直接蛋白沉淀-超高效液相色譜法測定氟尿嘧啶血藥濃度

紀(jì)梅芳,盧桂清

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建 廈門 361000)

氟尿嘧啶在臨床上得到廣泛應(yīng)用,屬于抗代謝類化療藥物。氟尿嘧啶治療能夠?qū)颊唧w內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、RNA合成起到抑制作用,因此被廣泛應(yīng)用于消化道腫瘤等疾病的治療中,除此之外,還具有價格低等優(yōu)勢。因此在臨床上被廣泛應(yīng)用[1]。不同患者代謝酶的活性有所不同,從代謝速率方面分析,不同患者的代謝速率不同[2-3]。血藥濃度偏高會導(dǎo)致患者不耐受。因此,需要對患者合理調(diào)節(jié)氟尿嘧啶用藥劑量,提升化療療效。在臨床上,檢測血藥濃度意義顯著。氟尿嘧啶血藥濃度檢測,主要包含液相色譜法、氣相色譜法等[4-5]。上述方法適用范圍有所差異,存在不同的優(yōu)點和缺點。本研究分析直接沉淀蛋白與超高效相色譜法聯(lián)合使用的技術(shù),旨在提升檢測效率,降低檢測成本。通過在臨床患者血藥濃度檢測中應(yīng)用上述檢測方法,觀察臨床應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 資料

選擇氟尿嘧啶化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品,由中國食品藥品檢定研究院提供,批號為100187201203。氯尿嘧啶化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品,是由化學(xué)技術(shù)有限公司提供,標(biāo)準(zhǔn)品批號設(shè)置為LG90J03。選擇高氯酸,此樣品是由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。選擇乙酸,由南京化學(xué)試驗有限公司生產(chǎn)。選擇甲醇,色譜純,由江蘇漢邦科技有限公司生產(chǎn)。乙腈(色譜純,美國Merck公司)。水為蒸餾水。采儀器包含高速離心機,由德國艾本德公司生產(chǎn)。超高效業(yè)相色譜儀由美國公司生產(chǎn),配備PDA檢測器。

1.2 研究方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱:quity HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm):流動相:水-乙腈(95:5),使用微孔濾膜過濾,流速為每分鐘0.2mL,將波長設(shè)置為265納米,柱溫設(shè)置為20℃。5℃作為進樣室溫度,5μL為進樣量。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液和標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

工作人員不僅制備內(nèi)標(biāo)溶液,同時需要制備標(biāo)準(zhǔn)儲備液,稱取5-氟尿嘧啶5g,將上述物品放置在100mL量瓶中,應(yīng)用甲醇進行定容,濃度為1.92μg。將甲醇稀釋到10倍之后,最后得到質(zhì)量濃度為0.192μg/mL的溶液,作為內(nèi)標(biāo)溶液。內(nèi)標(biāo)溶液放置在8℃的冰箱里,保存時間為60天。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液,稱取5-氟尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品0.1g,將其放置在100mL量瓶中,使用水稀釋,稀釋至刻度,作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液,在溫度低于8℃,能夠保存60日,在使用時,逐級稀釋為100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、1μg/mL的工作液。

1.2.3 預(yù)處理樣品

對樣品進行處理:300μL血清樣品,將其放置在10mL尖底離心管中,使用100μL平底進樣針,將其放置在50μL內(nèi)標(biāo)溶液中,將離心管中液體混勻。準(zhǔn)確加入到濃度為6%高氯酸溶液,為200μL為高氯酸溶液,將上述溶液作為蛋白沉淀劑,進行混勻處理,處理時間為5分鐘。在樣品充分混勻之后,將樣品實施低速離心,離心速度為每分鐘4000轉(zhuǎn),有利于沉淀相與上清液分離。進樣時,通過每分鐘1000轉(zhuǎn),實施離心后,供試劑為100μL。

1.2.4 色譜分離情況

色譜分離情況,空白血清色譜圖,觀察5-氟尿嘧啶出峰時間、5-氯尿嘧啶的出峰時間,未觀察到顯著雜質(zhì)干擾,峰形分離良好,氟尿嘧啶保留時間為1.8分鐘,設(shè)置氯尿嘧啶保留時間2.85分鐘。見圖1。

