基于缺血性腦卒中再灌注損傷機制的抗氧化納米藥物研究進展

劉穎，黃冠寧，賀利貞，陳填烽

（暨南大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，暨南大學化學與材料學院，廣東省納米化學創(chuàng)新藥物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510632）

腦卒中是一組因腦血管破裂或阻塞使腦部血液供應產(chǎn)生障礙而引起神經(jīng)功能缺損的臨床綜合征，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中[1-3]。其中，缺血性腦卒中約占腦卒中總數(shù)的80%，好發(fā)于中老年人，具有高死亡率、高致殘率等特點[4]。缺血性腦卒中的損傷機制主要與活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）生成增多、細胞內(nèi)鈣超載、神經(jīng)興奮毒性、神經(jīng)炎癥反應及凋亡自噬信號失衡等有關(guān)[5-6]。

目前，缺血性腦卒中的主要療法是在發(fā)病后的4.5 h 內(nèi)進行靜脈溶栓或6 h 內(nèi)進行介入取栓，以及時恢復血液供應[7]。然而，嚴格且短暫的治療時間窗使得僅有少部分缺血性腦卒中患者能及時接受血管再通治療。另外，如果在治療時間窗外進行溶栓或取栓會增加血腦屏障（blood brain barrier，BBB）破壞和腦出血的風險，導致缺血性腦卒中的致殘率和死亡率增加[8]。此外，恢復血流灌注的過程中誘發(fā)的一系列生化反應會引起缺血-再灌注損傷，加劇神經(jīng)元壞死和凋亡，導致神經(jīng)功能受損[9]。因此，根據(jù)缺血性腦卒中的發(fā)病特點，目前其臨床治療策略主要集中在2 個方面：1）改善供血，包括靜脈溶栓、血管內(nèi)治療、抗血栓治療等，以恢復缺血區(qū)血流、改善腦血循環(huán)[10-11]；2）神經(jīng)保護治療，作為溶栓治療的重要輔助手段之一，使用抗氧化劑、離子通道阻滯劑、炎癥抑制劑等藥物保護神經(jīng)細胞免受缺血性損傷[12-14]。目前，臨床上使用較多的神經(jīng)保護劑依然以小分子抗氧化劑依達拉奉為主。然而，由于依達拉奉半衰期短、生物利用率低等缺點，極大限制了其療效與臨床應用[13]。近年來，許多國產(chǎn)自主研發(fā)藥物被批準用于治療缺血性腦卒中，并在臨床應用中取得良好的療效[15-16]。例如：我國首個在腦血管領(lǐng)域擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的化學藥物丁苯酞；中藥注射劑注射用丹參多酚酸。盡管我國在腦缺血神經(jīng)保護藥物的研發(fā)上取得了長足的進步，但目前缺血性腦卒中的防治依然處于嚴峻狀態(tài)。腦卒中患病率的增加和臨床用藥種類稀缺的矛盾表明，探索高效、低毒、生物利用率高的腦保護劑對缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

近年來，基于抗氧化策略的腦保護劑研究取得了較大的進展。尤其是納米技術(shù)的高速發(fā)展為開發(fā)可克服BBB 限制、延長半衰期、提高生物利用率的創(chuàng)新性藥物帶來了新的機遇。納米材料具有許多傳統(tǒng)材料和小分子藥物所不具備的獨特的理化性質(zhì)，為提高卒中患者的治療效果提供了一種新途徑。本文對腦卒中缺血-再灌注損傷的發(fā)生機制及近年來抗氧化納米藥物治療缺血性腦卒中的研究進展進行綜述，為探究缺血性腦卒中治療新策略提供參考。

