難且成本較高,植物轉(zhuǎn)基因法制備異麥芽酮糖會(huì)嚴(yán)重影響植物自身生長發(fā)育[5],微生物轉(zhuǎn)化法制備異麥芽酮糖受到微生物細(xì)胞活力以及底物濃度的限制,酶轉(zhuǎn)化法一般沒有上述問題,因而是制備異麥芽酮糖的主要方法。蔗糖異構(gòu)酶(sucrose isomerase,SIase,SI,EC.5.4.99.11)是酶法制備異麥芽酮糖所使用的酶,主要來源于微生物,它可以將蔗糖異構(gòu)為異麥芽酮糖,同時(shí)水解生成一定量的單糖[6]。吳琦等[7]將Klebsiellasp.LX3蔗糖異構(gòu)酶在解脂耶氏酵母中進(jìn)行表面展示,其轉(zhuǎn)化蔗糖時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率為77%;LI等[8]將ErwiniarhaponticiNX-5來源的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中表達(dá)后制備異麥芽酮糖,其產(chǎn)率可達(dá)87%;程勝等[9]將SerratiaplymuthicaAS9蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中重組表達(dá)后制備異麥芽酮糖,異麥芽酮糖產(chǎn)率最高可達(dá)87.9%;WU等[10]將PantoeadispersaUQ68J來源的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中表達(dá)后制備異麥芽酮糖,產(chǎn)率可達(dá)91%。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種革蘭氏陽性菌,遺傳背景清晰,不含內(nèi)毒素,無致病性,FDA將其列為公認(rèn)安全微生物?？莶菅挎邨U菌有著優(yōu)秀的胞外分泌蛋白能力,它可以將目的蛋白釋放到胞外上清液中,便于產(chǎn)物的分離純化,降低生產(chǎn)成本[11]?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)酶制劑生產(chǎn)的常用宿主,多種外源蛋白如α-淀粉酶[12]、脂肪酶[13]、普魯蘭酶[14]、β-葡萄糖苷酶[15]等都已成功地在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)。異麥芽酮糖作為一種食品甜味劑,有必要在食品安全級(jí)微生物中表達(dá),因此本研究將P.dispersaUQ68J蔗糖異構(gòu)酶在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá),對(duì)重組蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行純化并測(cè)定了酶學(xué)性質(zhì),最后用重組酶制備異麥芽酮糖并對(duì)酶法制備異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。本研究為工業(yè)生產(chǎn)異麥芽酮糖提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

穿梭質(zhì)粒pHY300PLK,大連寶生物工程有限公司;克隆宿主BacillussubtilisSCK6[16]、表達(dá)宿主BacillussubtilisWS9[17]、帶有PantoeadispersaUQ68J蔗糖異構(gòu)酶基因sim的重組質(zhì)粒pET-24a (+)-sim為本實(shí)驗(yàn)室保存;重組質(zhì)粒pHY300PLK-sim和重組菌株WS9/pHY300PLK-sim為本研究構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑

DP209普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DP103質(zhì)粒小提試劑盒,北京天根生化科技有限公司;2×Phanta Max Master Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;DNA Maker、標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白Maker,大連寶生物工程有限公司;異麥芽酮糖、海藻酮糖標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;其他常見試劑,上海國藥集團(tuán)有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。

LB固體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,瓊脂粉15～20。

TB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12,酵母粉24,甘油5,K2HPO4·3H2O 16.43,KH2PO42.31。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃,滅菌20 min后使用。

1.1.4 儀器與設(shè)備

PCR儀、Mini Protein 3蛋白膠電泳儀,美國Bio-Rad公司;DYY-6C型核酸電泳儀,北京六一電泳儀廠;臺(tái)式離心機(jī),德國Eppendorf公司;Waters高效液相色譜,美國沃特世科技有限公司;空氣搖床、水浴搖床、恒溫培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;Agilent Polaris 3 NH2柱,美國安捷倫公司;紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;分析天平、pH計(jì),瑞士梅特勒托利多有限公司;恒溫水浴鍋,上海森信儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌WS9/pHY300PLK-sim的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pET-24a (+)-sim和穿梭載體pHY300PLK為模板,設(shè)計(jì)引物,將蔗糖異構(gòu)酶基因sim連接到穿梭質(zhì)粒pHY300PLK上,引物序列如表1所示。

