硫酸-蒽酮分光光度法測定靈芝功能食品中粗多糖含量*

戴志英，郭新穎，葉青華

（江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通 226007）

靈芝中粗多糖是靈芝的有效成分之一，粗多糖是一種復(fù)合型雜多糖，有脂多糖、黏多糖、糖蛋白等，粗多糖的保健作用非常多，不僅可以提高人體內(nèi)生理細胞活性，增強免疫功能，而且具有降血糖、降血脂和抗癌功效，因此，靈芝功能食品成為倍受人們喜愛的藥食同源保健品。目前，國內(nèi)外對靈芝多糖的研究比較多，所以，本文研究了硫酸-蒽酮法測定靈芝功能食品中粗多糖含量的條件，并進行方法學(xué)驗證，同時對抽取的市場上5 種不同靈芝功能食品進行了粗多糖含量的測定，為人們提供消費依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

多糖經(jīng)沸水浴提取后，用乙醇沉淀分離，除去可溶性雜質(zhì)干擾，沉淀用純水溶解后，加入硫酸-蒽酮溶液，多糖與H2SO4在沸水浴中加熱脫水生成輕甲基呋喃甲醛，再以蒽酮縮合成藍綠化合物，該物質(zhì)在625nm 處有最大吸收，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與溶液中糖的濃度呈正比。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇、葡萄糖、蒽酮，分析純；H2SO4，優(yōu)級純；以上試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

N15GB167839 香菇質(zhì)控樣品（指定值（1.00±0.05）g/100g 上海源葉生物科技有限公司）。WFJ7200型分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；PRl-MOR 離心機（賽默飛一世爾科技公司）；50mL 塑料離心管。

1.3 溶液的配制

1.3.1 0.1%的硫酸-蒽酮溶液 稱取0.05g 蒽酮置于50mL 容量瓶中，緩慢加入50mL H2SO4溶液（取濃H2SO438mL，緩慢加到12mL 純水中），搖勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 1000μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取1.0000g 已干燥恒重的葡萄糖，加水溶解后用純水稀釋至1000mL，混勻。

1.3.3 100μg·mL-1葡萄糖使用液 用移液管吸取10mL 1000μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL 容量瓶中，加純水至刻度，混勻。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取100μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于10mL具塞比色管中，相當(dāng)于含0、10、20、40、60、80、100μg葡萄糖，加水至1.0mL，在冰浴中向各管加入5mL 硫酸-蒽酮溶液，充分混勻，在沸水浴中加熱10min，取出在流水中冷卻20min 后，在波長為625nm 下用1cm比色皿試劑空白調(diào)零，測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 樣品處理 稱取0.50～1.00g 已粉碎均勻的樣品，置于50mL 塑料離心管中，加水約40mL，沸水浴中煮沸2h，取出冷卻，以8000r·min-1離心5min，收集上清液，殘渣加水約10mL 后置于沸水浴中煮沸2h，以8000r·min-1離心5min，合并2 次上清液，加水至100mL，混勻后取溶液5～10mL 加無水乙醇40mL，搖勻，冷藏放置過夜，然后以8000r·min-1離心5min，將沉淀用水溶解至100mL，混勻后供測定。

1.4.3 樣品測定 吸取樣品待測液1mL 于10mL 具塞比色管中，以下操作按1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)系列同法操作，測定吸光度，計算樣品中粗多糖含量。

1.4.4 計算公式

式中X：試樣中粗多糖含量（以葡萄糖計），g/100g；m2：1mL 樣品待測液的吸光度值相當(dāng)含粗多糖質(zhì)量，μg；m1：取樣量，g；v1：樣品經(jīng)沸水浴提取定容后的取樣體積，mL；100：第一個100 是樣品經(jīng)沸水浴2 次提取后，上清液合并后的定容體積，mL；100：第二個100是加入無水乙醇后的沉淀用純水定容的體積，mL；1：吸取待測樣品液的體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳吸收波長的選擇

按1.4 項實驗方法，吸取100μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL 于10mL 具塞比色管中，于冰浴中加入5mL 硫酸-蒽酮溶液，混勻，于沸水浴中煮沸10min，取出在流水中冷卻20min 后，在580～660nm處進行吸光度測定，結(jié)果表明，溶液在625nm 處有最大吸收，故選擇625nm 為測定波長。

2.2 水浴反應(yīng)時間的確定

在冰浴中配制濃度為100μg/6mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液6 管，渦旋均勻后立即于沸水浴中加熱，反應(yīng)時間分別為2、4、6、8、10、12min，在流水中冷卻至室溫后，于625nm 處測其吸光度，結(jié)果見表1。

表1 不同反應(yīng)時間對應(yīng)的吸光度值Tab.1 Absorbance values corresponding to different reaction times

由表1 可見，吸光度隨沸水浴時間的增加而逐漸增加，當(dāng)沸水浴反應(yīng)時間達到10min 后，吸光度趨于穩(wěn)定，故沸水浴反應(yīng)時間確定為10min。

2.3 線性范圍及檢出限

葡萄糖含量在0～100μg/6mL 范圍內(nèi)，符合比耳定律，回歸方程Y=0.005198X+0.01190，相關(guān)系數(shù)r=0.9990。測定11 個樣品空白液的吸光度，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，方法的檢出限為0.333μg·mL-1。

2.4 精密度實驗

配制10μg/6mL、40μg/6mL、100μg/6mL 的低、中、高3 種葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實驗方法1.4.3 測定濃度，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。

由表2 可見，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02%～4.99%，可以滿足分析檢測的要求。

2.5 方法的準(zhǔn)確度

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)法，分別稱取2.0g 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6 份，按1.4.2 方法同法處理，按1.4.3 方法測定吸光度，計算多糖含量，測得的多糖含量為0.98g/100g，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的指定值為（1.00±0.05）g/100g，可見方法具有較好的準(zhǔn)確性。

2.6 樣品測定

本文對市場管理局抽采的5 個靈芝功能食品按實驗方法測定粗多糖含量，稱取0.50～1.00g 已粉碎均勻的樣品，同時加入1000μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液20mL（含20000μg 葡萄糖）進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定及回收率實驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Sample determination and recovery test results（n=6）

由表3 可見，加標(biāo)回收率為90.0%～92.5%，結(jié)果良好，符合檢測要求。

3 結(jié)論

本文用沸水浴浸提多糖，再根據(jù)粗多糖不溶于乙醇的特性，在提取液中加乙醇將多糖變成沉淀，然后用純水將沉淀溶解，加入硫酸-蒽酮溶液形成藍綠色化合物比色計算粗多糖，該方法精密度和準(zhǔn)確度均能滿足食品分析要求，檢測結(jié)果可靠。