1 腦缺血-再灌注的氧化損傷機制

腦組織對缺血缺氧非常敏感，在血流供應障礙后的短時間內(nèi)會發(fā)生嚴重的神經(jīng)功能缺損[17]。缺血半暗帶區(qū)由于殘余小血管能維持其血液灌注，細胞功能雖受損但結(jié)構(gòu)尚完好，若能及時恢復血供，其功能仍可能被挽救，從而減輕腦組織損傷[18]。然而當腦組織缺血時間較長時，神經(jīng)元已經(jīng)受損并開始凋亡，繼續(xù)進行血流再灌注反而會加重病情，即發(fā)生腦缺血-再灌注損傷。另外，長時間的腦血流再灌注后，存活的腦組織中過氧化物堆積，壞死區(qū)域會隨時間延長而擴大，進一步加重腦損傷的程度。腦缺血-再灌注損傷的發(fā)生是一個快速且復雜的級聯(lián)反應過程，主要包括ROS 大量生成、細胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應過度激活等環(huán)節(jié)。其中，ROS 過量產(chǎn)生在腦缺血-再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中占首要地位，ROS 在細胞內(nèi)會引發(fā)一系列破壞細胞結(jié)構(gòu)的鏈式反應，誘導機體發(fā)生氧化應激，進一步加劇鈣超載與炎癥反應。因此，深入了解腦缺血-再灌注氧化損傷的發(fā)生機制，對研制新型抗氧化劑防治腦缺血-再灌注損傷的發(fā)生和控制缺血性腦卒中的病情進展具有重要意義。

自由基（free radical）含有未配對的電子，化學性質(zhì)極不穩(wěn)定，易從鄰近的分子上奪取電子，導致鄰近分子的細胞結(jié)構(gòu)被破壞，引起一系列功能障礙。人體內(nèi)總自由基中95%以上屬于ROS，包括超氧陰離子（superoxide anion，·O2-）、羥基自由基（hydroxyl radical，·OH）和過氧化氫（hydrogen，H2O2）等。正常情況下，適量的ROS 在體內(nèi)作為一種重要的信號分子，參與多種信號通路的調(diào)節(jié)。病理狀態(tài)下，過量產(chǎn)生的ROS 通過刺激細胞因子和黏附分子的表達來促進炎癥和免疫反應，從而嚴重損害組織細胞[19]。人體內(nèi)存在超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、 過 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）以及輔酶Q、維生素E、維生素C 等抗氧化酶與抗氧化小分子，正常情況下它們會及時清除體內(nèi)過量的ROS，以維持ROS 的穩(wěn)態(tài)，限制其對正常細胞的損害[20]。若由于氧化物質(zhì)增多而抗氧化防御降低使體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡導致機體損傷，被稱為“氧化應激”。

缺血-再灌注過程中，大量ROS 蓄積可引起腦組織細胞發(fā)生氧化應激而受損，這是缺血性腦卒中的主要病理機制之一[21-22]。缺血-再灌注引起ROS異常增多的機制主要涉及以下幾個方面[23-25]（見圖1）：1）線粒體功能障礙[26]。缺氧時細胞內(nèi)氧分壓下降，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成減少，細胞膜上的鈉鉀泵功能發(fā)生障礙，胞內(nèi)高Na+引起Na+-Ca2+交換增強，促使Ca2+進入細胞且被線粒體攝取增多，引起鈣超載的同時導致線粒體內(nèi)的錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性下降以及細胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，導致再灌注期間O2大量轉(zhuǎn)化為·O2-、H2O2等ROS。2）黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）形成增多[27]。一方面，細胞內(nèi)Ca2+增多使鈣依賴性蛋白水解酶被激活，黃嘌呤脫氫酶（xanthine-dehydrogenase，XD）大量轉(zhuǎn)變?yōu)閄O；另一方面，二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、次黃嘌呤等ATP 代謝產(chǎn)物堆積，組織恢復氧供時，XO 催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤和尿酸，導致大量的·O2-和H2O2產(chǎn)生。3）中性粒細胞的聚集及激活[28]。缺血區(qū)釋放的ROS 誘導多種趨化因子和促炎因子的表達，吸引大量白細胞聚集并激活。當再灌注時組織重新獲得O2，募集的白細胞耗氧量劇增，發(fā)生氧爆發(fā)，在氧化酶的作用下產(chǎn)生大量氧自由基。4）兒茶酚胺自氧化增加。缺血-再灌注誘導機體發(fā)生應激反應，刺激交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮，產(chǎn)生大量兒茶酚胺，在參與代償調(diào)節(jié)時氧化產(chǎn)生大量的氧自由基。由此可見，血流再灌注在恢復神經(jīng)元供能供氧的同時也會引起線粒體損傷、炎癥反應、氧化應激等復雜的病理進程，導致ROS 等有害物質(zhì)過量產(chǎn)生和積累。

圖1 腦缺血-再灌注中ROS 的誘發(fā)機制Figure 1 Mechanism of ROS production increased in cerebral ischemia-reperfusion

