蒙東地區(qū)三種藥用植物根際微生物群落特性研究

寇佩雯，劉長樂，許祎珂，宋忠興，李鉑，張永生，黃文靜，唐志書,3

（1陜西中醫(yī)藥大學/陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西咸陽 712083；2內(nèi)蒙古海天制藥有限公司，內(nèi)蒙通遼 028000；3中國中醫(yī)科學院，北京 100700）

0 引言

在《本草經(jīng)集注》中有“諸藥所生，皆有境界”的記載，同樣在實際生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn)環(huán)境改變可以引起中藥質(zhì)量的改變[1]。研究發(fā)現(xiàn)，除生態(tài)環(huán)境和逆境脅迫等影響藥用植物道地性的因素外，藥用植物根際微生物亦是影響藥材道地性的因素之一[2]。全而平衡的土壤微生物對于保證藥用植物正常生長、發(fā)育、和代謝具有重要意義[3]。1904年德國微生物學家Lorenz Hiltner提出“根際”概念時指出，根際微生物在一定程度上可以抑制經(jīng)土傳染的植物病害，植物根際微生物參與了土壤中許多養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，直接或間接地影響了自然生態(tài)系統(tǒng)中植物群落的組成、生物量和功能[4]。土壤微生物在一定程度上影響了植物的產(chǎn)量和植物的修復效率[5]。微生物活性可以改變根系滲出物的組成[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物可以通過影響藥用植物的抗病蟲害能力、抗逆能力、藥用部位的生長情況、有效成分的積累和連作障礙等來影響藥用植物的品質(zhì)[8-9]。與此同時，植物也會根據(jù)環(huán)境變化釋放不同的根系分泌物影響微生物的結(jié)構(gòu)以適應周圍環(huán)境[10]。植物對微生物的影響可以通過改變滲出物中碳水化合物、羧酸和氨基酸的含量，從而影響植物的根際環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，當根系環(huán)境中所含鐵和磷的可用性不足時，植物會滲出有機酸陰離子來刺激根際微生物酸化土壤，從而改善自身生存環(huán)境并獲取營養(yǎng)物質(zhì)[11]。

根際微生物群落特征是由農(nóng)業(yè)管理和宿主選擇過程之間的相互作用所決定的[12]。在擬南芥等植物的研究中發(fā)現(xiàn)，不同植物種類、同一植物的不同基因型和植物的不同生長發(fā)育時期都對根際微生物的組成有明顯影響[13-15]。土壤的物理化學性質(zhì)、肥力、pH等因素可以通過影響植物的生理特性和根際沉積的組成進一步影響植物根際微生物群落的結(jié)構(gòu)[16]。對沙草的研究發(fā)現(xiàn)，土壤的pH等性質(zhì)會影響沙草根際微生物群落的結(jié)構(gòu)[17]。在4 種草莓栽培品菌根真菌的研究中發(fā)現(xiàn)，土壤的物理化學特性和管理措施決定了特定宿主相關(guān)的微生物群落特性和結(jié)構(gòu)[18]。可見，根際微域內(nèi)的土壤、土壤微生物和植物根系間相互作用相互影響，不同藥用植物的根際微生物具有獨特的特征。藥用植物根莖葉中的各類代謝物或次生代謝物是中藥藥理的主要成分，植物的根際和葉際微生物可能對這些代謝物的產(chǎn)生有一定的促進或抑制作用，同時這些物質(zhì)也可能對微生物群落產(chǎn)生影響。因此，探究藥用植物根際微生物群落的特征，以及土壤環(huán)境因子和植物類型對微生物群落的影響情況對指導藥用植物種植，保證藥用植物質(zhì)量具有重要意義[19]。