1.2.5 血清處理

選擇6份建卡空體檢者的血清,在處理后,6份血清樣本氟尿嘧啶與氯尿嘧啶的保留時間均處于無干擾狀態(tài),說明本法具有良好專屬性。

1.2.6 氟尿嘧啶的檢測

配制0.5、10、30μg/mL,質(zhì)量濃度的氟尿嘧啶血清樣本為5份,合理處理,計算出血藥濃度,回收率需要合理計算。精密度在考察階段,將配置好的相同濃度樣品,24小時,5次連續(xù)進樣,內(nèi)精密度合理計算。每日計算一次,連續(xù)計算5天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)測定精準(zhǔn)度與精密度符合要求。

1.2.7 檢測限

檢測限是指檢測信號為噪聲信號的3倍時,對應(yīng)的血樣濃度,此種方式檢測限為0.1μg/mL。

1.2.8 血藥濃度檢測

本次研究所用方法,檢測靜脈滴注氟尿嘧啶的血藥濃度。臨床研究顯示,胃癌患者血藥濃度需要控制在25.6～37.4μg/mL時,不良反應(yīng)發(fā)生概率較小,同時具有良好效果,但是氟尿嘧啶的血藥濃度大于3μg/mL時,患者出現(xiàn)不良反應(yīng)發(fā)生率較大。

2 結(jié)果

在本次研究中,有1例患者的血藥峰濃度較低,1例患者血藥谷濃度大于常規(guī)標(biāo)準(zhǔn),患者出現(xiàn)嚴(yán)重黏膜損害,發(fā)生骨髓抑制反應(yīng)。通過與醫(yī)護人員進行溝通,調(diào)整治療方案,患者化療后產(chǎn)生的不良反應(yīng)降低。

3 討論

高效液相色譜法,可以稱為高分離度液相色譜、高壓液相色譜法等。高效液相色譜方法較為重要,流動相為液體形式。通過應(yīng)用高壓輸液系統(tǒng),將級性不同的單一溶劑、混合溶劑不同,緩沖液等流動相泵入裝有固定項的色譜柱。采用分離方式,需要進行處理,使用檢測器處理,能夠?qū)崿F(xiàn)分析試樣[6-7]。此種方式可以應(yīng)用在法學(xué)、分離化學(xué)、工業(yè)、商檢以及醫(yī)學(xué)等重要領(lǐng)域中。

高效液相色譜,能夠反復(fù)使用色譜柱,不容易將樣品破壞,具有回收等優(yōu)勢。但同時也存在一定缺點,和氣相色譜比較,能夠取長補短。高效液相色譜具有缺點,包含外效應(yīng)。從進樣開始直到檢測器結(jié)束,除了柱子以外的任何死空間,包含進樣器以及檢測池、聯(lián)合連接管等,一旦流動相的流型出現(xiàn)改變。有分離物質(zhì)被滯留或者出現(xiàn)擴散現(xiàn)象,都會造成色譜峰加寬,減弱柱效率[8-9]。

血液樣本成分較為復(fù)雜,采用復(fù)雜預(yù)處理方式,通過濃縮和富集等方式,將干擾物質(zhì)除去,才能夠?qū)嵤︰PLC分析。直接蛋白沉淀法有效,檢測速度快。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑有硫酸銨溶液、乙酸乙酯等。通過采用預(yù)實驗方式,最后選擇濃度為6%的高氯酸溶液,可以將內(nèi)源干擾物去除,同時不會影響氟尿嘧啶和內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性。T3柱屬于一種耐受100%水相,長時間沖刷的特殊性色譜柱,水溶性藥物分離效果良好。本次研究采用T3柱,柱效與分離度符合測定要求。

液相色譜方式在初期階段,只用大直徑的玻璃管做柱,在常壓下或者在室溫下,使用液位差,輸送流動性,將其稱之為經(jīng)典液相色譜法。此種方式具有較低柱效,同時時間較長,在幾個小時。高效液相色譜法在60年代后期被引入,逐漸被發(fā)展起來。此種方式與經(jīng)典的液相色譜法相比較,主要區(qū)別為填料顆粒小,同時具有均勻特點,小顆粒具有高速效特點,具有高阻力特點,應(yīng)用高壓輸送流動相,因此將其稱為高壓液相色譜法。由于分析速度快,因此將其稱為高速液相色譜法,也可以稱之為現(xiàn)代液相色譜。