缺血腦區(qū)的ROS 爆發(fā)誘導強烈的氧化作用使腦血管內(nèi)皮細胞和腦組織受到損傷，導致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)被破壞和器官功能衰竭。ROS 蓄積主要通過以下幾種方式引起神經(jīng)元損傷：1）膜脂質(zhì)過氧化。ROS不僅易于奪取細胞膜上的電子，破壞神經(jīng)元膜結(jié)構(gòu)的完整性，而且會與膜上的不飽和脂肪酸作用，使膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，引起細胞膜通透性增強、線粒體膨脹等，導致神經(jīng)元發(fā)生變性和壞死。同時磷脂酶被激活促進膜磷脂分解，催化花生四烯酸代謝反應釋放血栓素A2、白三烯（leukotriene，LT）等活性物質(zhì)，加劇缺血-再灌注損傷。此外，膜磷脂微環(huán)境的改變會導致離子泵功能異常，造成Na+、Ca2+內(nèi)流增加，腦組織能量代謝紊亂。2）蛋白質(zhì)功能受抑制。ROS 能氧化蛋白質(zhì)的巰基形成二硫鍵，導致蛋白質(zhì)活性降低或喪失，使氨基酸殘基氧化，損傷神經(jīng)元蛋白質(zhì)功能，嚴重影響腦組織缺血性損傷的修復。脂質(zhì)過氧化還會抑制膜受體、G 蛋白與效應器的偶聯(lián)等功能，導致神經(jīng)系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導異常。3）核酸破壞及DNA 斷裂。ROS 可導致核酸堿基羥化、DNA 斷裂及染色體畸變，引起神經(jīng)元損傷與凋亡。

綜上所述，ROS 大量蓄積不僅通過鏈式反應引起腦組織細胞的破壞和凋亡，還會導致包括能量代謝在內(nèi)的多種反應過程中斷以及XO、SOD 等酶的表達和活性改變，嚴重影響腦組織損傷的修復。另外，過量的ROS 還可與細胞的膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生反應，導致細胞結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，引起細胞內(nèi)鈣超載。鈣內(nèi)流增加使鈣依賴性蛋白激活，與之相關(guān)的代謝反應過度活化，導致嚴重的能量代謝障礙和ROS 進一步蓄積，形成惡性循環(huán)。同時體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡會導致中性粒細胞炎性浸潤、蛋白酶分泌增加并產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物。氧化應激過程中產(chǎn)生的促炎因子會使血管擴張，促進白細胞游走，誘發(fā)炎癥反應，加重腦組織缺血性損傷。由此可見，抑制氧化應激不僅能夠減少鈣內(nèi)流，還能夠抑制炎癥反應過度激活，是緩解腦缺血-再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雖然體內(nèi)存在抗氧化防御系統(tǒng)，但其不足以應對多種ROS 爆發(fā)帶來的氧化損傷。因此，緩解腦缺血癥狀的同時聯(lián)合使用高效、低毒、安全的抗氧化劑是臨床治療缺血性腦卒中的有效途徑。然而，常規(guī)的抗氧化制劑普遍存在ROS 清除效率低、藥物靶向能力差且細胞毒性大等缺陷，導致其臨床療效并不理想。相比之下，納米藥物在解決常規(guī)藥物催化活性低、半衰期短、生物相容性差等方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，為克服缺血性腦卒中的治療瓶頸提供了一種新途徑。