表1 引物序列

重組質(zhì)粒pHY300PLK-sim的構(gòu)建方法為:以SI-F、SI-R為上下游引物,在重組質(zhì)粒pET-24a (+)-sim上擴(kuò)增出蔗糖異構(gòu)酶基因sim;以ZAI-F、ZAI-R為上下游引物將穿梭載體pHY300PLK線性化;將擴(kuò)增出的sim基因和線性化的載體片段膠回收后,用POE-PCR法[18]進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆宿主B.subtilisSCK6,涂布于含有四環(huán)素(20 μg/L)抗性的固體平板上,在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h,挑取重組子到LB培養(yǎng)基培養(yǎng)10～12 h后保菌提質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒即為pHY300PLK-sim。

將重組質(zhì)粒pHY300PLK-sim電轉(zhuǎn)B.subtilisWS9感受態(tài),涂布于含有四環(huán)素(20 μg/L)抗性的平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～12 h后,挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子即為重組菌WS9/pHY300PLK-sim,同時(shí)將驗(yàn)證正確的重組菌保存在-80 ℃冰箱中。

1.2.2 重組菌的搖瓶發(fā)酵以及重組蔗糖異構(gòu)酶的制備

從超低溫冰箱中取出重組菌甘油管,解凍后將重組菌以0.2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中,同時(shí)在LB培養(yǎng)基加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))的四環(huán)素,在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)10～12 h;將培養(yǎng)好的LB種子液以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到TB培養(yǎng)基中,同時(shí)加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))的四環(huán)素,在37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)2 h后,換到33 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成的發(fā)酵菌液8 000 r/min離心20 min,離心后的發(fā)酵上清液即為蔗糖異構(gòu)酶酶液。

1.2.3 蔗糖異構(gòu)酶酶活力的測(cè)定方法

本研究采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法[19]測(cè)定蔗糖異構(gòu)酶的酶活力:用50 mmol/L、pH 6.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制200 g/L的蔗糖溶液,吸取1.8 mL到15 mL的具塞試管中,在30 ℃水浴鍋中溫浴10～15 min。將酶液用緩沖液稀釋一定的倍數(shù),吸取200 μL,加入到蔗糖底物中準(zhǔn)確反應(yīng)15 min;反應(yīng)結(jié)束后立刻加入3 mL的DNS溶液,沸水煮沸10 min,放在冰水上待其溫度降至常溫后,加入10 mL去離子水,并在540 nm波長下測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。

將DNS溶液加入不同濃度的異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)品中,煮沸顯色,在540 nm波長下測(cè)定吸光值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,用標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光值換算為異麥芽酮糖濃度。

酶活力定義:在30 ℃、pH 6.0條件下,1 min內(nèi)生成1 μmol異麥芽酮糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(1 U)。

1.2.4 重組蔗糖異構(gòu)酶的純化

首先在蔗糖異構(gòu)酶C末端加6個(gè)連續(xù)的組氨酸(His標(biāo)簽),然后用鎳離子親和層析柱對(duì)重組蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行純化。

A液(mol/L):NaCl 0.5,Tris-HCl 0.025,調(diào)節(jié)pH值至7.4。

B液(mol/L):NaCl 0.5,Tris-HCl 0.025,咪唑0.3,調(diào)節(jié)pH值至7.4。

首先用100 mL的A液平衡鎳柱,然后將粗酶液緩慢流過鎳柱,之后用0%、5%、10%、20%、30%、50%、100%體積分?jǐn)?shù)的B液(50～100 mL)依次流過鎳柱,收集流出液,將流出液進(jìn)行SDS-PAGE分析,確定重組酶的最適洗脫濃度。使用30 kDa的超濾管對(duì)最適濃度洗脫液進(jìn)行超濾,濃縮至洗脫液剩余800 μL左右時(shí),繼續(xù)加入10～15 mL的50 mmol/L、pH 6.0的檸檬酸- Na2HPO4緩沖液置換洗脫液中的咪唑,用緩沖液反復(fù)超濾3～4次,最后得到的酶液即為純化后的蔗糖異構(gòu)酶。

1.2.5 重組蔗糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

最適pH:配制50 mmol/L,pH值分別為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的檸檬酸- Na2HPO4緩沖液,用不同pH的緩沖液配制200 g/L的蔗糖溶液,并用不同pH的緩沖液將蔗糖異構(gòu)酶稀釋一定倍數(shù)后測(cè)定酶活力。

pH穩(wěn)定性:用50 mmol/L,pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的檸檬酸- Na2HPO4緩沖液將蔗糖異構(gòu)酶稀釋合適的倍數(shù)后置于25 ℃水浴鍋中,放置24 h后測(cè)定其剩余酶活力。