在制定色譜柱的填料和流動相的組分過程中,需要根據(jù)各品種相進行設(shè)定。常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。比較常見為十八烷基硅烷鍵合硅膠,其次為辛基鍵合硅膠,氨基鍵和氰基逐漸在臨床被應(yīng)用;離子交換色譜期間,通常使用離子交換填料等,注樣量為微升。還有其他規(guī)定,室溫為柱溫,紫外吸收檢測器可以作為檢測器。對于規(guī)定的條件,除固定相種類之外,不能改變檢測器類型,載體粒度、色譜柱內(nèi)徑、固定相牌號、混合流動相各組分比例、檢測器靈敏度等均可以進行改變,需要適當(dāng)符合系統(tǒng)的要求。一般色譜圖大約在20分鐘,能夠完成記錄。

在對儀器進行適應(yīng)性實驗過程中,需要根據(jù)系統(tǒng)適應(yīng)性實驗,按照各品種項下要求作為標(biāo)準(zhǔn)。通過不斷實驗和調(diào)整儀器,讓所用樣品達到規(guī)定要求?；蛘咭?guī)定分析狀態(tài)下,制定最小的色譜柱理論板數(shù)。如果在樣品中,包含可離子化的化合物,或者包含離子型化合物,則可以采用離子交換色譜方式,但是由于液液分配色譜,或者空間排阻,也能夠順利的應(yīng)用離子化合物。在實施分離異構(gòu)體期間,可以采用液固色譜法;官能團的化合物存在差異,也可以采用液液分配色譜法;對于高分子聚合物,實施空間排阻色譜方法。HPLC出現(xiàn)時間較短,但是發(fā)展速度較快,目前應(yīng)用也十分廣泛,流程與儀器機構(gòu)具有多樣性特點[10-11]。通過用厚壁玻璃管進行制作,樣品出現(xiàn)腐蝕,要求耐高壓,可以采用銅管等[12]。

為患者實施血樣定量檢測期間,需要與樣本一起做標(biāo)準(zhǔn)曲線,能夠減少定量誤差。隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得方法良好,采用超高效液相色譜技術(shù),是新的技術(shù)之一,通過對小顆粒固定相進行應(yīng)用,降低系統(tǒng)體積。本次研究采用直接蛋白沉淀-超高效液相色譜連用技術(shù),用于測定氟尿嘧啶,在5分鐘之內(nèi),能夠分析整個進樣,臨床檢測需求得以滿足。臨床血樣檢測,以及后期干預(yù)實踐,此種方法臨床應(yīng)用前景更好。部分學(xué)者分析,氟尿嘧啶長時間輸注期間,可以將血藥濃度穩(wěn)定,代替血藥濃度曲線下面積。氟尿嘧啶靜脈滴注給藥期間,2小時左右,血藥濃度得以穩(wěn)定,在22小時之后,血藥濃度具有較小差異。因此選擇氟尿嘧啶持續(xù)靜脈滴注22小時差異性較小。結(jié)果顯示,患者間氟尿嘧啶血藥濃度具有較大差異性,主要與以下因素相關(guān),包含藥物代謝酶的基因存在差異,食物與藥物之間發(fā)生作用,與身體狀況有一定關(guān)聯(lián)。部分研究分析,直接檢測細(xì)胞DPD的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟尿嘧啶的血漿水平相關(guān)性較弱,但是會浪費更多時間,因此在為患者化療之前,需要測定藥物濃度,可以作為間接指標(biāo),幫助患者判斷活性缺陷,預(yù)測毒性。在本次研究中,其中1例患者血藥峰濃度低于20μg/mL,另外1例患者血藥濃度>3μg,患者出現(xiàn)嚴(yán)重黏膜損害,甚至發(fā)生骨髓抑制反應(yīng)。通過與醫(yī)護人員進行溝通,調(diào)整治療方案,患者化療后產(chǎn)生的不良反應(yīng)降低。