2 納米抗氧化劑

缺血性腦卒中的治療原則是盡早恢復缺血腦區(qū)的血流灌注。血流再灌注后ROS 爆發(fā)誘導的氧化應激是引起腦組織缺血區(qū)繼發(fā)性損傷的最主要病理機制[29]。因此，設計能夠清除缺血性腦卒中再灌注過程中產(chǎn)生的ROS、減輕神經(jīng)損傷的抗氧化劑是腦卒中治療的主要目標。BBB 作為一種血液、腦組織和腦脊液之間的特殊屏障結(jié)構(gòu)，在保護神經(jīng)元免受神經(jīng)毒性物質(zhì)侵害的同時，也限制了藥物進入腦缺血區(qū)的效率，成為治療缺血性腦卒中需要面臨的挑戰(zhàn)之一[30]?？紤]到腦部功能的重要性，神經(jīng)保護劑的開發(fā)需同時達到高效、安全、可入腦及長效抗氧化等要求。得益于納米技術(shù)的高速發(fā)展為開發(fā)可滿足神經(jīng)保護劑性能要求的創(chuàng)新藥物帶來了新的機遇（見圖2）[20,31-37]。首先，基于納米粒子催化活性與模擬抗氧化酶活性等特點制備的新型模擬酶有望解決內(nèi)源性抗氧化酶活性下降等難題[38-39]；其次，將功能性有機小分子與納米制劑偶聯(lián)，可以顯著提高天然抗氧化劑的給藥效率和抗氧化活性[40]；另外，通過調(diào)控納米顆粒尺寸、形貌、表面電荷以及靶向修飾等方式，可以提高細胞對納米藥物的內(nèi)吞作用，增強納米藥物穿透BBB 的效率[41-42]。因此，整合納米藥物穿透BBB 和高效清除ROS 等優(yōu)勢，將有望突破缺血性腦卒中神經(jīng)保護劑類藥物開發(fā)的瓶頸。

圖2 納米材料在缺血性腦卒中再灌注損傷的抗氧化治療中的應用Figure 2 Application of nanomaterials in the antioxidant treatment of reperfusion-induced injury in ischemic stroke

2.1 納米酶

納米酶是一類蘊含酶學特性的納米材料，能夠在生理或極端條件下催化酶的底物，具有類似于天然酶的酶促反應動力學，可作為酶的替代品[43-44]。目前，金屬氧化物、貴金屬和碳基納米材料是已被報道較多的納米酶材料，它們通過模擬生物體內(nèi)天然酶的活性清除ROS，保護細胞免受氧化損傷，例如：GSH-Px、SOD、CAT、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）等。納米酶作為一種新型模擬酶，能夠用于病毒感染、癌癥、腦卒中、心肌缺血、糖尿病和阿爾茨海默病等多種疾病的治療，且均表現(xiàn)出良好的治療效果[45-46]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，納米酶在缺血性腦卒中的治療中展現(xiàn)出優(yōu)越的應用前景。與天然酶相比，納米酶具有功能多樣性、高穩(wěn)定性、易于制備等優(yōu)點，這賦予納米酶在抗氧化治療中的獨特優(yōu)勢。例如，CeO2納米材料同時存在Ce3+/Ce4+的混合價態(tài)，容易失去氧和得到電子，導致氧空位的形成和價態(tài)的降低，而Ce3+和Ce4+之間的電子轉(zhuǎn)移使其具有較強的抗氧化活性和重復清除ROS 的能力。CeO2納米酶作為腦保護劑，在缺血性腦卒中的治療中能有效減少腦組織的梗死面積。Bao 等[47]通過使用CeO2作為載體，負載抗氧化劑依達拉奉作為缺血性腦卒中的治療藥物，顯著提高了藥物的BBB 穿透力和神經(jīng)元保護效果。然而，單獨的CeO2納米材料的臨床應用受到半衰期短，易發(fā)生聚集以及在活性位點上不易直接發(fā)生催化反應的限制。He 等[31]通過在CeO2納米粒子表面“原位合成”金屬有機框架沸石咪唑框架-8（zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8），從而控制CeO2核的大小和表面電荷，緩慢暴露CeO2活性成分，延長了其血液循環(huán)時間，增強了納米酶的催化和抗氧化活性；該復合納米酶（CeO2@ZIF-8 NPs）能有效抑制大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型小鼠腦組織缺血-再灌注引起的脂質(zhì)過氧化，減少了腦組織神經(jīng)元的氧化損傷和凋亡；氯化三苯基四氮唑（TTC）染色顯示，經(jīng)CeO2@ZIF-8 治療3 天后，MCAO 模型小鼠腦梗死面積呈劑量依賴性明顯減少；通過抑制星形膠質(zhì)細胞激活和促炎因子分泌，緩解了炎癥和免疫反應引起的神經(jīng)元損傷。因此，CeO2@ZIF-8 能同時發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種功效，在缺血性腦卒中神經(jīng)保護治療中實現(xiàn)了令人滿意的預防和治療效果。