最適溫度:以pH 6.0、200 g/L的蔗糖溶液為底物,將底物分別放在20、25、30、35、40、45 ℃的水浴鍋中溫浴10 min,然后將酶液加入不同溫度的底物溶液中測(cè)定酶活力。

溫度穩(wěn)定性:將重組蔗糖異構(gòu)酶置于45 ℃的水浴鍋中,定時(shí)取樣,并測(cè)定酶活力,研究蔗糖異構(gòu)酶的溫度穩(wěn)定性并確定半衰期。半衰期為酶活力降為最高酶活力一半時(shí)所用時(shí)間。

以上酶學(xué)性質(zhì)均設(shè)定最高酶活力為100%,其余酶活力與最高酶活力的比值即為相對(duì)酶活力。

1.2.6 重組蔗糖異構(gòu)酶制備異麥芽酮糖的反應(yīng)條件優(yōu)化

加酶量優(yōu)化:將重組蔗糖異構(gòu)酶分別以5～30 U/g(每5 U/g設(shè)置一個(gè)梯度)的加酶量加入到pH 6.0、200 g/L的蔗糖溶液中,在30 ℃、150 r/min的水浴搖床中反應(yīng)10 h,HPLC法檢測(cè)各糖含量并計(jì)算異麥芽酮糖產(chǎn)率。

溫度優(yōu)化:配制pH 6.0、200 g/L的蔗糖底物,加酶量為20 U/g,將反應(yīng)體系在25～45 ℃(每5 ℃設(shè)置一個(gè)梯度)、150 r/min反應(yīng)10 h,HPLC法檢測(cè)各糖含量并計(jì)算異麥芽酮糖產(chǎn)率。

底物蔗糖濃度優(yōu)化:以pH 6.0的檸檬酸- Na2HPO4溶液配制終質(zhì)量濃度分別100～700 g/L(每100 g/L設(shè)置一個(gè)梯度)的蔗糖溶液,加酶量為20 U/g,將反應(yīng)體系在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)10 h,HPLC法檢測(cè)各糖含量并計(jì)算異麥芽酮糖產(chǎn)率。

1.2.7 異麥芽酮糖含量的檢測(cè)

將酶轉(zhuǎn)化結(jié)束的樣品高溫煮沸20 min,12 000 r/min離心3 min,取離心后的上清液稀釋一定倍數(shù),之后用0.22 μm的水相濾頭過濾,最后用Waters高效液相色譜儀檢測(cè)樣品中各組分含量。

采用示差折光檢測(cè)器(refractive index detector,RID),色譜柱為Agilent公司、Polaris 3 NH2(150 mm×4.6 mm),流動(dòng)相為80%(體積分?jǐn)?shù))的乙腈,柱溫40 ℃,流速0.8 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

異麥芽酮糖產(chǎn)率的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖異構(gòu)酶在B.subtilis中的表達(dá)與純化

按1.2.1節(jié)所示方法,獲得重組菌B.subtilisWS9/pHY300PLK-sim,將重組菌搖瓶發(fā)酵48 h,測(cè)得發(fā)酵上清液中蔗糖異構(gòu)酶的酶活力為9.51 U/mL,然后按1.2.4節(jié)所示方法,將重組蔗糖異構(gòu)酶純化,將純化后的蔗糖異構(gòu)酶、重組菌發(fā)酵上清液和對(duì)照菌發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。蔗糖異構(gòu)酶理論分子質(zhì)量為65.7 kDa[10],如圖1所示,泳道1和2都在理論分子質(zhì)量附近有清晰的蛋白條帶,對(duì)照菌在理論分子質(zhì)量附近沒有相應(yīng)的條帶,表明蔗糖異構(gòu)酶成功在B.subtilis中重組表達(dá),且重組蔗糖異構(gòu)酶達(dá)到電泳純級(jí)別。

M-蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker;泳道1、2、3分別為純化后的蔗糖異構(gòu)酶、重組菌發(fā)酵上清液、對(duì)照菌發(fā)酵上清液