內(nèi)蒙古是中國藥用資源大省，擁有豐富的藥材品種和廣闊的種植面積[20]。該地區(qū)種植有黃芪、黃芩、桔梗、麻黃、防風、北沙參、甘草等多種中藥材[21]。研究發(fā)現(xiàn)，甘草、防風和北沙參在內(nèi)蒙古地區(qū)種植面積較廣[22-24]。本研究采集了內(nèi)蒙古蒙東地區(qū)種植年限、長勢相近的甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、北沙參(GlehniaeRadix)和防風(Saposhnikoviadivaricata)三種藥用植物的根際土壤以及實驗基地的非根基土壤為樣本，測定了各樣本的土壤理化性質(zhì)，并通過高通量測序技術(shù)對各樣本的微生物進行了初步研究，旨在分析內(nèi)蒙地區(qū)小的局域環(huán)境中藥用植物根際和非根際土壤中微生物的結(jié)構(gòu)和豐度特征，揭示土壤環(huán)境因子和植物類型對微生物群落的驅(qū)動效應。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域和采樣點的設(shè)置

在內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)慶和鎮(zhèn)林場（經(jīng)緯度：121°55′17′′E，43°43′56′′N；海拔：140 m）3號地試驗田，于2021年9月11日采用多點混合法進行取樣，各樣本各選取3個采樣點。對照組(CK)樣本選取自距離實驗田50 m左右未種植過植物的非根際土壤，根際土壤采集自長勢和株齡（約1 年）相近的防風(FF)、甘草(GC)和北沙參(SS)。非根際土壤采集時先去除地表5 cm厚的土壤和覆蓋物，然后收集0～20 cm 深度的土壤。根際土壤收集采用抖落法，即在每個采樣點選取5 株植物，收集附著于植株根系表面約0.5 cm 左右的土壤。隨后，將相同樣品混勻后分為兩份，分別裝于無菌密封袋中，封存于干冰盒中，并送至上海派森諾生物科技有限公司進行土壤理化性質(zhì)分析和微生物群落分析。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)測定主要參考《土壤農(nóng)化分析》[16]進行，采用浸提法利用ORP-3000酸度計測定pH；采用采用濃硫酸消解-凱式定氮法測定全氮(TN)含量；采用鉬銻顯色法測定全磷(TP)含量；采用火焰光度法測定全鉀(TK)含量；采用化學比色法測定脲酶(URE)、蔗糖酶(SUC)、過氧化氫酶(CAT)和酸性磷酸酶(AP)的含量。

1.3 土壤微生物群落分析

利用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒提取各樣本土壤的總DNA，用NanoDrop ND-2000對DNA進行定量，后通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。采用全式金公司的Pfu 高保真DNA 聚合酶進行PCR擴增，利用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對細菌V3-V4 區(qū)進行擴增；利用SSU0817F(5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’)和1196R(5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’)引物對真菌V5-V7區(qū)進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)磁珠純化回收，后采用Quant-iT Pico Green dsDNAAssay Kit進行熒光定量檢測，根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需求對各樣本按相應比例等摩爾混合?；旌虾蟮臄U增產(chǎn)物以Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。

對制備好的文庫使用Agilent Bioanalyzer 進行質(zhì)檢，合格的文庫采用Illumina MiSeq 測序儀進行雙端測序，原始下機數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進行初步篩查，并根據(jù)index 和Barcode 信息對文庫和樣本進行劃分。按照QIIME2 dada2分析流程和Vsearch軟件的分析流程進行序列去噪和操作分類單元(OTUs)聚類，對比Silva數(shù)據(jù)庫(Release132，http://www.arb-silva.de)進行物種分類學注釋，并采用RDP classifier 貝葉斯算法對在97%相似水平下的OTU進行豐度分析，揭示樣品的物種組成。根據(jù)OTU在不同樣本中的分布，評估每個樣本的α 多樣性水平，包括Coverage、Chaol、ACE 和Shannon等指數(shù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 26軟件對樣品土壤理化變量數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，并采用新復極差法(Duncan)比較數(shù)據(jù)組間差異。使用Pearson 相關(guān)系數(shù)對各個指標進行相關(guān)性分析。使用R語言包vegan進行群落α 多樣性分析，并利用Microsoft Excel 2013 對數(shù)據(jù)進行整理和制表。通過派諾森基因云平臺(https://www.genescloud.cn/home)繪制相關(guān)性分析熱圖，通過圖圖云平臺(https://www.cloudtutu.com/#/login)繪制垂直分組柱狀圖、RDA冗余分析圖和方差分解分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