雖然CeO2具有較好的生物相容性和較低的毒性，但Ce 作為稀土元素其本身不存在于人體當中，長期的使用可能對人體產(chǎn)生副作用，不利于納米材料臨床轉(zhuǎn)化。治療缺血性腦卒中的納米酶不僅需要有高效穩(wěn)定的抗氧化能力，而且應具有良好的生物相容性[32]。二維過渡金屬碳化物（MXenes）是一類廣泛用于生物醫(yī)學的二維（2D）材料，具有多樣化的結(jié)構(gòu)和獨特的理化性質(zhì)。釩作為人體必需的微量元素之一，因其對經(jīng)典CAT 底物的內(nèi)在催化活性和長期抗生物污染能力，釩基納米材料在納米酶領(lǐng)域也受到廣泛關(guān)注[48]。Hu 等[32]設計合成了二維碳化釩MXene 納米酶（2D V2C MXenzyme），體外抗氧化實驗證明其具有SOD、CAT、GSH-Px、過氧化物酶（peroxidase，POD）等多種天然酶活性，可通過清除不同的ROS（如H2O2、·O2-、·OH）對缺血性腦卒中發(fā)揮神經(jīng)保護作用；在MCAO 模型大鼠中，V2C MXene 能有效降低腦組織的梗死面積，并抑制其腦組織星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞激活，顯著減少神經(jīng)元細胞凋亡比例；該納米酶不僅具有良好的生物相容性，而且在不干擾內(nèi)源性抗氧化狀態(tài)的情況下可重建氧化還原穩(wěn)態(tài)，還可以通過良好的體內(nèi)治療作用緩解ROS 誘導的腦組織損傷；總之，V2C MXene 由于其較強的抗氧化活性以及抗凋亡和抗炎作用顯著緩解了缺血性腦卒中/腦缺血-再灌注損傷引起的腦損傷和神經(jīng)元的功能喪失。這一發(fā)現(xiàn)為利用微量元素為主的納米酶作為治療缺血性腦卒中的納米平臺開辟了一條新的途徑。

此外，腦卒中缺血-再灌注引起大量ROS 累積的過程中，體內(nèi)自身抗氧化酶系統(tǒng)被大量消耗于清除ROS 以緩解氧化應激。例如，由于缺血缺氧導致鈣離子內(nèi)流，鈣離子進入線粒體致使Mn-SOD 大量減少，對ROS 的清除能力降低。因此，缺血性腦卒中的治療策略，應以既能高效清除ROS，又能激活體內(nèi)抗氧化酶的藥物設計為重要方向。Huang 等[20]設計合成了人血清白蛋白修飾Mn3O4納米酶作為ROS清除劑以達到外源性抗氧化的作用，利用該納米酶含有的Mn 元素激活內(nèi)源性Mn-SOD 酶；該納米酶通過清除細胞內(nèi)過量ROS，緩解細胞鈣超載，有效維持了神經(jīng)元的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完整性，抵抗神經(jīng)元氧化損傷，其作用機制主要是通過抑制肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）-Xbox 結(jié)合 蛋白-1（X box-binding protein-1，XBP1s）信號通路活化，阻止神經(jīng)元在糖氧剝奪條件下引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，并通過抑制蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-真核翻譯起始因子2α（eukaryotic initiation factor，Elf2α）-轉(zhuǎn)錄激酶因子4（activating transcription factor4，ATF4）-CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）信號通路以及磷酸化氨基末端蛋白 激 酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，pJNK）-絲裂原活化蛋白激酶p38（mitogen-activated protein kinases p38，p38）-門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspase）信號通路活化，阻止神經(jīng)元自噬與凋亡，最終達到治療缺血性腦卒中的效果。該研究提供了一種具有高效抗氧化納米酶構(gòu)建策略，為探究其在缺血性腦卒中神經(jīng)保護的療效與作用機制提供了重要的科學依據(jù)。

2.2 微環(huán)境響應型靶向納米藥物遞送系統(tǒng)

缺血性腦卒中患者的缺血半暗帶區(qū)的微環(huán)境具有高ROS 水平、呈弱酸性、抗氧化酶活性下降、炎癥因子和特異性腦損傷生物標志物表達增強等特點。納米材料可以利用細胞膜、特異性載體、靶向分子等進行表面改性，以提高藥物的精準給藥效率。近年來，基于微環(huán)境響應型的靶向納米藥物遞送系統(tǒng)可以在不同濃度的ROS、pH 和酶作用下釋放其治療藥物至靶器官，有望為實現(xiàn)更高效的神經(jīng)保護治療提供新途徑。