2.2 重組蔗糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 重組蔗糖異構(gòu)酶的最適pH

pH是影響酶活力的重要因素之一。一方面pH通過影響酶活性中心相關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)影響酶的催化活性;另一方面pH會(huì)影響底物的解離狀態(tài),繼而影響酶與底物的結(jié)合與催化能力。將蔗糖異構(gòu)酶放在pH值為4.0～8.0的條件下測(cè)定酶活力,如圖2所示,當(dāng)pH 4.0時(shí)酶活力只有10.50%,隨著pH的增加酶活力逐漸提高,pH 6.0時(shí),蔗糖異構(gòu)酶的酶活力達(dá)到最高,pH>6.0之后,酶活力開始下降,pH值在5.5～7.0,蔗糖異構(gòu)酶能保留80%以上的酶活力;pH偏酸或偏堿酶活性損失較大。

圖2 重組蔗糖異構(gòu)酶的最適pH值

2.2.2 重組蔗糖異構(gòu)酶的pH穩(wěn)定性

pH穩(wěn)定性用酶分子在某一pH條件下放置一段時(shí)間后的剩余酶活力來衡量。將重組蔗糖異構(gòu)酶用不同pH的緩沖液稀釋一定倍數(shù),在25 ℃水浴鍋中靜置24 h后,測(cè)其剩余酶活力。如圖3所示,重組蔗糖異構(gòu)酶在pH 4.0的緩沖液中放置24 h后酶活力只剩16.36%,在pH 6.0的緩沖液放置24 h酶活力基本不變,說明該蔗糖異構(gòu)酶在pH 6.0的條件下穩(wěn)定性最好;在pH 5.0～8.0的環(huán)境中放置24 h后酶活性皆能保留80%以上,說明該酶在較寬pH范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖3 重組蔗糖異構(gòu)酶的pH穩(wěn)定性

2.2.3 重組蔗糖異構(gòu)酶的最適溫度

溫度對(duì)酶活力有著顯著的影響。一方面溫度升高,底物中活化分子數(shù)量增加,加快酶反應(yīng)速率;另一方面,溫度升高伴隨著酶逐漸變性,2種因素共同影響了酶的反應(yīng)速率。將重組蔗糖異構(gòu)酶在20～45 ℃下測(cè)定酶活力,結(jié)果如圖4所示。隨著溫度的升高,酶活力逐漸提高,30 ℃時(shí),酶活力達(dá)到最高,隨著溫度的繼續(xù)升高,蛋白變性對(duì)酶活力的影響超過了反應(yīng)速率對(duì)酶活力的影響,酶活力開始下降。因此重組蔗糖異構(gòu)酶的最適溫度為30 ℃。

圖4 重組蔗糖異構(gòu)酶的最適溫度

2.2.4 重組蔗糖異構(gòu)酶的溫度穩(wěn)定性

將重組蔗糖異構(gòu)酶置于45 ℃的水浴鍋中靜置處理,每隔20 min取1次樣并測(cè)定酶活力。如圖5所示,隨著處理時(shí)間的增加,重組酶的酶活力逐漸下降,在60 min時(shí),重組酶的酶活力保留率為60.53%,在80 min時(shí)酶活力僅剩37.56%,重組酶在45 ℃下的半衰期為68 min。

圖5 重組蔗糖異構(gòu)酶的溫度穩(wěn)定性

2.3 酶轉(zhuǎn)化制備異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.3.1 加酶量對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

將重組蔗糖異構(gòu)酶按不同加酶量(5～30 U/g)加入pH 6.0、200 g/L的蔗糖底物中,在30 ℃下轉(zhuǎn)化10 h。結(jié)果如圖6所示,隨著加酶量的增加,異麥芽酮糖產(chǎn)率逐漸升高,加酶量為20 U/g時(shí),異麥芽酮糖產(chǎn)率達(dá)到最高83.17%,隨著加酶量的進(jìn)一步提高,異麥芽酮糖產(chǎn)率反而下降,推測(cè)原因與蔗糖異構(gòu)酶的催化特性有關(guān):蔗糖異構(gòu)酶除了將蔗糖異構(gòu)為異麥芽酮糖,同時(shí)還將蔗糖水解為葡萄糖和果糖,當(dāng)加酶量超過20 U/g時(shí),生成異麥芽酮糖的異構(gòu)反應(yīng)基本到達(dá)平衡狀態(tài),而蔗糖異構(gòu)酶的水解反應(yīng)會(huì)繼續(xù)消耗蔗糖導(dǎo)致用于異構(gòu)為異麥芽酮糖的蔗糖量減少,所以異麥芽酮糖產(chǎn)率下降。因此制備異麥芽酮糖的最適加酶量為20 U/g。