由表1可知，各樣本之間的TN、TK、URE、SUC和AP 存在顯著差異。其中，TN、URE、SUC 和AP 均在GC中最大，在CK中最小。TK在CK中最大，在SS中最小。各樣本間pH沒有顯著差異，但所有土壤樣本的pH都大于8，為弱堿性土壤。TP和CAT僅在非根際土壤(CK)和根際土壤（FF、GC 和SS）之間存在顯著差異(P＜0.05)，TP 含量在非根際土壤中較高，而CAT 含量在非根際土壤中較低?？梢?，不同樣本之間的土壤理化性質(zhì)存在較大差異，尤其是在根際土壤與非根際土壤之間。

表1 各土壤的理化性質(zhì)

2.2 非根際及3種藥材根際微生物群落組成及多樣性

在97%的相似度水平下，對土壤樣品中的細菌進行了OTU 個數(shù)的鑒定，并對OTU 代表序列進行物種注釋。在土壤樣本中共檢測出細菌有36 個門、105 個綱、231個目、402個科、770個屬和1594個種，在3種植物的根際土壤中共檢測出細菌38 個門、110 個綱、244個目、443個科、966個屬和2272個種。在土壤樣本中共檢測出真菌12個門、30個綱、59個目、126個科、210個屬和269 個種，在3 種植物根際中共檢測出真菌14個門、39 個綱、86 個目、186 個科、327 個屬和495 個種?？梢娫谠撐⒂颦h(huán)境的根際土壤中微生物豐富且多樣性較高。

在所有4組樣本中，前15個優(yōu)勢細菌門分布情況如圖1A 所示，其中，豐度大于1%的菌群，CK 中有8個，根際土中SS、FF、GC 分別各有8 個、7 個和6 個。CK、FF和SS的優(yōu)勢菌門分布相似，前3個優(yōu)勢菌門分別為變形菌門 (Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和酸酐菌門(Acidobacteria)。而GC 與其他樣本不同，前3個優(yōu)勢菌門分別為變形菌門、放線菌門和擬桿菌門(Bacteroidetes)。如表2 所示，在所有樣本中，GC 細菌群落的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)最低，F(xiàn)F細菌群落Shannon指數(shù)最高，CK和SS細菌群落的Simpson 指數(shù)相同且最高?？梢奊C 中細菌群落多樣性最低，均勻度也較低，F(xiàn)F 中細菌群落多樣性最高。CK和SS中細菌群落均勻度最高。FF的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高，可見其根際細菌群落中種類數(shù)目最多，而GC樣本與FF樣本相反。

圖1 不同樣本細菌優(yōu)勢菌門(A)和真菌優(yōu)勢菌科(B)的相對豐度

表2 非根際及3種藥材根際土壤細菌和真菌群落多樣性

所有4 組樣本中，前15 個優(yōu)勢真菌科組成，如圖2B 所示，其中豐度大于1%的菌群，在CK 中有10 個，根際土中GC、SS、FF 中分別有13 個、11 個和9 個。各樣本中排在前列的優(yōu)勢真菌科分布不完全相同，除赤殼科(Nectriaceae)和微囊科(Microascaceae)均位于各樣本優(yōu)勢菌科前列外，F(xiàn)F 中孢子科(Pleosporaceae)、GC中鱗毛蕨科(Phaeosphaeriaceae) 和被孢霉科(Mortierellaceae)、SS 中二甲藻(Didymellaceae)和球菌科(Leptosphaeriaceae)也為各樣本中占比較大的菌科。如表2所示，SS真菌群落的Shannon指數(shù)最大，而Simpson 指數(shù)最小。CK 真菌群落的Shannon 指數(shù)最小，可見CK真菌群落多樣性較小，SS真菌群落多樣性最高而均勻度最低。GC的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最低，由此說明其根際真菌群落中種類數(shù)目最少，而SS的2個指數(shù)和根際真菌群落中種類數(shù)目與GC相反。