研究發(fā)現(xiàn)，許多天然化合物如丁苯酞、丹酚酸B、葛根素等在腦缺血-再灌注損傷中表現(xiàn)出了良好的抗氧化活性[49-51]。丹參素酸（salvianic acid A，SA）作為一種備受關(guān)注的抗氧化劑，不僅能逆轉(zhuǎn)氧化應激導致的繼發(fā)性神經(jīng)元損傷，還能發(fā)揮增強細胞的抗氧化防御系統(tǒng)和保護線粒體的功能，具有潛在的神經(jīng)保護作用[52]，但其臨床應用受到易氧化、半衰期短和BBB穿透力低的限制。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）等聚合物納米載體給藥系統(tǒng)與治療藥物偶聯(lián)能控制藥物的釋放，延長藥物半衰期，提高藥物療效[53]。因此，具有微環(huán)境響應性特征的藥物與納米藥物傳遞系統(tǒng)之間的共價相互作用為解決SA 的局限性提供了另一種策略[54]。聚酰胺-胺（polyamidoamine，PAMAM）樹枝狀分子衍生物具有高度可控的分子結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性[55]。研究表明，將BBB 靶向劑[如磷脂-聚乙二醇-整合素靶向環(huán)肽c（RGDyC）/PEG[56]、乳鐵蛋白[57]]與PAMAM 偶聯(lián)，可以改善BBB 的通透性。Li 等[33]設計合成了具有ROS 響應特性的樹枝狀高分子納米顆粒，并將它們與BBB 靶向肽COG1410 和SA 偶聯(lián)，形成可以靶向BBB 的ROS 響應型納米藥物遞送系統(tǒng)PAMAM（T-SA-NPs）。體外抗氧化實驗顯示，T-SA-NPs 明顯降低了神經(jīng)元內(nèi)的ROS 水平，且與SA-NPs 相比，表現(xiàn)出更強的氧化損傷保護能力；體內(nèi)MCAO 小鼠模型實驗也證明了T-SA-NPs靶向梗死區(qū)并延長梗死區(qū)域藥物的半衰期，減少腦梗死面積，恢復小鼠的活動能力；此外，T-SA-NPs處理還可增加人微管相關(guān)蛋白輕鏈3II（microtubuleassociated protein light chain 3II，LC3II）的表達，誘導線粒體自噬，降低氧化應激。該研究為向大腦輸送抗氧化劑和實現(xiàn)缺血性腦卒中的靶向治療提供了一種替代策略。

腦卒中后小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞激活、促炎細胞因子分泌和ROS 產(chǎn)生，通常會介導缺血核心區(qū)神經(jīng)元繼發(fā)免疫/炎癥反應[23]。Yuan 等[34]通過將清除ROS 的化合物（Tempol）和苯基硼酸頻哪醇酯共價結(jié)合在具有強大的抗氧化和抗炎活性的β-環(huán)糊精上，制備了一種能有效穿透BBB 且具有抗氧化和抗炎活性的低聚糖納米材料（TPCD NPs）。體外細胞實驗表明，TPCD NPs 可減少氧-葡萄糖剝奪模型所誘導的氧自由基的過度生成，并增加抗氧化酶的表達，抑制小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應，從而抑制神經(jīng)元凋亡；體內(nèi)治療研究表明，TPCD NPs 可顯著降低MCAO 小鼠的腦梗死面積，并加速神經(jīng)功能恢復；此外，TPCD NPs 可有效聚集在缺血性腦卒中模型的腦缺血損傷部位，并通過具有抗炎作用的多肽Ac2-26 抑制炎癥反應進程。這一具有抗氧化、抗凋亡等多重生理作用且能被炎癥調(diào)控釋放的納米遞藥系統(tǒng)有望發(fā)展為靶向治療缺血性卒中的有效策略。