圖6 加酶量對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響體現(xiàn)在2個(gè)方面:一是溫度會(huì)顯著影響酶的催化活力和穩(wěn)定性;二是溫度影響著蔗糖異構(gòu)酶異構(gòu)反應(yīng)和水解反應(yīng)的平衡性,溫度較低時(shí)蔗糖異構(gòu)酶的水解反應(yīng)較弱,但有利于海藻酮糖生成,溫度較高時(shí),海藻酮糖的生成受到抑制,但蔗糖異構(gòu)酶的水解能力會(huì)增強(qiáng)[10,20]。因此,合適的溫度有利于異麥芽酮糖的生產(chǎn)。以pH 6.0、200 g/L的蔗糖溶液為底物,加酶量為20 U/g,將反應(yīng)體系分別在20～45 ℃條件下反應(yīng)10 h,結(jié)果如圖7所示。隨著溫度的升高,異麥芽酮糖產(chǎn)率逐漸升高,到30 ℃時(shí),異麥芽酮糖產(chǎn)率最高為83.17%,雖然在20 ℃和25 ℃下異麥芽酮糖產(chǎn)率與30 ℃時(shí)產(chǎn)率相近,但低溫更有利于海藻酮糖的產(chǎn)生,而35 ℃下異麥芽酮糖產(chǎn)率下降到80.32%,綜上制備異麥芽酮糖的最適溫度為30 ℃。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

2.3.3 底物濃度對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

以pH 6.0、100～700 g/L(梯度為100 g/L)的蔗糖溶液為底物,加酶量為20 U/g,在30 ℃下轉(zhuǎn)化10 h,結(jié)果如圖8所示。隨著蔗糖濃度的升高,異麥芽酮糖產(chǎn)率逐漸升高,當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí),產(chǎn)率最高可到90.61%,當(dāng)繼續(xù)采用更高質(zhì)量濃度的蔗糖(500、600、700 g/L)進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化時(shí),異麥芽酮糖產(chǎn)率基本持平且可以維持在89.20%左右。因此,雖然底物質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率最高,但采用700 g/L的蔗糖進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化能獲得異麥芽酮糖產(chǎn)量更高,且此時(shí)幾乎沒有蔗糖殘留,能更好地降低生產(chǎn)成本,因此更適合工業(yè)化制備異麥芽酮糖的蔗糖質(zhì)量濃度為700 g/L。

圖8 底物濃度對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

3 結(jié)論與討論

本研究將P.dispersaUQ68J蔗糖異構(gòu)酶在B.subtilis中重組表達(dá),對(duì)重組蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行純化并研究其酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明,該重組酶在30 ℃、pH 6.0的條件下酶活力最高,在pH 5.0～8.0的條件下穩(wěn)定性良好。用該重組酶制備異麥芽酮糖,以pH 6.0、400 g/L的蔗糖為底物,加酶量為20 U/g,在30 ℃下轉(zhuǎn)化10 h時(shí),異麥芽酮糖產(chǎn)率最高可達(dá)90.61%,采用更高質(zhì)量濃度的蔗糖(700 g/L)轉(zhuǎn)化時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率仍可達(dá)89.20%,實(shí)現(xiàn)了酶法制備異麥芽酮糖高產(chǎn)率。

LI等[8]將E.rhaponticiNX-5蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中重組表達(dá)后制備異麥芽酮糖,蔗糖質(zhì)量濃度為550 g/L時(shí),異麥芽酮糖產(chǎn)率為87%;程勝等[9]將S.plymuthicaAS9蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中重組表達(dá)后制備異麥芽酮糖,蔗糖質(zhì)量濃度400 g/L時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率達(dá)到最大(87.9%),而蔗糖質(zhì)量濃度提高到500 g/L時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率下降到83.2%;耿夢(mèng)華等[21]將短小芽胞桿菌表達(dá)的重組蔗糖異構(gòu)酶固定化后制備異麥芽酮糖,在600 g/L蔗糖質(zhì)量濃度下異麥芽酮糖產(chǎn)率可達(dá)87.8%;相較于其他微生物來源的蔗糖異構(gòu)酶,本研究得到的重組蔗糖異構(gòu)酶安全性好,在高底物濃度下高異麥芽酮糖產(chǎn)率更高,工業(yè)應(yīng)用潛力巨大。綜上所述,本研究提供了一種優(yōu)秀的重組蔗糖異構(gòu)酶和簡單高效的酶轉(zhuǎn)化工藝,為異麥芽酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。