2.3 環(huán)境因子對土壤微生物群落的影響

不同的環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性具有顯著性影響。如表3 所示，利用Spearman 方法分析土壤環(huán)境因子與非根際和根際中菌群α多樣性指數(shù)間相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)對于細菌菌群，Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)與AP 負相關(guān)，Simpson 指數(shù)與TN、URE 和SUC 負相關(guān)，ACE 指數(shù)與URE 負相關(guān)。而對于真菌群落CAT 與Shannon 指數(shù)、ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)正相關(guān)，與Simpson 指數(shù)負相關(guān)。TK 與Simpson 指數(shù)正相關(guān)，與Shannon 指數(shù)、ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)負相關(guān)?？梢娫谠摼钟颦h(huán)境內(nèi)全氮、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶對細菌群落結(jié)構(gòu)影響較為顯著，全鉀和過氧化氫酶對真菌群落結(jié)構(gòu)影響較顯著。

運用Spearman 分析篩選土壤理化性質(zhì)中各菌群群落構(gòu)成的驅(qū)動因子。由圖2A 和2B 可知，土壤環(huán)境因子主要通過影響變形菌門、厚壁菌門、疣微菌門和浮霉門影響了細菌菌群分布，又通過影響叢赤殼科、微囊科、假球殼科和球菌科影響了真菌菌群結(jié)構(gòu)的分布。

為了探究驅(qū)動各菌群差異的環(huán)境因素，對各樣本的菌群豐度和顯著相關(guān)的5項土壤理化因子進行冗余分析。由圖3A和3B可見，在細菌菌群和真菌群落中，除FF菌群分布與CK較為接近外，其余各菌群分布差異明顯，并且GC 菌群分布較其他群落較遠。分析群落組成結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系?？梢娫诩毦T水平上第一軸和第二軸的解釋率分別為66.21%和8.04%，總解釋率達74.25%。在真菌科水平上，第一軸和第二軸的解釋率分別為34.83%和16.59%，總解釋率達51.42%。綜合來看，樣本的菌群結(jié)構(gòu)在細菌門水平上和真菌科水平上受TN、TP、URE、AP和SUC的影響。

圖3 優(yōu)勢細菌(A)和真菌(B)與土壤環(huán)境因子和植物類型的冗余分析

2.4 植物類型對土壤微生物群落的影響

方差分解分析植物在細菌門水平（圖4A）和真菌科水平（圖4B）的差異與土壤因子對植物根際微生物群落的相對大小，結(jié)果顯示土壤和植物類型的交互作用對細菌群落差異的解釋率為39.4%，而2個因素單獨對細菌群落結(jié)構(gòu)解釋率均小于0。植物種類、土壤分別解釋了3 種植物根際真菌群落差異的8.49%和1.61%，兩因素交互共同解釋率為9.75%?？梢娡寥拉h(huán)境因子與植物的交互作用對細菌群落結(jié)構(gòu)有重要影響，而環(huán)境因子和植物類型均對真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的影響。