腦缺血-再灌注損傷的機制研究表明，除了神經(jīng)保護外，及時恢復血流也是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵步驟。如果能針對血栓靶點聯(lián)合使用溶栓劑和腦保護劑，可達到溶栓和神經(jīng)保護雙重效果。靜脈組織纖溶酶原激活劑可以快速溶解血栓，幫助缺血腦區(qū)恢復血供，是目前治療缺血性腦卒中的一線藥物[58]?；谘“迮c凝血酶在血栓形成中的作用，Xu 等[35]開發(fā)了一種凝血酶響應性的血小板仿生納米平臺（tP-NP-rtPA/ZL006e），用于將重組組織纖溶酶原激活劑（rtPA）和神經(jīng)保護劑（ZL006e）特異性遞送至血栓和缺血半暗帶處。該研究顯示，經(jīng)靜脈注射后，tP-NP-rtPA/ZL006e 可以通過血小板膜介導的靶向作用黏附在血栓部位，使血栓周圍上調(diào)的凝血酶觸發(fā)rtPA 釋放，將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，誘導血栓溶解，隨后，tP-NP-rtPA/ZL006e 可以在血流的高剪切力下溶解，原位暴露的細胞穿膜肽TAT（YGRKKRRQRRR）介導“納米血小板”通過BBB 進入缺血大腦，實現(xiàn)了對ZL006e 的位點特異性遞送；體外神經(jīng)保護作用評估發(fā)現(xiàn)，tPNP-rtPA/ZL006e 治療組的細胞存活率明顯提高，且對BBB的毒性可以忽略不計；體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，tPNP-rtPA/ZL006e 顯著降低了缺血腦區(qū)的梗死面積，同時使ROS水平下降了72%。該凝血酶響應型“納米血小板”平臺具有對血栓和BBB 的順序靶向能力，可提高藥物利用率，增強神經(jīng)保護作用和抗氧化活性，減少并發(fā)癥的發(fā)生，提高缺血性腦卒中的治療效果。

2.3 天然活性小分子納米遞送體系

通過分離提純天然產(chǎn)物可獲得大量天然小分子抗氧化劑。這類小分子抗氧化劑均具有較好的抗氧化性能，且與天然酶相比催化效率更高[37]，但由于其BBB 穿透力有限、水溶性較差且半衰期短，對缺血性腦卒中的療效并不理想。此外，腦卒中治療涉及多個互補靶點，單一藥物治療是不充足的[59]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，將天然活性小分子進行納米化以提高生物利用率成為一種有前景的小分子藥物改造策略。

Zhang 等[36]篩選出了樺木酸（betulinic acid，BA）、羽扇豆醇（lupeol，LP）、甘草酸（glycyrrhizinic acid，GA）、熊果酸（ursolic acid，UA）等一系列藥用天然產(chǎn)物小分子化合物，通過自組裝方法合成藥用天然產(chǎn)物小分子化合物納米粒子，發(fā)現(xiàn)均具有良好的水溶性、血液穩(wěn)定性和BBB 穿透力。其中，BA 是治療腦卒中最有效的抗氧化劑之一，但樺木胺納米粒子（BA NPs）在生理pH 下釋放有效載荷的速度緩慢[40]。該研究團隊應用化學合成技術(shù)，將BA 轉(zhuǎn)化為白樺胺（betamine，BAM），發(fā)現(xiàn)由BAM 組成的NPs 在酸性卒中微環(huán)境中可快速釋放藥物[36]。趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）是一種缺血性損傷后在大腦中高度表達的趨化因子受體。在白樺胺納米粒子（BAM NPs）表面修飾CXCR4 的拮抗劑AMD3100（A-BAM NPs），可增強藥物對缺血腦區(qū)的靶向能力。熒光染色定量發(fā)現(xiàn)，A-BAM NPs 在缺血區(qū)域的累積量分別是BA NPs、BAM NPs 和含PEG 的BAM NPs 的3.2倍、2.5 倍和1.7 倍；體內(nèi)動物實驗表明，經(jīng)A-BAM NPs 治療組MCAO 模型小鼠腦梗死面積減少了57.1%，小鼠的存活率明顯提升，神經(jīng)功能缺損得到明顯改善；通過包載神經(jīng)保護肽NA1，A-BAM NPs給藥既可以增強NA1 的療效，又可以使NA1 治療與tPA 輸注兼容（腦梗死面積減少了69.8%）；納米化后的天然小分子抗氧化劑A-BAM NPs 還具有抗病毒、降糖、抗高血脂和抗炎活性等多種功能，無論是作為治療藥物還是作為卒中治療的藥物載體，均有望實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。

姜黃素（curcumin，CUR）是一種天然食品添加劑，具有良好的抗氧化性能，但現(xiàn)階段其臨床應用受到生物半衰期短、化學性質(zhì)不穩(wěn)定以及生物利用度低等限制[60]。層狀稀土氫氧化物（laminated rare hydroxide，LRH）是一類由類水鎂石陽離子層和層間可交換陰離子組成的二維無機層狀材料，LRH 上含有Zn2+和Ce3+。Ma 等[37]研發(fā)了一種由CUR 修飾的鋅鈰稀土氫氧化物（ZnCe-LRH），實現(xiàn)了Ce3+和Ce4+陽離子均勻分布在氫氧化物層中的目標，從而賦予ZnCe-LRH 高效電子轉(zhuǎn)移的能力，與CUR 形成協(xié)同作用，實現(xiàn)了高效ROS 清除效率和多重ROS 捕獲；體外實驗證明了CUR/ZnCe-LRH 同時具有類CAT、類SOD 及清除·OH 的三重活性；體內(nèi)研究證明，CUR/ZnCe-LRH 可以通過清除細胞內(nèi)ROS 和抑制炎癥激活，實現(xiàn)神經(jīng)保護作用；CUR/ZnCe-LRH 治療后腦梗死面積可減少78%，神經(jīng)功能缺損評分從3.50 降至0.67。該策略為缺血-再灌注治療提供了一種新型多功能模擬酶，闡明了神經(jīng)保護對缺血-再灌注損傷的應用機制，為小分子藥物抗氧化劑的開發(fā)與生物應用提供了新的思路。

3 結(jié)語與展望

腦組織梗死后導致血氧耗竭引起的損傷是缺血性腦卒中的主要危象。目前，在合理時間窗內(nèi)開展靜脈溶栓和血管介入治療以恢復血供是治療缺血性腦卒中的首要策略，但與血流再通相伴隨的是缺血-再灌注損傷，可導致患者較高的致死率和致殘率。在缺血性腦卒中的缺血和再灌注過程中，ROS 過量產(chǎn)生、鈣離子超載、炎癥反應激活三者幾乎伴隨著疾病發(fā)生、發(fā)展的全過程，而ROS 過量產(chǎn)生會引發(fā)病理級聯(lián)效應，加重鈣離子超載和炎癥反應激活。因此，通過清除自由基的抗氧化治療策略能夠有效減少缺血性腦卒中的神經(jīng)損傷。然而，傳統(tǒng)的神經(jīng)保護劑由于常存在生物利用率低和無法穿透血腦屏障等缺點，不能滿足臨床治療缺血性腦卒中的需求。納米技術(shù)的出現(xiàn)有效地改善了小分子和生物制劑類抗氧化劑的弊端。通過改造材料的結(jié)構(gòu)可以賦予納米材料更加優(yōu)異的抗氧化性能、藥理作用和生物利用度等，為有效治療病理過程復雜的缺血性腦卒中提供了可能。與常規(guī)制劑相比，納米藥物在血液循環(huán)系統(tǒng)中可以多種方式被細胞吸收利用，且經(jīng)特殊修飾后可提高藥物遞送的靶向性及溶解度，從而顯著提高藥物生物利用率和BBB 穿透率。同時，鑒于納米藥物在體內(nèi)的降解速度可調(diào)控，可以延長藥物的半衰期以提高療效和降低副作用。

目前，針對治療缺血性腦卒中納米藥物的臨床試驗正在廣泛進行中，納米給藥系統(tǒng)在卒中領(lǐng)域的研究也處于接近臨床應用階段。盡管腦靶向納米復合體系逐漸被人們認可，且取得了一系列技術(shù)突破，但生物利用度有限、穿透效率較低、對BBB 造成潛在損傷等問題仍限制納米藥物的進一步推廣[61]。此外，目前僅能夠檢測納米材料具有清除自由基的性能，但是對其性能調(diào)控機制和反應機制仍缺乏系統(tǒng)了解，對如何提高納米材料清除自由基特異性和清除性能并沒有一個系統(tǒng)性的研究策略，僅能通過實驗檢測材料性能的變化，這是未來針對納米抗氧化劑設計開發(fā)必須克服的重要問題。此外，不同種類納米制劑的適應證還需要更深入的研究，而且還存在一定的安全未知性?？偠灾?，抗氧化納米藥物治療缺血性腦卒中研究仍還有巨大的發(fā)展空間。