圖4 方差分解分析土壤環(huán)境因子和植物類型對細菌(A)與真菌(B)群落影響相對大小

3 討論與結(jié)論

在植物分類學上，甘草屬于豆科(Fabaceae)，防風和北沙參屬于傘形科(Apiaceae)。本研究在微尺度局域空間上分析了3種藥用植物根際和非根基土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，非根際土壤和根際土壤間全磷和過氧化氫酶的差異最為顯著，其中在根際土壤中全磷含量較低而過氧化氫酶含量較高。已有研究表明過氧化氫酶與土壤中有機質(zhì)含量呈正相關(guān)，可以作為土壤肥力的指標[25-26]。可見根際土壤的肥力更好，這可能與試驗田肥料的施用有關(guān)。土壤群落分析結(jié)果表明，非根際土壤較根際土壤菌群豐富度較低。各樣本菌群分布具有相似性，在細菌菌群群落中變形菌門和放線菌門的占比均較大，在真菌群落中赤殼科和微囊科的占比均較大。這與對內(nèi)蒙道地藥材黃芪的研究結(jié)果一致，在黃芪的研究中也發(fā)現(xiàn)放線菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門[27]。這可能因為變形菌門適應能力強，屬于自然界中最普遍的菌門之一。變形菌門含有較多的固氮微生物，參與了重要的有機質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和土壤結(jié)構(gòu)形成過程[28]。豆科甘草區(qū)別于其他兩種傘形科藥用植物，其優(yōu)勢細菌群落為擬桿菌門，優(yōu)勢真菌群落為鱗毛蕨科和被孢霉科。已有研究表明，植物自身的掉落物優(yōu)化了植物對氮和磷等稀缺養(yǎng)分的吸收，誘導了不同的外生菌根群落發(fā)育[29]。被孢霉科作為常見的優(yōu)勢真菌，對氮處理敏感[30]。土壤的有機質(zhì)來源往往取決于地上植被凋落物的種類，而擬桿菌門在有機質(zhì)分解和多糖代謝過程起著重要的作用[31]。由此推測，與傘形科植物不同，豆科的甘草含有的凋落物類型和氮素環(huán)境可能影響了甘草根際菌群的分布。

Spearman分析結(jié)果表明，環(huán)境因子對微生物群落的復雜程度影響明顯，細菌菌門群落復雜程度與全氮、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶呈負相關(guān)，真菌菌科群落復雜程度與全鉀和過氧化氫酶呈負相關(guān)。這與阿魏和玉米等植物根際菌群結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致，磷和鉀等因子也驅(qū)動了其根際菌群結(jié)構(gòu)[32-33]。但土壤有機質(zhì)和氮磷鉀等理化性質(zhì)對土壤微生物群落的影響復雜，目前還沒有完全一致的結(jié)論[27]。對優(yōu)勢細菌門和真菌科以及土壤理化性質(zhì)的冗余分析，結(jié)果表明細菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)主要由全氮、全磷、脲酶、蔗糖酶和全磷驅(qū)動。驅(qū)動因子脲酶在塑造細菌和真菌群落功能特征方面起著重要作用，它與土壤有機碳和總氮呈高度相關(guān)，它與土壤有機碳和總氮呈高度相關(guān)，在氮循環(huán)中也發(fā)揮重要作用，同時提高土壤生態(tài)系統(tǒng)中的植物修復效率[34-35]。結(jié)合方差分解分析發(fā)現(xiàn)，土壤環(huán)境因子與植物的交互作用是細菌群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動因素，而環(huán)境因子和植物類型對真菌群落結(jié)構(gòu)均有影響，這與晉東南地區(qū)3種道地藥材的研究結(jié)果一致[36]。該結(jié)果可能與真菌根際效應強、變異性高有關(guān)[37-38]。

綜上所述，在試驗田的局域環(huán)境中，根際土壤菌群中變形菌門和放線菌門是防風、甘草和北沙參的共有優(yōu)勢細菌菌門，占比分別在27.85%～52.69%和18.39%～44.59%之間；赤殼科和微囊科是共有的優(yōu)勢真菌菌科，占比分別在3.70%～14.94%和4.66%～30.32%之間。其中，甘草與其他兩種傘形科植物在菌群結(jié)構(gòu)上有較大差異，其優(yōu)勢細菌群落為擬桿菌門(18.86%)，優(yōu)勢真菌群落為鱗毛蕨科(7.37%)和被孢霉科(9.41%)，可能與其為豆科植物有關(guān)。土壤環(huán)境因子與植物種類單獨對細菌群落結(jié)構(gòu)的解釋率均小于0，而兩者交互作用對細菌群落差異的解釋率為39.4%，可見土壤環(huán)境因子與植物種類的交互作用是細菌群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動因素；植物種類和土壤環(huán)境因子分別解釋了真菌群落差異的8.49%和1.61%，兩者交互作用對真菌群落差異的解釋率為9.75%，可見環(huán)境因子和植物類型均對真菌群落結(jié)構(gòu)有影響。總體來說，植物—微生物—土壤間相互作用為藥用植物構(gòu)建了獨特的生長環(huán)境。